摘 要：為了提高化妝品中銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)?zāi)芰Γ鰪?qiáng)實(shí)驗(yàn)室間競(jìng)爭(zhēng)能力，本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)兩年參加中檢院NIFDC-PT中銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證。按照作業(yè)指導(dǎo)書及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）的要求進(jìn)行前期增菌及生化實(shí)驗(yàn)，采用Microfiex LT/SH Smart微生物質(zhì)譜鑒定儀及VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)分離出的可疑菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，兩次能力驗(yàn)證結(jié)果均檢出目標(biāo)菌，與中檢院指定值一致，結(jié)果滿意。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果進(jìn)行分析討論，探討提高檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的方法。

關(guān)鍵詞：化妝品，能力驗(yàn)證，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，微生物質(zhì)譜儀，全自動(dòng)微生物鑒定儀（VITEK2）

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.015.040

0 引 言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種革蘭氏陰性桿菌，好氧，呈長(zhǎng)棒形的細(xì)菌，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種革蘭氏陽性球菌，成葡萄狀排列，無芽孢莢膜，可耐干燥和低溫，該菌是葡萄球菌中致病力最強(qiáng)的這一種[2]。銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均會(huì)引起皮膚化膿感染，皮膚有外傷及眼疾的患者若感染銅綠和金葡這兩種菌常會(huì)引起化膿性疾病，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)敗血癥[3]。當(dāng)皮膚有創(chuàng)傷時(shí)使用被污染的化妝品感染的幾率則會(huì)大大增加，因此檢驗(yàn)化妝品中是否含有銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有重要的意義。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中規(guī)定：每g或每mL中均不得檢出這兩種菌[4]。本所實(shí)驗(yàn)室連續(xù)兩年參加由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的NIFDCPT- 4 0 2化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證和NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證，均取得滿意的結(jié)果。本文通過對(duì)兩次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的過程及結(jié)果進(jìn)行分析與研究，探討可以提高檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的方法和可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，并對(duì)此提出改正措施，為完成相關(guān)檢驗(yàn)工作提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供能力驗(yàn)證樣品。

銅綠假單胞菌：編號(hào)：T C 0 4 0 2 0 1 7 3 、TC04020050。

金黃色葡萄球菌：編號(hào)：T C 0 4 5 1 0 1 2 6 、TC04510478。

樣品為白色球狀物，真空放置于含有粉底膏的西林瓶中，規(guī)格為1 g/瓶。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

SCDLP（北京陸橋，批號(hào)：220602；廣東環(huán)凱，批號(hào)：1102291）；十六烷三甲基溴化銨瓊脂（青島海博，批號(hào)：2 0 210 714）；乙酰胺（廣東環(huán)凱，批號(hào)：1087081）；綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基（青島海博，批號(hào)：20220128）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱，批號(hào)：10 932 41）；硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基（青島海博，批號(hào)：20211105）；明膠培養(yǎng)基（青島海博，批號(hào)：20220519）；Baird-Parker培養(yǎng)基（北京陸橋，批號(hào)：230307）；血平板（北京陸橋，批號(hào)：230317）；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基（北京陸橋，批號(hào)：220418）；BHI腦心浸出液肉湯（青島海博，批號(hào)：20210819）；金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基（北京陸橋，批號(hào)：220819）；革蘭氏染色液（常德比克曼，批號(hào)：2021/10/18；青島海博，批號(hào)：20221203）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，均購置于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 儀器與設(shè)備

IC612CW恒溫培養(yǎng)箱（雅馬拓）；BKQ-B10011壓力蒸汽滅菌器（山東博科）；101-3-BS鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)）；CX21生物顯微鏡（奧林巴斯）；BSC-1300IIA2生物安全柜（蘇州安泰）；VITEK 2COMPACT（法國(guó)梅里埃）；Microfiex LT/SH Smart微生物質(zhì)譜鑒定儀（布魯克）。

1.5 方法

依據(jù)NIFDC-PT-402化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)和NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書以及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）的規(guī)定進(jìn)行增菌、分離和鑒定。同時(shí)采用全自動(dòng)微生物鑒定儀生化鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 COMPACT）和微生物質(zhì)譜鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，最終綜合以上結(jié)果出具報(bào)告。

1.5.1 樣品的前處理

（1）西林瓶的開啟：由于西林瓶處于高度真空狀態(tài)，開啟時(shí)應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。

（2）樣品的稀釋及培養(yǎng)：無菌操作向每個(gè)西林瓶樣品中加入6 mL SCDLP，將樣品充分振蕩混勻，轉(zhuǎn)移到滅菌的試管中，然后再用SCDLP分4次潤(rùn)洗西林瓶，每次1 mL，最終試管中的SCDLP體積為10 mL。以同樣的方式分別處理其他樣品，將所得增菌液放置36℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24 h。同時(shí)取銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌冷凍甘油管接種于SCDLP中于36℃培養(yǎng)24 h作為陽性對(duì)照，取10mLSCDLP液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

1.5.2 鑒定

（1）銅綠假單胞菌

1）分離、純化從上述培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，分別劃線接種于十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基和乙酰胺培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2）染色鏡檢分別從上述平板中挑取典型菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

3）氧化酶試驗(yàn)取一小塊潔凈的白色濾紙上置于滅菌的平皿中，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙上，然后再滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，30 s內(nèi)觀察結(jié)果。

4）綠膿菌素試驗(yàn)挑取分離平板上培養(yǎng)出的可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基于36℃培養(yǎng)24 h，加入氯仿5 mL充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液中，用吸管將氯仿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中并加入1mol/L的鹽酸1 mL，振蕩，靜置片刻，觀察結(jié)果。

