摘要：【目的】尋找能夠特異性地區(qū)分蜂糖李種質(zhì)和其他李種質(zhì)，以及蜂糖李中的不同品系（黃皮、青皮和一點(diǎn)紅）的鑒定方法。【方法】選擇蜂糖李中的3個(gè)品系（黃皮、青皮和一點(diǎn)紅）及其他9個(gè)李種質(zhì)作為研究對(duì)象，利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察花粉形態(tài)并進(jìn)行聚類分析，同時(shí)結(jié)合重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，并利用21份其他李種質(zhì)對(duì)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。【結(jié)果】掃描電鏡結(jié)果表明，蜂糖李與四月李、三月李在花粉形態(tài)上存在顯著差異，而一點(diǎn)紅蜂糖李與其他蜂糖李相比在花粉外壁紋飾上也存在一定差異。在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方面，篩選出2對(duì)表現(xiàn)穩(wěn)定的InDel分子標(biāo)記，聯(lián)合使用能夠?qū)⒎涮抢钆c其他21份李種質(zhì)有效區(qū)分，同時(shí)還篩選出一對(duì)InDel分子標(biāo)記，可用于區(qū)分蜂糖李中的3個(gè)品系。【結(jié)論】研究結(jié)果為蜂糖李的種質(zhì)鑒定提供了重要的孢粉學(xué)和分子標(biāo)記依據(jù)，有望對(duì)蜂糖李產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化與品質(zhì)提升提供幫助。

關(guān)鍵詞：蜂糖李；孢粉學(xué)；InDel；分子標(biāo)記；種質(zhì)鑒定

中圖分類號(hào)：S662.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1009-9980（2024）07-1297-13

Application of palynology and InDel markers in germplasm identifica-tion in Fengtangli plum

XIE Weiwei1，XU Dantong1，CHEN Fangce1，SONG Zhenfu2，ZHONG Siling2，AO Yanfei2，AN Xing2，WANG Honglin3，HE Yehua1，ZHENG Qianming3*，LIU Chaoyang1*

（1State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resource Conservation and Utilization/College of Horticulture，South Chi-na Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China;2Anshun Academy of Agricultural Sciences，Anshun 561000，Gui-zhou，China;3Institute of Pomology Science，Guizhou Academy of Agricultural Science/Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Germplasm Innovation in Karst Region，Guiyang 550006，Guizhou，China）

