摘 要：目的：研究不同儲(chǔ)備菌株培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)體系培養(yǎng)時(shí)間、樣品稀釋倍數(shù)以及試樣本底空白對(duì)特殊醫(yī)學(xué)配方食品（簡(jiǎn)稱特醫(yī)食品）檢測(cè)結(jié)果的影響。方法：比較儲(chǔ)備菌株培養(yǎng)24 h和48 h后制備的種子液進(jìn)行檢測(cè)后結(jié)果的差異；比較標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣系列管培養(yǎng)20 h后，每間隔2 h吸光度值的變化和檢測(cè)結(jié)果的差異；比較樣品進(jìn)行0.5 f、f、2 f稀釋后檢測(cè)結(jié)果的差異；比較是否扣除試樣本底空白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果：儲(chǔ)備菌株活化24 h測(cè)得質(zhì)控樣平均值為97.2 μg/100 g，儲(chǔ)備菌株活化48 h測(cè)得質(zhì)控樣平均值為106 μg/100 g；培養(yǎng)時(shí)間20～38 h內(nèi)，質(zhì)控樣檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差為5.37%，符合給定的數(shù)值范圍；稀釋倍數(shù)對(duì)結(jié)果的影響跟樣品基質(zhì)相關(guān)；試樣本底空白對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，建議當(dāng)本底空白A540超過0.05時(shí)，結(jié)果處理時(shí)扣除本底空白。結(jié)論：建議使用活化48 h的儲(chǔ)備菌株制備種子液，檢測(cè)體系培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)接種液濁度選擇培養(yǎng)時(shí)間，推薦對(duì)按照標(biāo)簽值的1.5 f進(jìn)行稀釋，并在結(jié)果處理時(shí)根據(jù)需要扣除試樣本底空白。

關(guān)鍵詞：特醫(yī)食品，國(guó)標(biāo)法，葉酸

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.015.039

0 引 言

葉酸是一種水溶性的維生素，參與幾乎所有生物代謝，在物質(zhì)的合成和代謝中起關(guān)鍵作用，人類無(wú)法離開葉酸而生存。一旦被機(jī)體吸收后，除了儲(chǔ)存于肝臟的一部分，它會(huì)轉(zhuǎn)變成至少5種具有活性的輔酶形式作為一碳單元的傳送裝置，從而參與DNA和RNA的生物合成[1]，氨基酸的代謝如同型半胱氨酸的再甲基化及血紅蛋白的合成等生理代謝過程[2]。此外，葉酸能提供大量游離碳離子，為神經(jīng)末梢和構(gòu)成傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的重要化學(xué)原料物質(zhì)，進(jìn)而保障神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[3]，因此它在嬰兒發(fā)育、懷孕過程中尤為重要。

特殊醫(yī)學(xué)配方食品是為了滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品[4]。國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定葉酸是特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品等食品的必需成分，且含量要求非常嚴(yán)格[5] ， 對(duì)葉酸檢測(cè)方法需要較高的靈敏度和較低的檢出限。目前常用葉酸檢測(cè)方法有分光光度計(jì)法[6]，熒光法[7]、高效液相色譜[8]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、微生物法[10]和免疫法[11]。以上幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，適用基質(zhì)各有不同。微生物法操作關(guān)鍵點(diǎn)多，檢測(cè)周期長(zhǎng)，結(jié)果平行性和穩(wěn)定性差，工作量大，對(duì)環(huán)境、人員、菌種和培養(yǎng)基要求高，但傳統(tǒng)微生物法依然是我國(guó)現(xiàn)行檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提出的方法，它可測(cè)定具有生物活性的葉酸，能滿足含量低和基質(zhì)復(fù)雜的特醫(yī)食品檢測(cè)要求。

為使國(guó)標(biāo)法進(jìn)行葉酸檢測(cè)更準(zhǔn)確，更便捷，本文從儲(chǔ)備菌株培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)體系培養(yǎng)時(shí)間，樣品的稀釋倍數(shù)以及樣品空白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響幾個(gè)方面討論微生物法葉酸測(cè)定的細(xì)節(jié)問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鼠李糖乳桿菌ATCC 7469（美國(guó)菌種保藏中心ATCC）；菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基、葉酸測(cè)定培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.3%，北京科量技術(shù)有限公司）；葉酸定量分析質(zhì)控樣品（QC-IP-705）（特性值109.82 μg/100 g、特性值區(qū)間90.36～129.28 μg/100 g，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心）；9種特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品。

1.2 主要儀器與設(shè)備

U V2 6 0 0紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；IN160plus恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)美墨爾特公司）；AW2 0 0 S G厭氧工作站（英國(guó)伊萊泰科公司）；DensiCHEK Plus比濁儀（生物梅里埃中國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接種液的制備

選擇一批經(jīng)驗(yàn)證的鼠李糖乳桿菌（含20%甘油）作為工作菌株使用，實(shí)驗(yàn)前將保存于-20℃的工作菌株劃線于菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。按照GB 5009.211—2022 5.3進(jìn)行種子液的制備。

