摘要：目的 建立UPLC-MS/MS法測(cè)定頭孢哌酮鈉及其制劑中遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺（NDMA）與N-亞硝基二乙胺（NDEA）的含量。方法 采用GL Sciences InertsilTM ODS-3（100 mm×3.0 mm， 3 μm）色譜柱，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫為35 ℃；檢測(cè)方式為正離子（ESI+）模式下選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）。結(jié)果 NDMA在0.5416～270.8 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）分別為0.008與0.01 ppb，加標(biāo)回收率為99.3%～107.0%；NDEA在0.1463～73.14 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）分別為0.001與0.002 ppb，加標(biāo)回收率為90.0%～96.0%。對(duì)7批次原料、66批次制劑與影響因素試驗(yàn)下放置的制劑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3批原料與30批制劑中檢出NDMA，所有樣品均未檢出NDEA；影響因素試驗(yàn)下的制劑NDMA與NDEA均未增加。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于頭孢哌酮鈉及其制劑中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA與NDEA的測(cè)定，并建議企業(yè)對(duì)頭孢哌酮鈉原料生產(chǎn)工藝進(jìn)行評(píng)估并嚴(yán)格控制。

關(guān)鍵詞：頭孢哌酮鈉；注射用頭孢哌酮鈉；N-亞硝基二甲胺（NDMA）；N-亞硝基二乙胺（NDEA）；UPLC-MS/MS；遺傳毒性雜質(zhì)

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Determination of genotoxic impurities N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylaminein in cefoperazone sodium and its preparations

by UPLC-MS/MS

Li Qian， Yang Bohan， Li Jie， Li Yitian， Wang Liping， and Liu Ying

（Henan Provincial Institute for Drug and Medical Device Control HenanVaccineIssuance Center， Henan Chemical Quality Evaluation

and Control Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective This study established an UPLC-MS/MS method for determination of genotoxic imputrity N-nitrosodimethylamine （NDMA） and N-nitrosodiethylamine （NDEA） in cefoperazone sodium and its preparations. Methods The analytes were separated on a GL Sciences InertsilTM ODS-3 （100 mm×3.0 mm， 3 μm） column. 0.1% formic acid was used as mobile phase A， methanol containing 0.1% formic acid was used as mobile phase B， and the gradient elution method was used. The flow was set at 0.3 mL/min， with a column temperature of 35 ℃. The target compound was analyzed in the positive ion SIM mode. Results The linear range of NDMA was in the range of 0.5416～270.8 ng/mL， the limit of detection （LOD） and the limit of quantitation （LOQ） were 0.008 and 0.01 ppb， and the recoveries were 99.3%-107.0%. The linear range of NDEA was in the range of 0.1463～73.14 ng/mL， the limit of detection （LOD） and the limit of quantitation （LOQ） were 0.001 ppb and 0.002 ppb and the recoveries were 90.0%-96.0%. The method was used to determine NDMA an NDEA in 7 batches of raw material， 66 batches of preparations， and influencing factors test samples. NDMA was detected in 3 batches of raw material and 30 batches of preparations. No NDEA was detected in all samples. NDMA and NDEA did not increase under the influence factor test. Conclusion This method was accurate， specific， and sensitive. It could be used for analysis of the NDMA and NDEA in cefoperazone sodium and its preparations. Enterprises should pay attention to the quality control of APIs.

Key words Cefoperazone sodium; Cefoperazone sodium for injection; N-nitrosodimethylamine （NDMA）; N-nitrosodiethylamine （NDEA）; UPLC-MS/MS; Genotoxic impurity

遺傳毒性雜質(zhì)又稱基因毒性雜質(zhì)，能與體內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞DNA，包括DNA烷基化、染色體斷裂、DNA重組及復(fù)制過(guò)程中共價(jià)鍵的插入和修飾等，導(dǎo)致基因突變，并有可能誘發(fā)腫瘤和癌癥[1-2]。

N-亞硝胺類雜質(zhì)是具有強(qiáng)致突變性和致癌性的遺傳毒性雜質(zhì)[3-4]，屬于ICH M7（R1）《評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》指南中提及的“關(guān)注列隊(duì)”物質(zhì)[5]，痕量水平即可誘發(fā)基因突變、染色體異常和DNA修復(fù)障礙，長(zhǎng)期接觸可能會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)不同臟器腫瘤的產(chǎn)生[6-8]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）、歐洲藥物管理局（EMA）與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）均發(fā)布了人用藥中N-亞硝胺雜質(zhì)控制的指導(dǎo)意見(jiàn)[9-11]，分析該類雜質(zhì)產(chǎn)生的原因主要有3點(diǎn)：①由生產(chǎn)工藝引入，如使用了能引入仲胺和亞硝化試劑的物料、試劑、催化劑及中間體等；②由污染引入，如生產(chǎn)過(guò)程中使用了被亞硝胺類雜質(zhì)污染的物料；③由降解產(chǎn)生，如藥物本身會(huì)降解亞硝胺類雜質(zhì)。