Abstract：【Objective】Fengtangli，a superior Chinese plum variety that was bred from the local landra-ces in Zhenning county of Anshun City，is renowned for its crisp and tender texture.In recent years，the increasing market demand for Fengtangli seedlings has resulted in a proliferation of inferior and coun-terfeit seedlings being marketed as high-quality products.On the market，the visually similar Siyueli has been seen 1ly sold as Fengtangli，consequently disrupting the market equilibrium.Additionally，distinct lines within the Fengtangli variety have been identified，exhibiting many variations such as yel-low-skinned，green-skinned，and partially red-skinned fruits upon maturation.These phenotypic varia-tions not only affect the fruit quality but also the required cultivation and management practices.The presence of mixed lines complicates standardized orchard management，harvest scheduling and fruit grading processes，negatively impacting the overall economic yield of the orchards.Hence，it isimpera-tive to accurately identify and differentiate the intrinsic variations within Fengtangli as well as between Fengtangli and other plum germplasms to advance standardization and augment the quality control in the Fengtangli industry.【Methods】Flower buds were collected from 5-year-old fruit trees in the or-chard at the stage of flower bud swelling to white bell，and pollen was collected after air-drying under natural conditions.Gold-spray treatment was performed using an ion sputtering instrument under vacu-um，followed by observation of pollen micro-morphology under a scanning electron microscope.Young leaves from the plum germplasms were sampled for DNA extraction via an optimized CTAB method.Targeted InDel loci were identified from resequencing data using bioinformatics tools，and primers for these loci were designed.Amplification via PCR and validation of the InDel markers were performed，with the confirmation conducted through the agarose gel electrophoresis.【Results】This study conduct-ed a systematic analysis of the pollen micro-morphology of Fengtangli and other Chinese plum germ-plasms.The analysis revealed that the pollen of the materials tested exhibited isopolar and radially sym-metric forms with three colporate apertures，conforming to the classification of N3P4C5 type pollen.In view of the polar point，the pollen presented a trifid circula shape，and in view of the equatorial point，it showed an elongate ellipse，reflecting a degree of morphological uniformity.However，significant differ-ences were observed in the polar axis length and equatorial axis length among the germplasms，especial-ly between the Siyueli and Sanyueli compared to the Fengtangli.Within the three Fengtangli lines，the partially red-skinned line had a slightly longer equatorial axis length than the yellow-skinned and green-skinned lines.Moreover，the pollen exine ornamentation of all tested germplasms displayed a“striate-perforate”type，but there were significant differences in the direction of the striations，density and po-rosity.Among the three Fengtangli lines，differences in pollen were primarily reflected in the character-istics of the exine ornamentation.The ridge width was relatively larger in the yellow-skinned line，while the green-skinned and partially red-skinned line had similar ridge numbers，with minor differences in the distance between ridges，particularly in the partially red-skinned line，which had significantly small-er aperture and porosity than the other two lines.Cluster analysis，based on multiple morphological in-dexes of pollen，revealed the similarities and relatedness among the tested plum germplasms.The clus-tering results indicated that the plum germplasms were effectively grouped according to pollen charac-teristics at a certain Euclidean distance criterion，with the Siyueli forming a unique group due to its dis-tinctive pollen morphology.Further analysis showed that the three lines of Fengtangli and several other plum germplasms exhibited high similarity in pollen morphology.These findings provided significant palynological evidence for understanding the classification and relatedness of Fengtangli and related plum germplasms.In the aspect of InDel molecular markers，based on predicted InDel sites from rese-quencing data，two pairs of primers successfully amplified the strips of target DNA in 12 plum germ-plasms.These results showed consistency across multiple PCR assays，demonstrating the effectiveness of these primer combinations and providing a molecular basis for distinguishing Fengtangli from other 21 representative plum germplasms.Concurrently，the primer P3-38 produced specific bands through PCR amplification in the three main lines of Fengtangli，effectively distinguishing them.【Conclusion】Palynological analysis revealed that the distinctions among different species within the prunus and three main lines of Fengtangli were primarily concentrated on exine ornamentation.Based on pollen appear-ance and exine ornamentation data，the cluster analysis indicated significant differences between Feng-tangli and both Sanyueli and Siyueli，suggesting that their relatedness may be relatively distant.Thus，palynology can serve as an auxiliary method for distinguishing them.Although palynological results can express a broader range of genetic information，but as a method for variety identification，they pos-sess certain limitations.Meanwhile，the InDel molecular markers developed by resequencing were high-ly effective for identifying three main lines of Fengtangli as well as its differentiation from other Chi-nese plum germplasms，compensating the limitation inherent in palynology.

Keywords：Fengtangli;Palynology;InDel;Molecular marker;Germplasm identification

蜂糖李是由貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位從安順市鎮(zhèn)寧縣地方李品種中選育出的優(yōu)質(zhì)中國(guó)李品種，口感脆嫩，入口化渣，風(fēng)味獨(dú)特，無(wú)酸澀苦味，是李中珍品[1]。近年來(lái)，由于蜂糖李市場(chǎng)行情持續(xù)向好，其栽培生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，對(duì)優(yōu)質(zhì)純正種苗的需求也急劇增加，導(dǎo)致蜂糖李苗木市場(chǎng)出現(xiàn)了一些以次充好、以假亂真的問(wèn)題；在果實(shí)成熟季節(jié)，還存在著外觀與蜂糖李相似，但口感相差甚遠(yuǎn)的四月李等地方李品種，冒充蜂糖李出售的現(xiàn)象，擾亂了蜂糖李的生產(chǎn)和銷售秩序。此外，蜂糖李中還存在著一定程度的品系混雜問(wèn)題，在果實(shí)品質(zhì)、果皮顏色、葉片形態(tài)、樹(shù)體產(chǎn)量等方面出現(xiàn)了不同類型的變異。根據(jù)成熟時(shí)果皮顏色的差異，發(fā)現(xiàn)有黃皮蜂糖李（成熟時(shí)果皮為黃色）、青皮蜂糖李（成熟時(shí)果皮為綠色）、一點(diǎn)紅蜂糖李（成熟時(shí)靠近果柄的部位出現(xiàn)不規(guī)則片狀紅色）等品系，他們?cè)诠麑?shí)品質(zhì)、配套栽培管理技術(shù)方面也存在一定程度的差異；品系的混雜會(huì)給生產(chǎn)中果園標(biāo)準(zhǔn)化管理、果實(shí)采摘和果品分級(jí)等方面帶來(lái)一定的不便，影響果園的綜合經(jīng)濟(jì)效益。因此，鑒定和區(qū)分蜂糖李以及蜂糖李品種內(nèi)的品系類型，對(duì)蜂糖李產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化和品質(zhì)提升至關(guān)重要。為了蜂糖李產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，尋找有效方法進(jìn)行蜂糖李種質(zhì)鑒定，區(qū)分蜂糖李內(nèi)自然變異的群體以及與其他李種質(zhì)之間的差異具有重要意義。

