摘要：為了明確棉花內(nèi)生鐮刀菌CEF-321對(duì)棉花黃萎病的防治作用及機(jī)理，采用對(duì)峙培養(yǎng)法、對(duì)扣培養(yǎng)法、圓盤濾膜培養(yǎng)法測(cè)定CEF-321對(duì)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）強(qiáng)致病力菌株Vd080菌絲生長(zhǎng)的抑制作用；在溫室內(nèi)采用濾液灌根接種法和固體菌劑基質(zhì)接種法測(cè)試CEF-321對(duì)棉花黃萎病的防治效果，測(cè)定其對(duì)棉花葉片中胼胝質(zhì)合成的誘導(dǎo)，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)相關(guān)防御基因的表達(dá)。結(jié)果表明，CEF-321的揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物對(duì)Vd080菌絲的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；CEF-321固體菌劑基質(zhì)接種和濾液灌根接種對(duì)棉花黃萎病的防治效果分別為39.08％和53.30％；CEF-321可誘導(dǎo)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累，誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶基因PAL、過氧化物酶基因POD、病程相關(guān)蛋白基因PR10等上調(diào)表達(dá)。這些研究結(jié)果初步表明CEF-321有用于棉花黃萎病生物防治的潛力。

關(guān)鍵詞：生物防治；鐮刀菌CEF-321；內(nèi)生真菌；棉花黃萎?。环烙?；誘導(dǎo)抗性

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的1種土傳維管束病害，病原菌主要是大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和黑白輪枝菌（V. albo-atrum）[1]。黃萎病在棉花的整個(gè)生育時(shí)期均可造成危害，在田間發(fā)生程度與棉花品種的抗病性、土壤中病原菌的密度和致病力強(qiáng)弱、環(huán)境條件等多種因素有關(guān)，且大麗輪枝菌的侵染過程復(fù)雜，寄主范圍比較廣泛，傳播途徑多樣，致病機(jī)理復(fù)雜，對(duì)其具備抗性的棉花材料缺乏[2]。20世紀(jì)90年代后，棉花黃萎病在全國范圍內(nèi)暴發(fā)，對(duì)棉花生產(chǎn)造成顯著影響[3]，嚴(yán)重威脅棉花生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[4]。

生物防治相比化學(xué)防治能減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和對(duì)人類的危害，是1種環(huán)境友好可持續(xù)發(fā)展的防治方法[5]。在棉花黃萎病的生物防治中主要利用拮抗細(xì)菌、拮抗真菌、放線菌[6]。其中，拮抗細(xì)菌有枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等，真菌有木霉、鐮刀菌、黃色蠕形霉等[7-8]。2014年，王玲飛[9]在棉花上分離出642株內(nèi)生真菌，并篩選出7株對(duì)棉花黃萎病有明顯抑制效果的生防菌。張蕓[10]研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌CEF-559對(duì)棉花黃萎病菌有較好的抑制作用。蒲小明[11]研究發(fā)現(xiàn)感病黃瓜品種在根部接種非致病性尖孢鐮刀菌CS-20后，黃瓜苗產(chǎn)生抗病反應(yīng)，并降低了病情指數(shù)。Veloso等[12]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用非致病性尖孢鐮刀菌Fo47能減輕辣椒中的黃萎病和疫病的癥狀。然而，對(duì)內(nèi)生鐮刀菌防治棉花黃萎病效果的研究較少。

鑒于此，本研究以內(nèi)生鐮刀菌CEF-321為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究該菌株對(duì)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)抑制效果，初步揭示CEF-321防治棉花黃萎病的途徑，為棉花黃萎病生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌CEF-321來自健康棉花植株，屬于鐮刀菌屬，其菌落表面呈淺紫紅色。大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080（菌株保藏編號(hào)：CGMCC No. 5904）分離自河北辛集樣本。試驗(yàn)選用耐黃萎病棉花品種魯棉研21號(hào)[13]。以上材料均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。

