[摘要]"目的"探討七葉苷通過抑制蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase，PERK）/真核翻譯起始因子2A（eukaryotic"translation"initiation"factor"2A，eIF2A）/激活轉(zhuǎn)錄因子4（activating"transcription"factor"4，ATF4）信號通路改善肝細(xì)胞脂肪變性的治療作用和機(jī)制。方法"采用人源正常肝細(xì)胞系HL-7702，利用0.5mmol/L游離脂肪酸（free"fatty"acid，F(xiàn)FA）（油酸"："棕櫚酸=2"："1）誘導(dǎo)體外肝細(xì)胞脂肪變性模型，經(jīng)50μmol/L、200μmol/L七葉苷處理24h。測定細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine"transaminase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate"transaminase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和三酰甘油（triacylglycerol，TG）含量。采用尼羅紅脂肪熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴；采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。采用蛋白質(zhì)印跡（Western"blot，WB）檢測細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)量及PERK/eIF2A/ATF4信號通路相關(guān)蛋白和磷酸化水平。"""""結(jié)果"生化指標(biāo)檢測結(jié)果證實，50μmol/L和200μmol/L的七葉苷可顯著降低FFA誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)MDA、ALT和AST水平（Plt;0.05），并顯著增加細(xì)胞內(nèi)GSH水平（Plt;0.05）。WB結(jié)果顯示七葉苷可顯著降低細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)量（Plt;0.01）。尼羅紅染色和TG含量檢測結(jié)果證實七葉苷可顯著減少細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積和TG含量（Plt;0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示七葉苷處理后肝細(xì)胞內(nèi)PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca的表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.05）。在機(jī)制方面，七葉苷可顯著降低肝細(xì)胞中PERK、eIF2A和ATF4的磷酸化水平（Plt;0.05）。結(jié)論"七葉苷可通過調(diào)控PERK/eIF2A/ATF4信號通路改善肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，對維護(hù)肝細(xì)胞健康狀態(tài)起到積極作用。

[關(guān)鍵詞]"肝細(xì)胞；脂肪變性；脂質(zhì)代謝；蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/真核翻譯起始因子2A/激活轉(zhuǎn)錄因子4

[中圖分類號]"R575.5""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.013

Study"on"esculin"improve"lipid"accumulation"in"hepatocytes"by"inhibiting"the"PERK/eIF2A/ATF4"signaling"pathway

XU"Shuang，"HONG"Liang，"PAN"Anna，"WU"Yanghe，"YE"Xiaoting

Department"of"Infectious"Disease，"the"Third"Affiliated"Hospital"of"Wenzhou"Medical"University，"Wenzhou"325200，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"effect"and"mechanism"of"esculin"on"hepatocyte"steatosis"by"inhibiting"protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase"（PERK）/eukaryotic"translation"initiation"factor"2A"（eIF2A）/activating"transcription"factor"4"（ATF4）"signaling"pathway."Methods"Human"normal"liver"cell"line"HL-7702"was"used"to"induce"a"fatty"degeneration"model"of"hepatocytes"in"vitro"with"0.5mmol/L"free"fatty"acid"（FFA）"（oleic"acid"："palmitic"acid"=2"："1）"and"treated"with"50μmol/L，"200μmol/L"esculin"for"24h."After"the"cell"samples"were"broken"by"ultrasound，"the"supernatant"was"collected"and"the"contents"of"alanine"transaminase"（ALT），"aspartate"transaminase"（AST），"malondialdehyde"（MDA），"glutathione"（GSH）"and"triacylglycerol"（TG）"were"detected."Using"Nile"red"fat"fluorescence"staining"to"detect"intracellular"lipid"droplets;"Quantitative"reverse"transcriptase-"mediated"polymerase"chain"reaction"（qRT-PCR）"was"used"to"detect"the"transcription"levels"of"genes"related"to"intracellular"lipid"metabolism"processes."Western"blot"（WB）"was"used"to"detect"the"protein"expression"levels"of"pro"apoptotic"factors"Caspase-3"and"Bax，"as"well"as"PERK/eIF2A/ATF4"signaling"pathway"related"proteins"and"phosphorylation"levels"in"cells."Results"The"results"confirmed"that"treatments"of"50μmol/L"and"200μmol/L"of"esculin"significantly"decreased"the"levels"of"FFA"induced"MDA，"ALT"and"AST"in"hepatocytes"（Plt;0.05），"and"significantly"increased"the"levels"of"intracellular"GSH"（Plt;0.05）."WB"results"showed"that"esculin"treatment"could"significantly"reduce"the"protein"expression"levels"of"Caspase-3"and"Bax"（Plt;0.01）."The"results"of"Nile"red"staining"and"TG"content"detection"confirmed"that"esculin"treatment"could"significantly"reduce"the"accumulation"of"intracellular"lipid"droplets"and"TG"content"（Plt;0.05）."The"results"of"qRT-PCR"showed"that"the"expression"levels"of"PPARγ，"FASN，"Srebf1，"Dgat2，"Mvk"and"Acaca"in"hepatocytes"were"significantly"decreased"after"esculin"treatment"（Plt;0.05）."In"terms"of"mechanism，"the"phosphorylation"levels"of"PERK，"eIF2A"and"ATF4"in"hepatocytes"were"significantly"reduced"by"esculin"treatment"（Plt;0.05）."Conclusion"Esculin"could"improve"lipid"accumulation"in"hepatocytes"by"regulating"the"PERK/eIF2A/ATF4"signalling"pathway，"which"plays"a"positive"role"in"maintaining"the"healthy"state"of"hepatocytes.