在種質(zhì)分類與鑒定中，常用的方法包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、孢粉等方面的微形態(tài)標(biāo)記、同工酶與分子標(biāo)記等[2]。植物花粉的形態(tài)特征通常相對(duì)穩(wěn)定，攜帶豐富的遺傳信息，因此對(duì)花粉外觀的研究已經(jīng)成為常見(jiàn)的種質(zhì)鑒定和植物分類方法，在果樹(shù)、蔬菜、花卉等各類園藝作物中有廣泛的應(yīng)用[3-5]。分子標(biāo)記在基因水平上標(biāo)記遺傳差異，不受組織、器官或環(huán)境的影響，在果樹(shù)種質(zhì)鑒定中也得到廣泛應(yīng)用。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已發(fā)展至第三代，其中SSR等第二代分子標(biāo)記在李的種質(zhì)鑒定中應(yīng)用較為廣泛[6-7]。InDel分子標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)基因組中核苷酸片段的插入和缺失而開(kāi)發(fā)，具有條帶清晰、穩(wěn)定性強(qiáng)以及經(jīng)濟(jì)便捷等特點(diǎn)。在柚[8]、烏菜[9]、辣椒[10]等園藝作物的種質(zhì)鑒定中已有成功應(yīng)用，然而在中國(guó)李種質(zhì)鑒定與分類中還未見(jiàn)報(bào)道。開(kāi)發(fā)更多類型的分子標(biāo)記對(duì)完善蜂糖李的鑒別體系具有非常重要的作用。

筆者選擇了黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點(diǎn)紅蜂糖李這3種成熟時(shí)果實(shí)表皮顏色不同的蜂糖李品系、6個(gè)蜂糖李原產(chǎn)地貴州安順市的本地李種質(zhì)（蜜李1號(hào)、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李、冰脆李），以及3個(gè)其他地區(qū)的李種質(zhì)（臺(tái)灣蜜李、三月李、三華李）作為試驗(yàn)材料，結(jié)合孢粉學(xué)和InDel分子標(biāo)記技術(shù)，分析蜂糖李與其他李種質(zhì)在花粉形態(tài)和基因?qū)用嫔系牟町?，并利用另外?lái)自不同區(qū)域的12個(gè)代表性的李品種對(duì)篩選到的分子標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)尋找蜂糖李3個(gè)品系之間的差異，以期為蜂糖李的種質(zhì)鑒定和未來(lái)的育種工作提供孢粉學(xué)與分子層面的依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

筆者選取的試驗(yàn)材料主要來(lái)源于貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)所屬的李種質(zhì)資源圃。12份李種質(zhì)涵蓋了黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點(diǎn)紅蜂糖李、蜜李1號(hào)、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李、冰脆李、臺(tái)灣蜜李、三月李及三華李，這些被用于進(jìn)行孢粉學(xué)分析和分子標(biāo)記試驗(yàn)，具體信息詳見(jiàn)表1。上述種質(zhì)的果實(shí)成熟期表型詳見(jiàn)圖1。此外，為了驗(yàn)證分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性，收集了包括粉黛脆李、鳳凰李、脆紅李、國(guó)峰7號(hào)、大紅袍、黃干核李、嶺溪李、檇李、黃金奈李、恐龍蛋、味帝及紫葉李等在內(nèi)的另外12份李種質(zhì)材料。