1.2 菌株CEF-321對(duì)大麗輪枝菌的拮抗作用測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法[14]測(cè)定CEF-321對(duì)Vd080菌絲生長(zhǎng)的影響。將 Vd080和CEF-321在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar， PDA）平板培養(yǎng)基上活化，25 ℃暗培養(yǎng)7 d后用打孔器在菌落邊緣打孔取直徑為5 mm的菌餅。在PDA平板底部劃直線，一端接種Vd080菌餅，另一端接種CEF-321菌餅，相距40 mm；對(duì)照僅接種Vd080菌餅。25 ℃暗培養(yǎng)7 d，觀察并測(cè)量、記錄菌落直徑，以對(duì)照和處理的菌落直徑平均值計(jì)算抑菌率（I）。每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算公式如下：I＝[（D1－5）－（D2－5）]/（D1－5）×100%。式中，D1、D2分別為對(duì)照菌落直徑、處理菌落直徑。

采用對(duì)扣培養(yǎng)法[15]測(cè)定CEF-321揮發(fā)性代謝物對(duì)Vd080的影響，將Vd080菌餅和CEF-321菌餅分別接種在PDA平板中間，然后對(duì)扣密封，對(duì)照僅接種Vd080菌餅。每個(gè)處理重復(fù)3次，在25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d。菌落直徑測(cè)量用十字交叉法，計(jì)算抑菌率。

利用圓盤濾膜培養(yǎng)法[14]測(cè)定CEF-321非揮發(fā)性代謝物對(duì)Vd080的影響，玻璃紙滅菌后鋪在PDA平板培養(yǎng)基上，將CEF-321菌餅接種在PDA平板中間，待菌絲長(zhǎng)滿玻璃紙時(shí)，去除玻璃紙，在PDA平板中間接種Vd080菌餅；對(duì)照為僅接種Vd080。每個(gè)處理重復(fù)3次，于25 ℃中暗培養(yǎng)15 d。測(cè)量菌落直徑，并記錄，計(jì)算抑菌率。

1.3 菌株CEF-321對(duì)棉花黃萎病的防治效果測(cè)定

濾液灌根接種法：將CEF-321菌餅放入液體察氏培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r·min－1搖床中培養(yǎng)7 d，將得到的液體用紗布過濾，經(jīng)孔徑0.22 μm的微孔濾膜器過濾[16]獲得濾液，備用。盆栽種植：將魯棉研21號(hào)種子浸泡10 h后種植于無底營養(yǎng)紙缽（直徑6 cm，高度10 cm），以6個(gè)營養(yǎng)紙缽為1個(gè)處理。上述紙缽中的蛭石沙土基質(zhì)用蛭石、沙子、營養(yǎng)土按體積比3∶2∶1混合均勻制成[17]。待棉苗第1片真葉初現(xiàn)時(shí)，開始灌根接種CEF-321濾液，每缽50 mL，以接種等量的液體察氏培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)3 d，再接種Vd080孢子懸浮液（有效活菌數(shù)為1×107 mL－1），每缽10 mL。每個(gè)處理3次重復(fù)。

固體菌劑基質(zhì)接種法：將麥麩培養(yǎng)物和水?dāng)嚢杌靹蚝鬁缇缓蠼臃N質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的CEF-321液體菌種，25 ℃中暗培養(yǎng)7 d，然后自然風(fēng)干。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%將固體菌劑接入蛭石沙土基質(zhì)中，制成營養(yǎng)紙缽。以無CEF-321固體菌劑的蛭石沙土營養(yǎng)基質(zhì)制成的營養(yǎng)紙缽為對(duì)照。棉花種子及其消毒處理和播種方法同濾液灌根接種法。待第1片真葉初現(xiàn)時(shí)，每缽接種Vd080孢子懸浮液（有效活菌數(shù)為1×107 mL－1）10 mL。以6個(gè)營養(yǎng)紙缽為1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

