摘要：目的 "運用生物信息學及免疫信息學方法分析結核分枝桿菌（Mtb）Rv3203蛋白的結構特征，為研究Rv3203蛋白在Mtb感染中的功能提供基礎。方法 "利用信息學軟件分別預測Rv3203蛋白的理化性質、溶解度、跨膜區(qū)、信號肽、亞細胞定位、糖基化位點、磷酸化位點、相互作用蛋白、免疫原性、抗原性、毒性、致敏性，以及T、B細胞抗原表位和二級結構，并對蛋白的三級結構進行建模，最后對Rv3203蛋白進行密碼子優(yōu)化、計算機克隆和構建進化樹。結果 "Rv3203蛋白由224個氨基酸組成，理論等電點為4.68，為結構穩(wěn)定的弱疏水性蛋白；無跨膜區(qū)和信號肽，定位于細胞質，具有1個糖基化位點和11個磷酸化位點；與lipD、lipE、lipP、lipZ、amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204發(fā)生相互作用，參與Mtb的多種生物學過程；免疫原性為3.4211，抗原性為0.6533，無毒性，無致敏性；含5個CTL表位、1個Th表位和4個B細胞表位；二級結構和三級模型含大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲；經密碼子優(yōu)化后可在大腸桿菌中克隆并高效表達；此外，Mtb的Rv3203蛋白還與Mycobacterium canettii CIPT 140010059具有高度同源性。結論 "Rv3203蛋白是一個結構穩(wěn)定且具有熱穩(wěn)定性的酸性蛋白，具有免疫原性和抗原性，無毒性和致敏性，含多個T/B細胞表位，可在體外克隆并高效表達，參與Mtb的多種生物學過程及調控宿主的免疫應答反應。

關鍵詞：結核分枝桿菌；Rv3203；生物信息學；免疫信息學

中圖分類號：R378.911 " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.21.005

文章編號：1006-1959（2024）21-0023-07

Bioinformatics and Immunoinformatics Analysis of Mycobacterium Tuberculosis Rv3203 Protein

YU Haiyan，REN Qin，MENG Yu，LI Guanghua，YANG Guoping

（Department of Medical Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Objective "To analyze the structural characteristics of Mycobacterium tuberculosis （Mtb） Rv3203 protein by bioinformatics and immunoinformatics methods， and to provide a basis for studying the function of Rv3203 protein in Mtb infection.Methods "The physicochemical properties， solubility， transmembrane region， signal peptide， subcellular localization， glycosylation site， phosphorylation site， interacting protein， immunogenicity， antigenicity， toxicity， allergenicity， T and B cell epitopes and secondary structure of Rv3203 protein were predicted by bioinformatics software， and the tertiary structure of the protein was modeled. Finally， the codon optimization， computer cloning and phylogenetic tree construction of Rv3203 protein were carried out.Results "Rv3203 protein was composed of 224 amino acids， and the theoretical isoelectric point was 4.68， which was a weakly hydrophobic protein with stable structure. No transmembrane region and signal peptide， located in the cytoplasm， with 1 glycosylation site and 11 phosphorylation sites; it interacted with lipD， lipE， lipP， lipZ， amiB2， amiC， bpoC， Rv0183， Rv1367c and Rv3204， and participated in various biological processes of Mtb. Immunogenicity was 3.4211， antigenicity was 0.6533， no toxicity， no sensitization; it contained 5 CTL epitopes， 1 Th epitope and 4 B cell epitopes. The secondary structure and tertiary model contained a large number of α-helices and random coils; after codon optimization， it could be cloned and efficiently expressed in E.coli; in addition， Mtb Rv3203 protein had high homology with Mycobacterium canettii CIPT 140010059.Conclusion "Rv3203 protein is an acidic protein with stable structure and thermal stability， with immunogenicity and antigenicity， non-toxicity and sensitization. It contains multiple T/B cell epitopes and can be cloned and efficiently expressed in vitro. It participates in various biological processes of Mtb and regulates the immune response of the host.