1.2花粉的收集與微觀形態(tài)觀察

選擇果園內(nèi)5年生果樹(shù)，待其花蕾膨大為鈴鐺狀、雌雄蕊未顯露、花朵即將開(kāi)放時(shí)，即大蕾期，采摘花蕾。用干凈的鑷子小心去掉花瓣和花萼，收集花藥，將花藥平鋪在硫酸紙上自然陰干48h，待花粉散出后，收集花粉存放于1.5 mL離心管中，在離心管中加入少數(shù)硅膠粒使花粉保持干燥，常溫存放。

將花粉均勻散布在貼有雙面膠的樣品臺(tái)上，在真空狀態(tài)下使用離子濺射儀（HITACHI，MC1000，日本）進(jìn)行噴金處理，并置于掃描電子顯微鏡（HIT-ACHI，SU8100，日本）下進(jìn)行觀測(cè)，選擇具有代表性的極面和赤道面視野拍照，并觀察局部的形態(tài)與紋飾特征。

1.3 DNA提取與重測(cè)序

采集供試?yán)罘N質(zhì)的幼嫩葉片，采用改良版的CTAB法提取黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點(diǎn)紅蜂糖李、蜜李1號(hào)、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李的DNA[11]。使用超聲波法將DNA片段化，并對(duì)處理后的片段DNA進(jìn)行純化、末端修復(fù)、3'端加A、連接測(cè)序接頭，構(gòu)建文庫(kù)，再利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，將原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到Clean reads，將數(shù)據(jù)對(duì)比到已發(fā)表的三月李參考基因組（https：//www.rosaceae.org/Analysis/9450778）上，并使用BWA軟件將Clean reads與參考基因組序列對(duì)比，上述的重測(cè)序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 InDel位點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì)

使用Genome Analysis Toolkit（GATK）v3.8軟件對(duì)InDel位點(diǎn)進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，后使用基因組可視化工具Integrative Genomics Viewer（IGV）v2.12.3軟件進(jìn)行精細(xì)篩選，篩選蜂糖李中特異的InDel位點(diǎn)（圖2），記錄差異區(qū)域的具體位置信息。使用TBtools-Ⅱv2.0軟件中的Fasta Extract功能，提取差異區(qū)域上下游大約1 kb的序列。利用Primer Premier 5.0軟件，在差異區(qū)域上下游位置設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 InDel標(biāo)記檢測(cè)

使用江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司的2×Flash PCR MasterMix（Dye）作為PCR反應(yīng)試劑。PCR擴(kuò)增體系（20μL）：10μL 2×Flash PCR MasterMix（Dye），0.8μL Forward Primer（10μmol·L-1），0.8μL Reverse Primer（10μmol·L-1），1μL模板DNA（質(zhì)量濃度20～60 ng·μL-1），7.4μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；94℃變性10 s；55℃退火15 s；72℃延伸7 s，34次循環(huán)，72℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6數(shù)據(jù)分析

使用Image J v2.9.0軟件分析花粉的極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、花粉粒形狀、花粉大小、條脊寬、溝脊寬和網(wǎng)孔密度等形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)（n=10）。花粉形態(tài)描述主要參考《孢粉學(xué)手冊(cè)》[12]，花粉粒形狀按極赤比（P/E）劃分，P/E＞2為超長(zhǎng)球形，2≥P/E＞1.14為長(zhǎng)球形。使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和聚類分析。在單因素方差分析中，采用Duncan’s法進(jìn)行差異比較，對(duì)花粉數(shù)據(jù)應(yīng)用平均連鎖法，并基于歐氏距離進(jìn)行聚類分析。使用Photoshop 2021軟件對(duì)圖像進(jìn)行標(biāo)注和組圖處理。