病害調(diào)查：棉苗放置在溫度20～32 ℃、土壤相對(duì)濕度60%以上的日光溫室中培育，在接種Vd080后25 d時(shí)，參照5級(jí)（0～4級(jí)）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[18]。

1.4 菌株CEF-321對(duì)棉花出苗和生長(zhǎng)的影響

棉花種植方法同固體菌劑基質(zhì)接種法，播種后5 d時(shí)調(diào)查出苗情況；播種后20 d時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)取10株棉苗，測(cè)定株高、根長(zhǎng)、地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量、地下部鮮物質(zhì)質(zhì)量。

1.5 菌株CEF-321誘導(dǎo)棉花胼胝質(zhì)積累的測(cè)定

棉花種植方法同固體菌劑基質(zhì)接種法，待棉苗第1片真葉初現(xiàn)時(shí)每缽接種Vd080孢子懸浮液（有效活菌數(shù)為1×107 mL－1）10 mL，以接種等量的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照。接種后48 h，取大小相近的真葉，用無菌水清洗后置于離心管中，固定液（乙醇、乙酸體積比為3∶1）固定葉片3 h后，將葉片浸于70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）和50%的乙醇中2 h，放入無菌水浸泡8 h；再用無菌水沖洗3次，浸于10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaOH溶液中2 h，使葉片透明；去除NaOH溶液，用無菌水清洗3次，放入0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的苯胺藍(lán)染液中避光染色3 h，然后，在熒光體式顯微鏡（Leica M165FC）下檢測(cè)胼胝質(zhì)的含量，重復(fù)檢測(cè)6片葉。

1.6 菌株CEF-321誘導(dǎo)棉花防御相關(guān)基因的測(cè)定

棉苗培育、拮抗菌CEF-321和Vd080的培育方法同濾液灌根接種法，待第1片真葉初現(xiàn)時(shí)接種CEF-321濾液，每缽50 mL，對(duì)照為接種液體察氏培養(yǎng)基，3 d后接種Vd080孢子懸浮液（有效活菌數(shù)為1×107 mL－1），每缽10 mL，接種后48 h取樣（隨機(jī)選取3～5片葉）。

提取棉花葉片中RNA，用NanoDrop 2000檢測(cè)質(zhì)量濃度，并將RNA的質(zhì)量濃度稀釋到100 ng·μL－1備用。利用HiScript○R "III 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，最后將得到的cDNA稀釋10倍左右。用SYBR Green為染料來進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR），內(nèi)參基因?yàn)閡biquitin，目標(biāo)基因?yàn)檫^氧化物酶（peroxidase， POD）基因POD、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase， PAL）基因PAL、病程相關(guān)蛋白10（pathogenesis-related protein 10， PR10）基因PR10、茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子髓細(xì)胞組織增生蛋白（myelocytomatosis protein， MYC）基因MYC、木質(zhì)素代謝途徑中的關(guān)鍵酶4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaroyl-CoA ligase， 4CL）基因4CL、丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase， AOS）基因AOS和茉莉酸氨基酸合酶（jasmonoyl amino acid conjugate synthase， JAR）基因JAR，所用特異性引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括10 μmol·L－1上下游引物各0.4 μL、2×PerfectStart TM Green qPCR SuperMix 10 μL、cDNA 2 μL、Nuclease-free Water補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CEF-321對(duì)大麗輪枝菌的抑制作用

不同方法培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果均表明，CEF-321對(duì)大麗輪枝菌Vd080具有明顯的抑制效果。對(duì)峙培養(yǎng)7 d時(shí)，處理組中Vd080菌落直徑為12 mm（圖1A），而空白對(duì)照中Vd080的菌落直徑為20 mm（圖1B），抑菌率為53.3%。對(duì)扣培養(yǎng)15 d時(shí)，處理組中Vd080的菌落直徑為12 mm（圖1C），對(duì)照組未經(jīng)處理的Vd080的菌落直徑為56 mm（圖1D），抑菌率為86.3%。采用圓盤濾膜培養(yǎng)法培養(yǎng)15 d時(shí)，處理組中Vd080沒有生長(zhǎng)（圖1E），未經(jīng)處理的Vd080的菌落直徑為60 mm（圖1F），抑菌率為100.0%。