Key words：Mycobacterium tuberculosis;Rv3203;Bioinformatics;Immunoinformatics

結核病是一種主要由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染引起的傳染性疾病，是威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題[1，2]。Mtb細胞壁富含的脂質，編碼參與脂質/酯代謝的蛋白及酶，在細菌的生存、毒力發(fā)揮、與宿主細胞的相互作用和調節(jié)宿主的免疫應答方面發(fā)揮重要作用，有利于Mtb抵御宿主惡劣的胞內環(huán)境，促進Mtb的感染與致病。休眠期的Mtb處于代謝下調的非復制狀態(tài)，可逃避宿主的免疫應答，并對常見抗結核藥物不敏感，少數(shù)的Mtb酶在潛伏感染期間保持上調，可能成為新的治療策略潛在靶點[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb“Lip”家族（LipC至LipZ）的LipV是由Rv3203基因編碼的一種酯酶/脂肪酶，參與Mtb的脂質/酯代謝[5]，在Mtb進入休眠期間和建立休眠后基因表達會上調，可能通過脂肪酶Rv3203降解三酰甘油（triacylglycerol， TAG）以釋放脂肪酸，提供Mtb生存的能量來源[6]。由于Rv3203在Mtb的休眠和再激活期間發(fā)揮關鍵的代謝作用，并對Mtb的細胞內存活和體內感染至關重要，具有作為研發(fā)抗Mtb感染治療靶點的潛力，用于結核病的預防。生物信息學技術可快速預測蛋白質和病原體的結構和功能，以及人類免疫應答機制，實現(xiàn)探索與了解病原體的致病原因，制定更科學的預防和治療方案，用于設計新的藥物和開發(fā)疫苗。此外，免疫信息學的快速發(fā)展加速了靶抗原中免疫優(yōu)勢候選表位的篩選，提高疫苗生產效率，被廣泛用于設計針對病毒、細菌和寄生蟲的疫苗[7，8]。為此本研究通過信息學軟件分析Rv3203蛋白的性質、結構及功能特征，旨在為深入解析Rv3203蛋白的生物學功能，闡明其在Mtb感染中的功能及以Rv3203為靶點的抗Mtb感染治療提供依據(jù)，并為抗結核疫苗候選優(yōu)勢抗原的篩選，以及研發(fā)含Rv3203蛋白表位的新型表位疫苗提供基礎。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 "從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取MtbRv3203的基因序列及氨基酸序列，GeneID為888133，protein_id為NP_217719.1。

1.2方法 "使用ExpasyProtparam軟件預測蛋白的理化性質，包括蛋白質分子式、氨基酸數(shù)、相對分子質量、理論等電點（PI）、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂族指數(shù)、體外和體內半衰期以及親水性總平均值（GRAVY）。使用Protein Sol預測蛋白質的溶解度，若高于實驗溶解度數(shù)據(jù)庫（PopAvrSol）的平均值0.45，則預測為可溶性蛋白[9]。分別使用DeepTMHMM、SingaIP-5.0 Server、PSORTb V3.0預測蛋白的跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位。使用NetNGlyc-1.0 Server、NetPhos 3.1 Server預測蛋白的糖基化及磷酸化位點。STRING在線軟件檢索與Rv3203相互作用的蛋白。使用Class Ⅰ Immunogenicity、VaxiJenv2.0和ToxinPred分別預測蛋白的免疫原性、抗原性和毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預測蛋白的致敏性[10]。用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、NetMHCpan 4.1 Server3種軟件綜合分析CTL表位，以MHC Ⅰ類分子亞型HLA-A2*0201、HLA-A3*0301和HLA-B7*0702，氨基酸長度為9，預測Rv3203的CTL表位，對篩選的強結合表位使用Class Ⅰ Immunogenicity預測表位的免疫原性，VaxiJenv2.0預測表位的抗原性；ToxinPred預測表位的毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預測表位的致敏性，確定Rv3203的免疫顯性CTL表位。使用SYFPEITHI、NetMHCⅡpan4.0Server2種軟件綜合分析Th表位，以MHCⅡ類分子亞型HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501，氨基酸長度為15，預測Rv3203的Th表位，對篩選的強結合表位使用Class Ⅰ Immunogenicity預測表位的免疫原性；VaxiJenv2.0預測表位的抗原性；IFNepitope預測IFN-γ誘導性，選擇預測陽性表位[11]；ToxinPred預測毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預測致敏性，確定Rv3203的免疫顯性Th表位。使用ABCpred預測Rv3203蛋白的線性B細胞表位，表位長度為20，閾值為0.51，并分別使用Class Ⅰ Immunogenicity、VaxiJenv2.0和ToxinPred軟件預測所篩選表位的免疫原性、抗原性和毒性；AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預測致敏性，確定Rv3203蛋白的免疫顯性B細胞表位。使用ElliPro軟件預測構象B細胞表位，有助于設計基于肽的疫苗和改進B細胞表位的預測[12]。使用PSIPRED和Prabi軟件預測Rv3203蛋白的二級結構[13]，I-TASSER（https：//zhanggroup.org//I-TASSER/）預測蛋白三級結構的3D模型，可通過模板建模得分（TM值）、建模置信分數(shù)（C評分）和均方根偏差（RMSD）對模型進行評分，C評分越高，模型的精度越高[14]。使用Java密碼子適應工具（JCAT）（https：//jcat.de/），以大腸桿菌K12菌株作為宿主，輸出密碼子優(yōu)化指數(shù)（CAI）和GC含量百分比兩個參數(shù)，CAI的理想值為1，GC含量為30%～70%。使用SnapGene軟件完成計算機克隆，在pET28a（+）質粒的SacⅠ和XbaⅠ限制位點之間插入Rv3203基因序列。通過NCBI-BLAST的Protein BLAST對Rv3203的蛋白氨基酸序列進行同源性分析，并使用MEGA軟件構建進化樹。