2結(jié)果與分析

2.1花粉微觀形態(tài)特征

2.1.1極性、對(duì)稱類型及萌發(fā)器官如圖3所示，所有供試材料的花粉粒均為單?；ǚ?，花粉的赤道面均可將其分割為對(duì)稱的兩部分，即花粉為等極?；ǚ劬哂?個(gè)對(duì)稱面，呈輻射對(duì)稱，并且具有3個(gè)環(huán)狀孔溝，三溝均勻垂直于赤道分布。根據(jù)NPC分類系統(tǒng)[12]，所有供試材料的花粉均屬于N3P4C5型。

2.1.2形狀及大小所有供試材料花粉的極面觀均為三裂圓形，赤面觀均為長(zhǎng)橢圓形，但種質(zhì)間的極軸與赤道軸長(zhǎng)度存在一定差距。由表2可知，所有花粉的極軸長(zhǎng)度為36.64～44.83μm，均值40.91μm，根據(jù)Erdtman[12]的花粉大小分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的所有供試材料的花粉均屬于中等大?。?5～50μm）。但四月李的花粉極軸長(zhǎng)度為36.64μm，顯著小于其他李種質(zhì)；三月李的花粉極軸長(zhǎng)度為44.83μm，在供試材料中最長(zhǎng)；兩者與蜂糖李花粉在極軸長(zhǎng)度上差距較大。黃皮、青皮和一點(diǎn)紅蜂糖李的花粉極軸長(zhǎng)度相似，三者的極軸長(zhǎng)平均值約為40.51μm。

所有供試材料花粉的赤道軸長(zhǎng)度平均值為22.04μm，不同李種質(zhì)的花粉在赤道軸上差距較大，蜜李1號(hào)、晚熟青脆李、四月李、三月李的赤道軸長(zhǎng)度小于蜂糖李與其他李種質(zhì)。在蜂糖李中，一點(diǎn)紅蜂糖李的花粉赤道軸稍長(zhǎng)于黃皮與青皮蜂糖李。根據(jù)極赤比劃分花粉形狀，除蜜李1號(hào)、晚熟青脆李、三月李為超長(zhǎng)球形外（P/E＞2），蜂糖李與其他李種質(zhì)皆為長(zhǎng)球形（2≥P/E＞1.14）。

2.1.3外壁紋飾供試?yán)罘N質(zhì)的外壁紋飾均為“條紋-穿孔”，即由條紋與穿孔組成，條脊大部分接近縱向平行排列，但不同種質(zhì)在條紋與穿孔細(xì)節(jié)上存在較大差異，例如條紋走向、條紋疏密程度、孔頻等（表3）。

在蜂糖李的3個(gè)品系中，花粉差異主要體現(xiàn)在外壁紋飾特征上。黃皮蜂糖李的脊寬相對(duì)較大，而青皮蜂糖李與一點(diǎn)紅蜂糖李的脊寬數(shù)值相近，三者在脊間距方面差異相對(duì)較小。此外，在蜂糖李的3個(gè)品系中，一點(diǎn)紅蜂糖李的孔頻顯著小于其他兩個(gè)品系，孔徑顯著小于青皮蜂糖李，與黃皮蜂糖李差異不顯著。蜂糖李與其他供試種質(zhì)在外壁紋飾特征上也存在較大差異。蜜李1號(hào)、冰脆李和三華李的脊寬相對(duì)較小，而安順本地晚熟李、臺(tái)灣蜜李和三月李的脊寬較大，上述6個(gè)種質(zhì)在脊寬上與蜂糖李存在顯著差異。此外，安順本地晚熟李在脊間距上顯著大于其他供試?yán)罘N質(zhì)，而四月李則小于其他李種質(zhì)。

2.1.4聚類分析結(jié)果根據(jù)極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、極赤比、花粉形狀、脊寬、脊間距、孔徑、孔頻等8項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)供試?yán)罘N質(zhì)的孢粉數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。其中，花粉形狀作為描述性特征，因而在聚類分析中將其數(shù)字化，長(zhǎng)球形與超長(zhǎng)球形分別編號(hào)為0與1。聚類分析結(jié)果如圖4所示，顯示了花粉的相似度，同時(shí)有助于確定不同種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。