1.3.2 試樣提取

采用直接提取法，準(zhǔn)確稱取固體試樣0.1～2 g，精確至0.0001 g，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲振蕩2 h至試樣完全溶解或分散，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

1.3.3 試樣測(cè)定

采用試管法進(jìn)行試樣測(cè)定。

取3支試管，分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL試樣稀釋液，補(bǔ)水至5.0 mL，混勻，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行。另取2支試管加入5 mL試樣，不接菌，作為試樣本底空白。

1.3.4 培養(yǎng)

置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～40 h，培養(yǎng)20 h后，每隔2 h依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管和質(zhì)控樣系列管的在540 nm處的吸光度值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

以標(biāo)準(zhǔn)系列管的葉酸含量為橫坐標(biāo)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的吸光值平均值為縱坐標(biāo)，做采用EL ISA進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣系列管中葉酸的含量。其他無(wú)變化檢測(cè)步驟參照GB5009.211—2022。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)備菌株活化時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

葉酸測(cè)定菌株按照GB 5009.211—2022 5.2規(guī)定需要36℃±1℃培養(yǎng)20～24 h的活化菌株用于后續(xù)接種液的制備，但是鼠李糖乳桿菌在儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基上36℃±1℃厭氧生長(zhǎng)24 h后菌落較小，需培養(yǎng)至48 h菌落為正常大小。

取菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h和48 h的鼠李糖乳桿菌分別制備的種子液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，記錄觀察葉酸含量為1.0 ng的標(biāo)準(zhǔn)系列管吸光度值到達(dá)0.95±0.2需要的時(shí)間t，以及得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品測(cè)定值的結(jié)果，見表1。

由表1可見，生長(zhǎng)至可測(cè)定吸光度值需要的時(shí)間跟接種液的濁度相關(guān)，接種液濁度大，生長(zhǎng)至可測(cè)定渾濁度需要的時(shí)間短；儲(chǔ)備菌株活化24 h和48 h獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線r 2均大于0.995，相關(guān)性較好，但是由菌株活化2 4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)控樣值偏低（平均值為97.2 μg /10 0 g），菌株活化48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)控樣值（平均值為106μg/100 g）更接近特性值。建議菌種活化48 h后再進(jìn)行接種液的制備。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

G B 5 0 0 9. 211—2 0 2 2中試管法培養(yǎng)時(shí)間為20～40 h，獲得最大渾濁度時(shí)終止培養(yǎng)。由于培養(yǎng)時(shí)間跨度比較大，對(duì)于最大渾濁度較難準(zhǔn)確獲得，不方便日常檢測(cè)。經(jīng)過培養(yǎng)20 h后，每隔2小時(shí)測(cè)定不同含量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管隨著培養(yǎng)時(shí)間吸光度值的變化見表2。

由表2可以得出，在20～40 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，每隔2 h測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值得到的線性結(jié)果線性較好，r 2均大于0.9900。低含量（葉酸含量＜0.5 ng）時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的OD值出現(xiàn)整體增加趨勢(shì)，質(zhì)控樣品和高含量（葉酸含量≥0.5 ng）的標(biāo)準(zhǔn)系列管隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，但是當(dāng)培養(yǎng)至40 h，OD開始降低，可見培養(yǎng)至38 h時(shí)獲得最大渾濁度。除培養(yǎng)40 h外，質(zhì)控樣品試樣的吸光度值隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，測(cè)定結(jié)果均在特性值區(qū)間。當(dāng)培養(yǎng)至40 h，生長(zhǎng)測(cè)得質(zhì)控值偏離特性值區(qū)間。推測(cè)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鼠李糖乳桿菌對(duì)反應(yīng)管中的葉酸利用度達(dá)到頂峰后，難以再繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致吸光度值開始下降?？梢姰?dāng)接種液濁度為2.5 MCF時(shí)，培養(yǎng)至38 h時(shí)獲得最大渾濁度，在培養(yǎng)時(shí)間20～38 h內(nèi)，都可以進(jìn)行檢測(cè)。但當(dāng)接種液濁度增加或減少時(shí)，達(dá)到培養(yǎng)至最大渾濁度的時(shí)間則會(huì)縮短或延長(zhǎng)。

另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，以A540為0.500時(shí)為例，代入表2不同培養(yǎng)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的葉酸含量在1.8～0.5 ng之間，結(jié)果差異較大。盡管每次獨(dú)立檢測(cè)采用同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，由于檢測(cè)過程影響因素較多，故每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)都必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備，減少實(shí)驗(yàn)誤差。史方等[12]在做葉酸測(cè)定的測(cè)量不確定分析發(fā)現(xiàn)，測(cè)量不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次是測(cè)量重復(fù)性，分析認(rèn)為微生物法測(cè)量影響因素的發(fā)散性較大，建議實(shí)驗(yàn)過程中必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，嚴(yán)格規(guī)范操作從而獲得重復(fù)性好的理想結(jié)果，減小測(cè)量結(jié)果的不確定度，保證檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量。