2結果

2.1 Rv3203蛋白的理化性質和溶解度分析 "Rv3203蛋白分子式為C1057H1673N291O310S7，含224個氨基酸，相對分子質量為23 642.10 Da，PI值為4.68，不穩(wěn)定性指數(shù)為33.49，值小于40，表明該蛋白結構穩(wěn)定；脂族指數(shù)越高，蛋白的熱穩(wěn)定性越好，該蛋白脂肪指數(shù)為105.94，表明其具有較高的熱穩(wěn)定性；Rv3203蛋白在哺乳動物網織紅細胞的體外半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌的體內半衰期分別高于20 h和10 h，蛋白質半衰期越長表明其在細胞內越穩(wěn)定；GRAVY為0.209，表明蛋白具有疏水性；溶解度為0.689，大于0.45，表明Rv3203蛋白為可溶性蛋白，可原核表達于大腸桿菌宿主內獲取該蛋白。Rv3203蛋白的溶解度分析見圖1。

2.2 Rv3203蛋白的跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位預測 "結果顯示Rv3203蛋白無跨膜結構（圖2A），無信號肽（圖2B），可能定位于細胞質，表明該蛋白不屬于跨膜蛋白，不是分泌蛋白。

2.3 Rv3203蛋白的糖基化及磷酸化位點預測 "預測顯示蛋白在第28位有一個糖基化位點（圖3A）；存在11個磷酸化位點，其中含6個絲氨酸磷酸化位點、2個蘇氨酸磷酸化位點和3個酪氨酸磷酸化位點（圖3B）；蛋白質的磷酸化在細胞信號傳導過程中起重要作用，表明Rv3203蛋白參與Mtb感染期間的細胞信號傳遞。

2.4 Rv3203蛋白的相互作用蛋白分析 "結果顯示Rv3203蛋白可與lipD、lipE、lipP、lipZ、amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204等多個蛋白發(fā)生相互作用（圖4）。其中l(wèi)ipD、lipE、lipP、lipZ為脂肪酶/酯酶，屬于Mtb的Lip家族，參與Mtb的脂質/酯質代謝過程；amiB2和amiC為酰胺酶，參與氨基酸代謝過程；bpoC為過氧化物酶，參與多種生化代謝過程，包括脂質代謝、氧化代謝和解毒等過程；Rv0183為可能的溶血磷脂酶，在慢性感染期間參與外源性宿主脂質的水解；保守蛋白Rv1367c與來自枯草芽孢桿菌的青霉素結合蛋白相似，可能為抗生素的作用靶點，與細菌耐藥性有關，對臨床用藥及藥物開發(fā)提供參考；Rv3204為一種DNA甲基轉移酶，參與DNA的甲基化修飾過程，在基因的表達調控和許多天然化合物的合成中發(fā)揮重要作用；Rv3203與以上多種蛋白及酶相互作用，有助于揭示以Rv3203蛋白為核心的調控通路，提示Rv3203蛋白可能參與Mtb的脂質/酯質代謝、氨基酸代謝、氧化代謝、解毒、磷脂代謝、DNA的甲基化以及耐藥性過程。

2.5 Rv3203蛋白的免疫原性、抗原性、毒性和致敏性 "結果顯示該蛋白免疫原性為3.4211，抗原性為0.6533，無毒性，無致敏性，表明Rv3203蛋白具有良好的免疫原性和抗原性，無毒性和致敏性，可作為結核疫苗的候選免疫優(yōu)勢蛋白。