在歐氏平方距離為20時(shí)，供試的李種質(zhì)被劃分為兩大組，其中四月李獨(dú)立成一組。而在歐氏平方距離為15時(shí)，供試的李種質(zhì)被劃分為三大組，四月李和三月李被分開(kāi)，表明他們的花粉形態(tài)與蜂糖李存在較大差異，親緣關(guān)系可能較遠(yuǎn)。與此同時(shí)，3個(gè)蜂糖李品系與打幫李、安順本地晚熟李、臺(tái)灣蜜李被聚為最小的一支，這說(shuō)明他們的花粉形態(tài)相似。

2.2蜂糖李分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與篩選

筆者在本研究中設(shè)計(jì)并使用了多對(duì)引物用于蜂糖李分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與篩選，最終篩選到2對(duì)引物用于鑒別蜂糖李，他們?cè)诒狙芯康?2個(gè)李種質(zhì)中均成功擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，引物序列如表4所示。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究篩選的引物的特異性和準(zhǔn)確性，筆者額外收集了來(lái)自中國(guó)不同地理區(qū)域的12個(gè)李種質(zhì)的DNA樣本，進(jìn)行InDel分子標(biāo)記的驗(yàn)證分析。這些樣本主要包括西南地區(qū)的粉黛脆李、鳳凰李、脆紅李；北方地區(qū)的國(guó)峰、大紅袍、黃干核；華南地區(qū)的嶺溪李；華東地區(qū)的檇李、奈李；以及杏李中的恐龍蛋、味帝和用于觀賞的種質(zhì)紫葉李。

使用引物P1-21檢測(cè)時(shí)，蜂糖李與臺(tái)灣蜜李、黃干核李、嶺溪李帶型一致，為雙條帶，而其他李種質(zhì)表現(xiàn)為單帶型。當(dāng)使用引物P4-46進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，蜂糖李與三華李的帶型相同，與其他李種質(zhì)的帶型均存在差異，盡管粉黛脆李、鳳凰李等種質(zhì)也表現(xiàn)為雙條帶，但其中一條帶的位置在500bp以下，與蜂糖李和三華李明顯不同。經(jīng)多次PCR檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定一致，因此使用引物P1-21與P4-46結(jié)合，可以區(qū)分出蜂糖李與本研究中所用的其他李種質(zhì)（圖5）。

同時(shí)，筆者還利用重測(cè)序數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)到的InDel位點(diǎn)，對(duì)蜂糖李的3個(gè)品系，即黃皮、青皮和一點(diǎn)紅，進(jìn)行了分子標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)。經(jīng)過(guò)一系列的引物篩選，筆者發(fā)現(xiàn)標(biāo)記P3-38可在3個(gè)蜂糖李品系中經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不同的條帶，黃皮蜂糖李在100bp位置產(chǎn)生一個(gè)特異的條帶，青皮蜂糖李在100～250 bp之間產(chǎn)生一個(gè)特異的條帶，而一點(diǎn)紅蜂糖李均未發(fā)現(xiàn)有上述兩個(gè)特異條帶。因此，利用該引物可有效區(qū)分蜂糖李的3個(gè)主要品系（圖5）。

3討論

3.1中國(guó)李的花粉形態(tài)特征及外壁紋飾差異

本研究中12個(gè)供試?yán)罘N質(zhì)的花粉均為單?；ǚ?，按照極性、對(duì)稱類型以及萌發(fā)器官的特征，他們被劃分為NPC分類系統(tǒng)中的N3P4C5類型。供試?yán)罘N質(zhì)花粉的形狀為長(zhǎng)球形或超長(zhǎng)球形，極面觀呈三裂圓形，赤面觀則呈長(zhǎng)橢圓形，外壁紋飾由條紋與穿孔構(gòu)成。在前人研究中，李屬植物花粉的赤道軸與極軸長(zhǎng)度接近，形狀為近球形，例如部分杏品種[13]以及喜馬拉雅臭櫻[14]，但更多的研究表明李花粉通常為長(zhǎng)球形或超長(zhǎng)球形，如?李[15]、多數(shù)歐洲李[16-17]，這些觀察結(jié)果與本研究一致，同時(shí)在NPC分類上也與本研究的結(jié)果相符。