頭孢哌酮鈉以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、1-甲基-5-巰基-四氮唑與氧哌嗪酸為起始物料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到，合成過(guò)程中使用了N，N-二甲基乙酰胺、三乙胺等試劑[12]。文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]1-甲基-5-巰基-四氮唑合成過(guò)程中通常會(huì)使用亞硝酸鈉用于淬滅殘留的疊氮化物，且疊氮試劑的合成通常涉及亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽與一甲胺或二甲胺反應(yīng)可生成NDMA，與N，N-二甲基乙酰胺或三乙胺反應(yīng)可生成NDEA，因此頭孢哌酮鈉的生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)生NDMA與NDEA雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的致癌物清單，NDMA與NDEA均為2A類致癌物，為保證該藥品的安全性，有必要對(duì)頭孢哌酮鈉原料及其制劑中NDMA與NDEA進(jìn)行分析與控制。

注射用頭孢哌酮鈉為頭孢哌酮鈉原料藥無(wú)菌分裝，未添加任何輔料。參考《中國(guó)藥典》2020年版四部9306遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則[15]，對(duì)于高致癌性雜質(zhì)（如黃曲霉毒素、N-亞硝基化合物、烷基-氧化偶氮結(jié)構(gòu)類化合物）應(yīng)采用更嚴(yán)格的限值控制。雜質(zhì)的限值為雜質(zhì)可接受攝入量與藥物每日最大用量的比值。同時(shí)，F(xiàn)DA發(fā)布的《人用藥中亞硝胺雜質(zhì)的控制指南》[11]與USP通則lt;1469gt;亞硝胺雜質(zhì)中的規(guī)定[16]，NDMA雜質(zhì)的每日可接受攝入量為96 ng，NDEA雜質(zhì)的每日可接受攝入量為26.5 ng。根據(jù)注射用頭孢哌酮鈉每日最大服用劑量為9 g，計(jì)算頭孢哌酮鈉及其制劑注射用頭孢哌酮鈉中NDMA與NDEA的限度均分別為10.6與2.9 ppb。

由于該品種中NDMA與NDEA限度非常低，對(duì)測(cè)定方法的專屬性與靈敏度要求較高，采用常規(guī)的高效液相色譜法紫外檢測(cè)器難以實(shí)現(xiàn)，因此建立了靈敏度高專屬性好的超高效液相色譜離子肼高分辨質(zhì)譜聯(lián)用分析頭孢哌酮鈉及其制劑中的NDMA與NDEA雜質(zhì)方法，為該類藥物的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Thermo Scientific Q Exactive Plus超高效液相色譜-四級(jí)桿-離子肼高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo公司）；XPE205電子天平（美國(guó)Mettler公司）；超純水由Millipore純水儀制備。

頭孢哌酮對(duì)照品（批號(hào)130420-201105，含量93.8%），N-亞硝基二甲胺（批號(hào)510166-202003，含量99.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；N-亞硝基二乙胺（批號(hào)F0032407，含量99.7%）購(gòu)自北京Mahage生物技術(shù)公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸（批號(hào)SHBL0331）購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)譜級(jí)甲醇（批號(hào)11243235239）購(gòu)自Merck公司。

2023年國(guó)家藥品抽檢樣品注射用頭孢哌酮鈉66批次，涉及5家生產(chǎn)企業(yè)（分別為4家國(guó)內(nèi)企業(yè)C、D、E、F與1家進(jìn)口企業(yè)G）；調(diào)研收集7批次頭孢哌酮鈉原料，涉及3家生產(chǎn)企業(yè)（分別為A、B、C企業(yè)）。影響因素試驗(yàn)樣品為取不同企業(yè)的注射用頭孢哌酮鈉各1批，分別在高溫（60 ℃）下放置30 d，在高濕（相對(duì)濕度92.5%）與強(qiáng)光照射（4500 Lx）下放置10 d。