2.3 稀釋倍數(shù)的估算對(duì)結(jié)果的影響

由表3可見，隨著稀釋倍數(shù)增加，測(cè)定結(jié)果偏高；稀釋過程推測(cè)跟基質(zhì)關(guān)系較大，基質(zhì)簡(jiǎn)單的，不受稀釋倍數(shù)影響；基質(zhì)復(fù)雜的，隨著稀釋倍數(shù)增大，結(jié)果變化較大。為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和減少實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，推薦將樣品同時(shí)進(jìn)行f和2f的稀釋倍數(shù)；根據(jù)測(cè)定值和標(biāo)示值之比，既能接近樣品實(shí)際含量又能減少稀釋過程帶來(lái)的工作量，建議優(yōu)先考慮1.5f稀釋倍數(shù)，以使其葉酸濃度在0.2～0.3 ng/mL之間。

2.4 樣品空白對(duì)結(jié)果的影響

特醫(yī)食品多以乳清蛋白粉、脫脂乳粉和脂肪粉等多種原料進(jìn)行加工，顏色有淡黃色，乳白色等，為排除樣品基質(zhì)顏色和澄清度對(duì)吸光度帶來(lái)的影響，本試驗(yàn)增加了試樣本底空白對(duì)照。表4中試樣本底空白為5 mL樣品稀釋液與5 mL 培養(yǎng)基混勻培養(yǎng)后在540處的吸光度值。由表4可見，不同試樣空白有明顯差異，對(duì)比是否扣除試樣本底空白得到的結(jié)果，兩組數(shù)據(jù)差距高達(dá)26%，只有當(dāng)本底空白小于0.05時(shí)，數(shù)據(jù)偏差小于10%。建議本底空白A540超過0.05時(shí)，扣除樣品空白再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以減少由此引起的結(jié)果偏差。

3 結(jié) 語(yǔ)

特醫(yī)食品中葉酸的測(cè)定過程影響因素較多，經(jīng)試驗(yàn)，儲(chǔ)備菌種活化時(shí)間、檢測(cè)體系培養(yǎng)時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品稀釋倍數(shù)以及樣品空白都對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

由儲(chǔ)備菌株活化24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)控樣值偏低，菌株活化48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)控樣值更接近特性值，偏差更小。這可能與菌株活化24 h后鼠李糖乳桿菌活力較低，在接種液的制備過程活力也非最佳狀態(tài)，導(dǎo)致試樣的培養(yǎng)階段對(duì)試樣中的葉酸未達(dá)到完全利用的狀態(tài)，造成檢測(cè)結(jié)果偏低。另外，檢測(cè)體系培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短與接種液的濁度負(fù)相關(guān)，當(dāng)接種液濁度高時(shí)，達(dá)到可測(cè)定的培養(yǎng)時(shí)間短；接種液濁度低時(shí)，達(dá)到可測(cè)定的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，可結(jié)合接種液濁度進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間的調(diào)整。結(jié)合陸其聰[13]等人發(fā)現(xiàn)檢測(cè)體系pH值對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)有影響，培養(yǎng)至22 h活菌數(shù)急劇下降，通常推薦培養(yǎng)22～24 h進(jìn)行測(cè)定。另外，微生物法進(jìn)行葉酸測(cè)定實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較多，工作量較大，選擇合適稀釋倍數(shù)對(duì)減少工作量，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有決定性作用，特醫(yī)食品優(yōu)先推薦1. 5f 稀釋倍數(shù)。且再進(jìn)行結(jié)果處理需考慮試樣本底空白的影響。

微生物法測(cè)定葉酸的原理是在一定控制條件下，將營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠李糖乳桿菌菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定透光率（或吸光度值），在一定測(cè)定范圍內(nèi)可以根據(jù)葉酸含量與透光率（或吸光度值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣中葉酸的含量。培養(yǎng)過程既包含鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)過程，又包含鼠李糖乳桿菌對(duì)不同含量的葉酸利用情況，影響因素較多，陸其聰?shù)萚13]，孫瀟惠等[14]，吳思敏等[15]，夏亞文等[16]各從不同角度對(duì)葉酸測(cè)定過程中影響因素進(jìn)行了研究，以使葉酸測(cè)定過程更簡(jiǎn)便，影響因素更精準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。今后如有更多從鼠李糖乳桿菌代謝葉酸方向的研究，將對(duì)微生物法進(jìn)行葉酸精準(zhǔn)測(cè)定更有靶向性。

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作者簡(jiǎn)介

于瑞莉，碩士研究生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称肺⑸餀z測(cè)和維生素檢測(cè)。

黃麗俊，通信作者，碩士研究生，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。

（責(zé)任編輯：張佩玉）