在親緣關(guān)系較近的植物花粉中，花粉外觀的差異更多體現(xiàn)于外壁紋飾上，外壁紋飾對(duì)種質(zhì)鑒定與分類的研究具有重要意義[18]。在獼猴桃屬植物中，花粉外壁紋飾可分為條紋、規(guī)則瘤狀、不規(guī)則瘤狀、小溝狀或穿孔等4種類型，判別花粉外壁紋飾對(duì)其分類與分組有著較大價(jià)值[19]。同時(shí)，在龍膽科[20]、鳳仙花[4]等植物中也發(fā)現(xiàn)了同科、同屬的外壁紋飾上存在差異的現(xiàn)象。在李屬植物中，花粉的外壁紋飾被發(fā)現(xiàn)有條紋-穿孔、腦紋-穿孔、疣狀-穿孔、穿孔但表面較光滑、條紋無(wú)穿孔等[15，17]。全球主要的李栽培與商業(yè)品種為歐洲李或中國(guó)李，他們?cè)趪?guó)際上均被劃分在真李組內(nèi)[21]。本研究供試種質(zhì)，包括貴州本地李種質(zhì)、廣東李種質(zhì)與引進(jìn)種質(zhì)，均為二倍體的中國(guó)李，在外壁紋飾上的表現(xiàn)均為條紋-穿孔，與前人對(duì)福建產(chǎn)李種質(zhì)?李的發(fā)現(xiàn)一致[15]，這可能說(shuō)明了原產(chǎn)自南方的李種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較為密切，這與魏瀟等[22]的觀點(diǎn)相符。

因此，筆者認(rèn)為李屬花粉的大小、形狀、極面與赤面觀上的差距較小，李屬植物中不同種間的差異主要集中于外壁紋飾上。在親緣關(guān)系較近的同一組間，外壁紋飾的類型差距也相對(duì)較小，主要的差異表現(xiàn)在外壁紋飾的孔頻、孔徑、脊寬和脊間距上。在本研究的3個(gè)蜂糖李品系中，一點(diǎn)紅蜂糖李的外壁紋飾的孔頻、孔徑與其余品系存在一定的差距，蜂糖李與其他種質(zhì)間的差異也主要集中于上述特征，孢粉學(xué)中的外壁紋飾特征能為鑒別蜂糖李及其品系提供一定的參考信息。

3.2蜂糖李與四月李的孢粉學(xué)差異及進(jìn)化程度

通過(guò)對(duì)花粉外觀和外壁紋飾數(shù)據(jù)的聚類分析，筆者發(fā)現(xiàn)蜂糖李與三月李、四月李之間存在較大的差距，這暗示他們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)中，從種苗到果實(shí)銷售過(guò)程中，四月李常與蜂糖李發(fā)生混淆，但他們無(wú)論從管理到果實(shí)品質(zhì)上都存在較大的差異。孢粉學(xué)上的較大差異對(duì)蜂糖李與四月李的區(qū)分具有一定的參考價(jià)值，孢粉學(xué)可以作為區(qū)分蜂糖李與四月李的輔助方法。

植物花粉大小的進(jìn)化趨勢(shì)在不同的研究中存在不同的觀點(diǎn)。在一些植物中，如玉蘭亞屬[23]和枇杷[24]，認(rèn)為花粉由大到小進(jìn)化。然而，也有研究認(rèn)為花粉由小型演化為大型[18，25]。在外層紋飾的進(jìn)化趨勢(shì)上，普遍認(rèn)為植物花粉的復(fù)雜性隨著進(jìn)化程度的增加而增加。外壁紋飾通常呈現(xiàn)從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從條紋到穿孔、從顆粒與棒刺狀到條紋網(wǎng)狀的演化規(guī)律[26-27]。在前人對(duì)中國(guó)李的孢粉學(xué)研究中，中國(guó)李花粉通常表現(xiàn)出較為規(guī)則的條紋結(jié)構(gòu)且穿孔較少，因此認(rèn)為中國(guó)李的進(jìn)化程度相對(duì)較低[28]。在本研究的供試?yán)罘N質(zhì)中，多數(shù)為大型花粉，條紋較為規(guī)則，條脊主要呈波浪形或條形，存在少量的分支與交叉。與其他供試種質(zhì)相比，四月李的花粉條紋較密，孔徑相對(duì)較小。四月李在貴州的種植歷史相對(duì)較久，屬于較為原始的種質(zhì)，其花粉外壁紋飾特征在供試種質(zhì)中進(jìn)化程度也相對(duì)更低。