2 方法

2.1 測(cè)定條件

色譜條件：采用GL Sciences InertsilTM ODS-3 （100 mm×3.0 mm， 3 μm）色譜柱，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，照表1進(jìn)行洗脫。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI源），正離子模式檢測(cè)，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350 ℃，輔助氣溫度350 ℃，輔助氣流量10 mL/min，鞘氣流量40 mL/min，掃描模式為選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM），質(zhì)譜采集時(shí)間為3.0～6.0 min與13.0～16.0 min。目標(biāo)離子精確質(zhì)量數(shù)m/z[H]+：75.05538（NDMA）與103.08674（NDEA）。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

取本品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含0.25 g的溶液。

2.2.2 對(duì)照品貯備液

分別取NDMA與NDEA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含NDMA 2.7 mg與含NDEA 0.75 mg的混合溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液

精密量取對(duì)照品貯備液適量，加水制成每1 mL中約含NDMA 2.7 ng與NDEA 0.75 ng的混合溶液。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察

以水、甲醇作為空白溶劑，精密量取空白溶劑進(jìn)樣，結(jié)果空白溶劑均不干擾頭孢哌酮鈉及其制劑中NDMA與NDEA的測(cè)定。

3.2 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液，用水稀釋成含NDMA質(zhì)量濃度分別為270.8、135.4、54.16、27.08、13.54、5.416、2.708、1.354與0.5416 ng/mL的溶液，作為NDMA線性溶液；含NDEA質(zhì)量濃度分別為73.14、36.57、14.63、7.314、3.657、1.463、0.7314、0.3657與0.1463 ng/mL的溶液，作為NDEA線性溶液。分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積A為縱坐標(biāo)，NDMA或NDEA的進(jìn)樣濃度C（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得NDMA與NDEA的回歸方程：

NDMA：A=1.0101×106C+1.5472×105，r=1.0000

NDEA：A=7.6054×105C-5.7645×104，r=1.0000

NDMA質(zhì)量濃度在0.5416～270.8 ng/mL范圍內(nèi)，NDEA質(zhì)量濃度在0.1463～73.14 ng/mL濃度范圍內(nèi)，與其峰面積線性關(guān)系均良好。

3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果NDMA峰面積的RSD為1.6%，NDEA峰面積的RSD為1.7%，表明進(jìn)樣精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備注射用頭孢哌酮鈉供試品溶液共6份（批號(hào)220802101），以“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液為外標(biāo)計(jì)算。結(jié)果供試品中NDMA含量平均值為1.8 ppb，RSD為7.4%；6份樣品中均未檢出NDEA。

3. 5 定量限與檢測(cè)限

逐級(jí)稀釋“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，以信噪比S/N為10：1計(jì)，NDMA的定量限為0.01 ppb，NDEA的定量限為0.002 ppb。以信噪比S/N為3：1計(jì)，NDMA的檢測(cè)限為0.008 ppb，NDEA的檢測(cè)限為0.001 ppb。

3. 6 回收率試驗(yàn)

取注射用頭孢哌酮鈉適量（共9份），精密稱定，分別加入適量的“3.2”項(xiàng)下NDMA與NDEA質(zhì)量濃度分別為5.461與1.463 ng/mL的線性溶液，配制成高、中、低濃度的溶液，各濃度平行配制3份，以“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液為外標(biāo)計(jì)算，結(jié)果NDMA與NDEA的平均回收率分別為103.1%與92.9%，見(jiàn)表2。

3.7 穩(wěn)定性

取注射用頭孢哌酮鈉適量，精密稱定，加入“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液溶解并稀釋成含NDMA與NDEA質(zhì)量濃度分別為2.7與 0.75 ng/mL的溶液，即得加標(biāo)供試品溶液。室溫放置，于第0～14 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖，以NDMA與NDEA峰面積為指標(biāo)，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果加標(biāo)供試品溶液中NDMA與NDEA峰面積的RSD均為1.6%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3.8 樣品測(cè)定

3.8.1 " "原料與制劑

取7批次原料與66批次制劑，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液為外標(biāo)計(jì)算各樣品中NDMA與NDEA的含量。結(jié)果見(jiàn)表3與圖1，7批次原料中有3批次檢出了NDMA，均來(lái)自C企業(yè)，結(jié)果為1.8～4.1 ppb，檢出率為42.9%；66批次制劑中有30批次檢出了NDMA，結(jié)果為1.2～4.4 ppb，檢出率為45.5%；其中檢出NDMA的制劑其原料均來(lái)源于C企業(yè)；檢出的NDMA含量均低于限度。所有樣品中均未檢出NDEA。

3.8.2 影響因素試驗(yàn)