2.2 溫室內(nèi)CEF-321對(duì)棉花黃萎病的防治效果

在溫室盆栽防病試驗(yàn)中，CEF-321固體菌劑基質(zhì)接種和濾液灌根接種處理都減輕了棉花黃萎病的發(fā)病程度，處理組中棉花葉片出現(xiàn)黃化和枯萎的癥狀較少，而對(duì)照組較多。

固體菌劑基質(zhì)接種法的病情調(diào)查結(jié)果表明，與對(duì)照相比，該處理方法有效地降低了發(fā)病率和病情指數(shù)，溫室防治效果達(dá)到39.08%；通過濾液灌根接種法進(jìn)行病情調(diào)查顯示，處理與對(duì)照相比，該方法顯著降低了發(fā)病率，溫室防治效果達(dá)到53.30%（表2）。表明CEF-321處理增強(qiáng)了棉花對(duì)Vd080的抗性，減輕了病害的發(fā)生。2種接種方法的CEF-321防治效果相比較，濾液灌根接種法要好于固體菌劑基質(zhì)接種法。

2.3 CEF-321對(duì)棉花出苗和生長(zhǎng)的影響

CEF-321固體菌劑基質(zhì)接種處理和對(duì)照的棉花的出苗率分別為93.3%和89.4%，表明CEF-321對(duì)棉花的出苗率有一定提高作用，但未達(dá)顯著水平（表3）。結(jié)果（表3）還表明，采用CEF-321固體菌劑基質(zhì)接種處理后，棉苗的株高、根長(zhǎng)、地上部和地下部鮮物質(zhì)質(zhì)量均高于對(duì)照，表明CEF-321對(duì)棉花具有一定的促進(jìn)作用，但未達(dá)差異顯著水平。

2.4 CEF-321誘導(dǎo)棉花胼胝質(zhì)積累

鏡檢結(jié)果（圖2）表明，在接種Vd080孢子懸浮液后48 h時(shí)，CEF-321固體菌劑基質(zhì)接種處理的棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累量增多，而對(duì)照棉花葉片中的胼胝質(zhì)積累量較少，表明CEF-321誘導(dǎo)了棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累，這可對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗脅迫起到重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

2.5 CEF-321對(duì)棉花防御基因表達(dá)的影響

在接種Vd080孢子懸浮液后48 h時(shí)，CEF-321濾液灌根接種處理的棉花葉片中PAL、POD、PR10、MYC、4CL、AOS和JAR基因表達(dá)量上調(diào)，其中，PR10、POD、MYC、4CL和AOS基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照（圖3）。表明使用CEF-321的濾液灌根接種棉花，可以誘導(dǎo)棉花的防御體系，提高棉花的抗病性。

3 討論與結(jié)論

棉花黃萎病是我國棉花生產(chǎn)上的嚴(yán)重病害[20-21]。利用生物防治病害具有不易產(chǎn)生抗性、資源豐富、環(huán)保安全、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢(shì)[22-23]。非致病性尖孢鐮刀菌不僅不會(huì)引發(fā)植物病害，而且有拮抗作用，可以用來防治番茄[24-25]、黃瓜[26-27]等作物的病害。本研究以棉花內(nèi)生鐮刀菌為研究對(duì)象，分析其對(duì)棉花黃萎病的防治作用。目前關(guān)于鐮刀菌的研究較少，Elmer[28]研究發(fā)現(xiàn)接種非致病性尖孢鐮刀菌CS-20可以減輕病害的發(fā)生。肖風(fēng)榮等[29]研究發(fā)現(xiàn)非致病性尖孢鐮刀菌FJAT-9290可以促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)。