3.3分子標(biāo)記與孢粉學(xué)結(jié)合在種質(zhì)鑒別中的準(zhǔn)確性

花粉作為植物的繁殖器官，其結(jié)構(gòu)主要由基因型決定，受環(huán)境等外部因素的影響較小[12]。然而，由于在不同的研究中對(duì)花粉的處理和保存方法存在差異，以及花粉外壁紋飾特點(diǎn)的判定標(biāo)準(zhǔn)不夠一致，存在主觀性，因此不能單純依賴孢粉學(xué)來(lái)進(jìn)行種質(zhì)區(qū)分和鑒別[18]。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合基因分析和形態(tài)學(xué)等多方面的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合判定才更為準(zhǔn)確。

在DNA分子標(biāo)記的實(shí)際應(yīng)用中，種質(zhì)鑒別是最廣泛的應(yīng)用之一，主要使用共顯性標(biāo)記，如SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記。桃[29]、山杏[30]等物種的研究已表明了SSR標(biāo)記在構(gòu)建指紋圖譜或分子身份證方面的重要性。隨著全基因組重測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，InDel標(biāo)記在果樹(shù)的真假雜種鑒定方面具有優(yōu)越性[31]。王玨等[32]對(duì)中國(guó)櫻桃進(jìn)行了InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，并發(fā)現(xiàn)在薔薇科果樹(shù)中具有較強(qiáng)的通用性。湯雨晴等[8]利用InDel標(biāo)記鑒別金蘭柚，利用最少兩對(duì)InDel分子標(biāo)記即可區(qū)分金蘭柚與其他47個(gè)柚品種，證明使用引物組鑒別種質(zhì)具有一定的可靠性。筆者利用重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出的InDel分子標(biāo)記P1-21與P4-46可以區(qū)分蜂糖李與供試的其他21個(gè)李種質(zhì)。在本研究中貴州本地的李種質(zhì)如打幫李、安順本地晚熟李與蜂糖李在孢粉上差距較小，而他們?cè)跇?biāo)記P1-21與P4-46的鑒定中表現(xiàn)出不同的帶型，能夠直觀、快捷地對(duì)他們進(jìn)行鑒別區(qū)分。

孢粉學(xué)結(jié)果雖然能夠表達(dá)更多的遺傳信息，可作為判斷種質(zhì)之間親緣關(guān)系的一種重要的參考依據(jù)，但作為品種鑒別的方法，具有一定的局限性。在本研究中，一點(diǎn)紅蜂糖李的花粉外壁紋飾與其他品系存在差異，同時(shí)標(biāo)記P3-38能區(qū)分蜂糖李中的黃皮、青皮和一點(diǎn)紅。這對(duì)引物能在任何生長(zhǎng)階段為這3個(gè)品系的鑒別提供參考，彌補(bǔ)了孢粉學(xué)上存在的時(shí)效性問(wèn)題。但未來(lái)還需進(jìn)一步對(duì)上述引物的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)蜂糖李中的品系進(jìn)行進(jìn)一步的劃分，并開(kāi)發(fā)更多的分子標(biāo)記以及其他鑒別方法，完善蜂糖李的鑒別體系。

4結(jié)論

筆者在本研究中揭示了蜂糖李與三月李、四月李在孢粉特征上存在顯著區(qū)別，不同品系蜂糖李孢粉差距集中在外壁紋飾上。筆者還開(kāi)發(fā)了2對(duì)In-Del分子標(biāo)記，聯(lián)合使用能夠?qū)⒎涮抢钆c其他21份李種質(zhì)有效區(qū)分，同時(shí)還篩選出一對(duì)InDel分子標(biāo)記，可用于區(qū)分蜂糖李中的3個(gè)品系。

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