樣品取高溫、高濕及強(qiáng)光照射條件下的制劑，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液為外標(biāo)計(jì)算各樣品中NDMA與NDEA的含量。結(jié)果各樣品中NDMA與NDEA含量與0 d比基本無(wú)變化。

3.9 耐用性

由于供試品濃度較大為0.25 g/mL，其雜質(zhì)峰也較大，色譜條件的變化如流動(dòng)相比例、柱溫（±5 ℃）的改變，可導(dǎo)致雜質(zhì)峰干擾NDMA或NDEA的檢測(cè)。雖然該方法可以通過(guò)SIM模式提取出目標(biāo)離子峰進(jìn)行測(cè)定，但雜質(zhì)峰可進(jìn)入質(zhì)譜儀中易污染儀器，因此僅對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行耐用性考察。改變噴霧電壓、離子傳輸管溫度與輔助氣溫度，對(duì)照品溶液中NDMA與NDEA峰面積響應(yīng)基本無(wú)變化。

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)的難點(diǎn)在于梯度洗脫程序的優(yōu)化。由于供試品溶液的濃度較大，頭孢哌酮主峰與其雜質(zhì)峰也較大，易干擾樣品中NDMA與NDEA的檢測(cè)。優(yōu)化流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例，使頭孢哌酮主峰的保留時(shí)間在NDMA與NDEA之后，不進(jìn)入質(zhì)譜避免污染儀器，并使頭孢哌酮的雜質(zhì)峰不干擾NDMA與NDEA的檢測(cè)。供試品濃度方面，當(dāng)供試品濃度增加為0.5 g/mL時(shí)，供試品中的雜質(zhì)峰增大且峰展寬，干擾樣品中NDMA的測(cè)定；降低供試品濃度，則降低了NDMA與NDEA的檢測(cè)濃度。綜合考慮，選擇供試品的濃度為0.25 g/mL。

4.2 樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)3家企業(yè)的7批次頭孢哌酮鈉原料與5家企業(yè)的66批次注射用頭孢哌酮鈉進(jìn)行NDMA與NDEA的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有3批次原料與30批次制劑中檢出NDMA，所有檢出NDMA樣品的原料均來(lái)源于原料企業(yè)C。注射用頭孢哌酮鈉為頭孢哌酮鈉原料無(wú)菌分裝得到，未添加任何輔料。結(jié)合影響因素試驗(yàn)，樣品在高溫、高濕與強(qiáng)光照射條件下放置后NDMA與NDEA的含量均未增加，表明該樣品在影響因素條件下不降解產(chǎn)生NDMA與NDEA。因此分析頭孢哌酮鈉及其制劑在貯藏過(guò)程中不產(chǎn)生NDMA，NDMA來(lái)源于頭孢哌酮鈉原料的生產(chǎn)過(guò)程。

4.3 NDMA與NDEA的來(lái)源分析

通過(guò)考察頭孢哌酮鈉原料、制劑與影響因素試驗(yàn)樣品，發(fā)現(xiàn)NDMA來(lái)源于頭孢哌酮鈉原料的生產(chǎn)過(guò)程。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，3家原料的生產(chǎn)工藝基本一致，均以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、1-甲基-5-巰基-四氮唑及氧哌嗪酸為起始物料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到頭孢哌酮，再通過(guò)碳酸氫鈉成鹽得到頭孢哌酮鈉。其中起始物料1-甲基-5-巰基-四氮唑合成過(guò)程中使用了異硫氰酸甲酯與疊氮化鈉，異硫氰酸甲酯中殘留的工藝雜質(zhì)一甲胺與疊氮化鈉中殘留的亞硝酸鹽反應(yīng)，可產(chǎn)生NDMA。由起始物料中引入的NDMA在后續(xù)合成過(guò)程中如不被清除，可傳遞到頭孢哌酮鈉原料成品中，進(jìn)而傳遞到制劑中。此外，疊氮化鈉中殘留的亞硝酸鈉與頭孢哌酮鈉生產(chǎn)工藝中使用的試劑N，N-二甲基乙酰胺或三乙胺反應(yīng)，還可產(chǎn)生NDEA。

因此，原料企業(yè)C需對(duì)頭孢哌酮鈉的起始物料進(jìn)行嚴(yán)格篩選與控制，并在后續(xù)合成工藝中增加清除NDMA的工藝，以保證產(chǎn)品的安全性。同時(shí)需嚴(yán)格控制起始物料中亞硝酸鹽的含量，防止其在頭孢哌酮鈉的后續(xù)合成過(guò)程中產(chǎn)生NDEA雜質(zhì)，確保樣品的安全性。

參 考 文 獻(xiàn)

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