生防菌防治病害的途徑有競(jìng)爭(zhēng)、寄生、次生代謝物、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提升植物防御能力和調(diào)節(jié)微生態(tài)環(huán)境等。許多研究表明，微生物的揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物可對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用[30]。本研究中圓盤濾膜培養(yǎng)測(cè)定結(jié)果顯示，CEF-321非揮發(fā)性代謝物對(duì)Vd080菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為100.0%，這可能是由于鐮刀菌能通過產(chǎn)生一些類似抗生素的物質(zhì)來抵抗病原菌[31]，然而CEF-321產(chǎn)生的關(guān)鍵抑菌活性物質(zhì)尚未明確。本研究中對(duì)扣培養(yǎng)結(jié)果顯示，鐮刀菌CEF-321揮發(fā)性代謝物對(duì)Vd080菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為86.3%，但揮發(fā)性代謝物需要達(dá)到足夠高的含量時(shí)才能產(chǎn)生抑菌作用[32]。

本研究采用2種接種方式進(jìn)行了溫室盆栽試驗(yàn)，CEF-321對(duì)棉花黃萎病都表現(xiàn)出了理想的防治效果。表明該菌株有用于大田防治棉花黃萎病的潛力，下一步可以在大田進(jìn)行效果驗(yàn)證。目前國內(nèi)外主要通過選育抗病品種，使用化學(xué)藥劑、田間管理、物理防治等方法來防治病害[33]。單一的防治措施很難達(dá)到理想的防治效果，因此將CEF-321用于生物防治時(shí)可以與其他防治措施相結(jié)合來達(dá)到更好的防治效果[34]。此外，還研究了CEF-321對(duì)棉花的生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示CEF-321處理促進(jìn)了棉苗的生長(zhǎng)。

生防菌還有誘導(dǎo)抗性的作用，能激發(fā)植物自身的免疫機(jī)制。防御基因在植物抵抗病原體侵染中起重要作用，可以催化或參與植物木質(zhì)素和酚類化合物的合成。胼胝質(zhì)是β-l，3葡聚糖的聚合物，在植物抗脅迫中起重要作用[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種CEF-321一方面可誘導(dǎo)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累——植物防止病原菌入侵的天然反應(yīng)[37]，另一方面可誘導(dǎo)棉花植株中防御基因的上調(diào)表達(dá)。本研究中PAL作為水楊酸信號(hào)酶類，其表達(dá)量在接種CEF-321處理后出現(xiàn)變化，與對(duì)CEF-818的研究結(jié)果[38]相同。POD、PR10作為木質(zhì)素合成酶和核酸酶都是抵抗病原菌的防衛(wèi)物質(zhì)[39]。JAR是茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶可以激活茉莉酸甲酯信號(hào)途徑[40]。MYC轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)JA的合成，誘導(dǎo)相關(guān)抗性基因的表達(dá)[41]。4CL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，可以調(diào)控黃酮、花青素和木質(zhì)素的合成，對(duì)植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境脅迫具有重要作用[42]。AOS是JA合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，可以促進(jìn)JA在植物中的積累[43]。這些酶相關(guān)基因的表達(dá)都會(huì)受到病菌侵染誘導(dǎo)，但是CEF-321誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病菌系統(tǒng)抗性的完整通路還需進(jìn)一步的探索。

綜上，棉花內(nèi)生鐮刀菌CEF-321能有效抑制大麗輪枝菌菌絲的生長(zhǎng)，其揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物也能抑制病原菌的生長(zhǎng)；在盆栽試驗(yàn)中，其固體菌劑基質(zhì)接種和濾液灌根接種處理對(duì)黃萎病有較好的防治效果；CEF-321引起了胼胝質(zhì)的積累、防御相關(guān)基因的表達(dá)。說明CEF-321通過誘導(dǎo)棉花抗性反應(yīng)和代謝物質(zhì)合成來抑制病原菌侵染和擴(kuò)展，從而達(dá)到防病效果。

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（責(zé)任編輯：楊子山 責(zé)任校對(duì)：秦凡）