5）硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中于36℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

6）明膠液化試驗(yàn)取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基中于36℃培養(yǎng)24 h，取出置于4℃冰箱中30 min之內(nèi)觀察結(jié)果。

7）42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上于42℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

（2）金黃色葡萄球菌

1）分離、純化從上述培養(yǎng)液中取一環(huán)劃線接種于Bp平板和血平板于36℃培養(yǎng)48 h和24 h，觀察結(jié)果。

2）染色鏡檢分別從上述平板中挑取典型菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

3）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)液面上加入高度為2 mm的滅菌液體石蠟于36℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

4）血漿凝固酶試驗(yàn)將純培養(yǎng)菌落接種于BHI肉湯中36℃培養(yǎng)24 h，取新鮮的肉湯培養(yǎng)物加入血漿中于36℃恒溫箱中，每半個(gè)小時(shí)觀察一次，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌

根據(jù)表1銅綠假單胞菌生化鑒定結(jié)果分析，TC04020173和TC04020050兩個(gè)樣品均符合銅綠假單胞菌陽性特征，結(jié)果可判斷均檢出銅綠假單胞菌。

為了進(jìn)一步進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，對(duì)典型菌落采用微生物質(zhì)譜的方式進(jìn)行確認(rèn)，兩個(gè)編號(hào)分別選取了三個(gè)可疑菌落，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜儀對(duì)可疑菌鑒定結(jié)果均大于2.00，確信度均趨于最佳，利用微生物質(zhì)譜儀進(jìn)一步確定兩個(gè)樣品中均含有銅綠假單胞菌，結(jié)果見表2。

2.2 金黃色葡萄球菌

根據(jù)表3金黃色葡萄球菌生化鑒定結(jié)果分析，TC04510126和TC04510478兩個(gè)樣品中均符合金黃色葡萄球菌陽性特征，結(jié)果可判斷TC04510126和TC04510478樣品中均檢出金黃色葡萄球菌。但TC04510478因干擾菌的影響，5 h后血漿才開始凝固，為了進(jìn)一步進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，并判斷有哪些干擾菌，對(duì)典型菌落和可疑菌落采用VITEK 2微生物鑒定儀的方式進(jìn)行確認(rèn)，得到了以下結(jié)果。

通過以上數(shù)據(jù)分析，T C 0 4 5 1 0 1 2 6 和TC04510478中均檢出金黃色葡萄球菌，并且兩個(gè)樣品中還存在大腸埃希菌、糞腸球菌、沙門菌群以及阪崎新生兒感染桿菌群等其他混合菌，結(jié)果見表4。不同的可疑菌對(duì)金黃色葡萄球菌的鑒定存在較大的干擾，因此選用外部鑒定手段能有助于結(jié)果判斷。

2.3 結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，通過采用傳統(tǒng)的致病菌特征鑒定方式及質(zhì)譜儀和全自動(dòng)微生物鑒定儀的方式進(jìn)行鑒定，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷和確證，TC04020173、TC04020050兩份樣品中均檢出銅綠假單胞菌，TC04510126、TC04510478兩份樣品中均檢出金黃色葡萄球菌，該結(jié)果與中檢院指定值一致，結(jié)果滿意。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室參加的化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證和金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證是評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室在化妝品中致病菌檢驗(yàn)檢測(cè)能力的重要手段，用以幫助實(shí)驗(yàn)室識(shí)別在化妝品中致病菌檢測(cè)過程中可能存在的問題并及時(shí)做好改正措施[5]。2022年NIFDC-PT-402化妝品中銅綠假單胞菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告中統(tǒng)計(jì)，該次能力驗(yàn)證共115家實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果，113家結(jié)果均評(píng)定為滿意，滿意度為98.26%，其中的兩家實(shí)驗(yàn)室不滿意原因主要是在鑒定環(huán)節(jié)中出現(xiàn)問題或是樣品間存在交叉污染；2023年NIFDC-PT-451化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證結(jié)果報(bào)告中統(tǒng)計(jì)，該次能力驗(yàn)證共220家實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果，206家結(jié)果為滿意，14家結(jié)果為不滿意，滿意率為93.64%，這14家實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)不滿意原因有三點(diǎn)：（1）增菌液、分離平板等培養(yǎng)基的質(zhì)量對(duì)金黃色葡萄球菌的分離效果影響很大，質(zhì)量不合格的培養(yǎng)基會(huì)影響目標(biāo)菌的復(fù)蘇和分離效果，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；（2）實(shí)驗(yàn)室人員操作技術(shù)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果也產(chǎn)生了很大的影響，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果；（3）金黃色葡萄球菌在人體皮膚及環(huán)境中均存在，檢驗(yàn)過程中無菌操作執(zhí)行不到位，導(dǎo)致了假陽性結(jié)果。為避免上述問題對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，需要從檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)設(shè)備、檢驗(yàn)材料、檢驗(yàn)方法及檢驗(yàn)環(huán)境五個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制。例如，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合潔凈要求，減少由于環(huán)境中的微生物而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的情況；操作人員具備專業(yè)知識(shí)和實(shí)踐水平，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)保證無菌操作，這樣可避免因人員操作而造成的交叉感染；對(duì)實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑、培養(yǎng)基等做好質(zhì)控，同時(shí)也可采用選擇性培養(yǎng)基幫助判斷，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；配置必要的微生物鑒定設(shè)備，在不確定的情況下可采用多種鑒定方法進(jìn)行驗(yàn)證，可得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果[6]。

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作者簡(jiǎn)介

胡陽，本科，主管藥師，研究方向食品藥品化妝品微生物檢驗(yàn)。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）