2.6 CTL表位預測 "預測篩選Rv3203蛋白的CTL強結合表位，選擇免疫原性大于0，抗原性大于0.4，無毒性和致敏性的表位，綜合分析后篩選出5個優(yōu)勢CTL抗原表位（表1），可與抗原呈遞細胞上的MHCI分子結合形成抗原肽分子復合物，供CD8+T細胞識別后分化為CTL細胞，介導細胞免疫應答反應，發(fā)揮對Mtb的特異性識別和殺傷作用。

2.7 Th表位分析 "預測篩選Rv3203蛋白的強結合表位，選擇免疫原性大于0，抗原性大于0.4，IFN-γ誘導陽性；無毒性和致敏性的表位，綜合分析后篩選出1個MHCⅡ類分子亞型為HLA-DRB1*0401，起始氨基酸位置為20，表位序列為AAPWTIDANVSALAA，SYFPEITI得分為28，NetMHCⅡpan 4.0 server等級為0.08，免疫原性為0.369 52，抗原性為1.0196，IFN-γ得分為2，誘導陽性的優(yōu)勢Th表位，表明Rv3203蛋白能特異性激活T淋巴細胞反應，產生IFN-γ，誘導Th型細胞免疫保護反應。

2.8線性B細胞表位預測 "結果顯示該蛋白含4個ABCpred得分高于0.80，免疫原性大于0，抗原性大于0.4，且無毒性和致敏性的B細胞抗原表位（表2），表明Rv3203蛋白可誘導體液免疫反應。

2.9構象B細胞表位預測 "結果顯示，Rv3203蛋白含125個殘基，分布在4個構象B細胞表位中，值范圍為0.556至0.743（表3）；位于蛋白質表面的構象表位易與B細胞的BCR受體結合，而Rv3203蛋白含有多個構象B細胞，表明該蛋白具有較強誘導體液免疫反應的能力。

2.10 Rv3203蛋白的二級結構和三級結構 "預測結果顯示，Rv3203蛋白的二級結構含44.20%的α-螺旋、11.16%的延伸鏈和44.64%的無規(guī)則卷曲（圖5A）；預測的5個3D模型C評分分別為-0.34、-1.02、-0.35、-0.73和-1.68，因此選擇C評分為-0.34作為模擬Rv3203的最佳3D模型（圖5B），TM得分為0.67±0.13，RMSD為6.3±3.8？魡；以上結果表明Rv3203蛋白的二、三級結構中含有大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，易形成抗原表位，有利于與抗體的結合。

2.11密碼子優(yōu)化與計算機克隆 "密碼子優(yōu)化可提高蛋白的體外表達水平優(yōu)化后Rv3203蛋白的CAI值為1，GC含量為59.2%，表明該蛋白可在大腸桿菌（K12株）宿主中高效表達。將優(yōu)化的Rv3203基因序列插入pET28a質粒中（圖6），獲得含6His標簽序列的重組質粒，表明Rv3203蛋白可與pET28a表達載體經雙酶切后連接，并與載體的標簽融合表達，實現(xiàn)在大腸桿菌中的克隆、表達及純化。

2.12 Rv3203蛋白的同源性及進化分析 "H37Rv的Rv3203蛋白與Mycobacterium tuberculosis complex、Mycobacterium、Mycobacterium canettii、Mycobacterium canettii CIPT 140010059、Mycobacterium tuberculosis TRS13、Mycobacterium tuberculosis variant bovis、Mycobacterium canettii CIPT 140070010、Mycobacterium decipiens的氨基酸序列具有高度相似性（＞90%），對包括Mtb在內的9個Rv3203蛋白進行多序列比對并構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示其與Mycobacterium canettii CIPT 140010059聚為一支，說明它們在進化上彼此較近，可能來自相同的祖先。此外還發(fā)現(xiàn)，Mycobacterium decipiens與上述分枝桿菌相距較遠，單獨聚為一支（圖7）。

3討論

Mtb脂質含量與其毒力密切相關，細胞壁中脂質含量約占干重的60%，研究表明Mtb編碼大量參與脂質/酯代謝的蛋白質，與其毒力和致病性密切相關，因此干擾Mtb的脂質/酯代謝是預防Mtb病感染的一種具有潛力的策略[4]。對Mtb脂質/酯代謝途徑中特定脂肪酶/酯酶進行基因功能研究可為發(fā)現(xiàn)Mtb的發(fā)病機制提供新的方法。

生物信息學方法分析顯示，Rv3203為結構穩(wěn)定的酸性蛋白，且具有較高的熱穩(wěn)定性，有利于其在Mtb感染的體溫升高期間仍保持酶活性和穩(wěn)定性。Singh G等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Rv3203在酸性條件下特異性誘導表達，結構仍保持穩(wěn)定，本研究與上述研究一致。Rv3203作為一種酸誘導蛋白，在Mtb抵抗巨噬細胞內的酸性環(huán)境發(fā)揮著重要作用，有利于Mtb的存活與感染。此外，Rv3203蛋白屬于非跨膜蛋白，非分泌蛋白，主要定位于細胞質，在細胞質內發(fā)揮功能；存在多個磷酸化位點，可能參與酶的催化激活，調控Mtb細胞間的信號傳遞，與多種Lip家族蛋白相互作用，如lipD、lipE、lipP、lipZ等，參與構成Mtb的脂質/酯質；還與amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204相互作用，溶血性磷脂酶Rv0183在Mtb磷脂代謝中發(fā)揮關鍵作用，可在宿主巨噬細胞細胞中誘導炎癥反應和細胞凋亡，在Mtb感染的毒力和發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[16，17]。Rv3204蛋白刺激人外周血單個核細胞（PBMC）后可引發(fā)強烈的T細胞反應，促進IL-12p40分泌，產生保護性免疫反應[18]。因此，Rv3203蛋白可能參與Mtb的脂質/酯質和磷脂代謝，調控宿主細胞的免疫應答，維持Mtb在宿主細胞內的存活與感染；還可能與Mtb的氨基酸代謝、氧化代謝、解毒、DNA的甲基化與耐藥性等過程有關。

免疫信息學分析可知，Rv3203蛋白具有良好免疫原性和抗原性，無毒性和致敏性，二、三級結構含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，有利于蛋白質結構穩(wěn)定，易形成多個與抗體結合的抗原表位，誘導較高的免疫反應。Mohammad O等[19]研究發(fā)現(xiàn)，古質體-Rv3203免疫的動物可誘導具有中樞和效應記憶標記物的CD4+/CD8+T淋巴細胞群的增加，引起強烈的記憶反應，對Mtb具有長期保護作用的潛力，可彌補BCG免疫效力時間短暫的缺陷；還可增強抗原呈遞細胞表面CD80（B7-1）和CD86（B7-2）共刺激分子的表達，促進T細胞活化與抗原處理呈遞，增強抗原應答信號；同時觀察到小鼠脾細胞分泌的IL-12和IFN-γ水平增加，引發(fā)比BCG和游離形式的Rv3203更顯著的Th1型免疫反應，顯著降低小鼠肺部和脾臟中的細菌負荷，誘導顯著的抗結核保護性免疫應答。這可能與Rv3203蛋白含多個免疫原性和抗原性良好，無毒性和致敏性的T細胞抗原表位，能誘導CD8+T細胞介導的CTL型細胞免疫反應和具有免疫保護作用的Th型細胞免疫反應相關聯(lián)。該蛋白還含多個線性和構象B細胞表位，可刺激機體產生體液反應。因此，后續(xù)實驗可對這些表位進行實驗驗證，為進一步明確Rv3203蛋白在Mtb感染中介導的免疫應答作用及候選疫苗表位的篩選提供實驗依據(jù)。此外，蛋白質在宿主中的有效克隆和表達對于疫苗的研發(fā)也至關重要，對Rv3203的基因進行密碼子優(yōu)化可實現(xiàn)該蛋白在大腸桿菌（K12株）宿主中高效表達。構建MtbRv3203基因的進化樹發(fā)現(xiàn)，其與Mycobacterium canettii CIPT 140010059具有較高的同源性，在進化上相距較近，可能來自相同祖先，有助于了解疾病根源與演變，對開發(fā)新藥物有重要指導意義。

綜上所述，Rv3203蛋白可在Mtb的休眠期誘導表達，參與Mtb的脂質/酯代謝，對其生存至關重要，還可參與Mtb調控宿主的免疫應答反應。本研究利用多種生物信息學和免疫信息學軟件初步分析了Rv3203蛋白的性質、結構以及功能，Rv3203蛋白的免疫學功能、致病機制，以及開發(fā)安全、有效的以Rv3203為靶點的抗Mtb感染治療新的靶標仍有待進一步研究。

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收稿日期：2023-10-31；修回日期：2023-11-08

編輯/肖婷婷