[Key"words]"Hepatocyte;"Fatty"degeneration;"Lipid"metabolism;"PERK/eIF2A/ATF4

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic"fatty"liver"disease，NAFLD）被視為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，通常與肥胖、血脂異常、高血壓和糖尿病等癥狀相關(guān)[1-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)除在蛋白質(zhì)加工中發(fā)揮作用外，還與肝細(xì)胞中的脂質(zhì)合成密切相關(guān)[4-5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)過度堆積可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic"reticulum"stress，ERS），加重肝臟脂肪變性。雖然ERS通過短暫的未折疊蛋白反應(yīng)可防止脂肪變性，但NAFLD中長期且慢性的ERS可加重肝臟脂肪變性[6]。因此，通過減弱ERS可能是治療NAFLD的潛在策略。

在NAFLD中，蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase，PERK）/真核翻譯起始因子2A（eukaryotic"translation"initiation"factor"2A，eIF2A）/激活轉(zhuǎn)錄因子4（activating"transcription"factor"4，ATF4）信號通路調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪變性。七葉苷在急性肝損傷治療中具有顯著的抗氧化和抗炎作用[7]。研究表明七葉苷可改善單純性脂肪肝和NAFLD小鼠模型中肝臟脂肪變性[8-9]。在治療由蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NAFLD時，七葉苷通過增加沉默信息調(diào)節(jié)因子1的表達(dá)和抑制核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)信號通路，降低小鼠肝臟中的炎癥因子水平[10]。ATF4缺陷可降低肝臟PPARγ和抑制脂質(zhì)合成過程的作用[11]。本研究探討七葉苷通過PERK/eIF2A/ATF4通路對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的作用和機(jī)制。

1""材料與方法

1.1""細(xì)胞系及造模

人源正常肝細(xì)胞系HL-7702購自上海澤葉生物科技有限公司。HL7702細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清（美國ThermoFisher公司）和1%青霉素-鏈霉素抗生素濃縮液（美國ThermoFisher公司）的1640完全培養(yǎng)基（美國ThermoFisher公司）中，置于5%二氧化碳的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

在細(xì)胞造模方面，按每孔35萬個細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，次日用含0.5%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素抗生素濃縮液的1640饑餓培養(yǎng)基饑餓處理24h。隨機(jī)分為對照組、模型組、50μmol/L七葉苷組、200μmol/L七葉苷組。然后，更換新的饑餓培養(yǎng)基后，除對照組外，其余組加入0.5mmol/L游離脂肪酸（free"fatty"acid，F(xiàn)FA）（油酸"："棕櫚酸=2"："1）處理1h。50μmol/L七葉苷組和200μmol/L七葉苷組分別加入50μmol/L和200μmol/L七葉苷孵育24h后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞經(jīng)制樣后用于后續(xù)檢測實驗。油酸和棕櫚酸購自Sigma-Aldrich公司。

1.2""細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)檢測

細(xì)胞經(jīng)消化后，經(jīng)180g常溫離心10min后收集細(xì)胞，并在冰浴條件下使用超聲破碎，條件為功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次。細(xì)胞破碎液經(jīng)13"500g、4℃離心10min，收集上清液。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine"transaminase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate"transaminase，AST）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，并用于檢測細(xì)胞上清液中上述生化指標(biāo)。上清液蛋白濃度使用二喹啉甲酸（bicinchoninic"acid，BCA）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）測定。

1.3""細(xì)胞脂滴和三酰甘油檢測

采用尼羅紅脂肪熒光染色液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）染色10min后用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光猝滅劑[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]封片，用FV3000多光譜快速激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長：488nm）拍照和分析細(xì)胞脂滴。超聲破碎細(xì)胞后，三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定細(xì)胞TG含量。

1.4""定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

處理后的細(xì)胞樣品以Trizol法提取組織mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR"Green熒光染料（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）檢測目的基因的表達(dá)水平。檢測目的基因為脂質(zhì)代謝過程相關(guān)基因PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca。用GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.5""蛋白質(zhì)印跡

取處理后的細(xì)胞樣品加入100μl組織快速裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）裂解，用BCA試劑盒測定蛋白含量，使用濃度為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，300mA轉(zhuǎn)膜1.5h，用5%脫脂牛奶封閉1.5h，經(jīng)一抗4℃孵育過夜，二抗（1"："10000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1h，用ChemiDoc"XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測（美國伯樂實驗公司）。一抗PERK（1"："1000）、eIF2A（1"："1000）、磷酸化eIF2A（1"："1000）購自杭州戴格生物技術(shù)有限公司。一抗磷酸化PERK（1"："1000）、磷酸化ATF4（1"："1000）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。一抗ATF4（1"："2000）、Caspase-3（1"："2000）和Bax（1"："10000）及內(nèi)參GAPDH（1"："50000）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。采用蛋白質(zhì)印跡（Western"blot，WB）法對上述蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.6""統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad"Prsim"version"9.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用one-way"ANOVE分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""七葉苷改善FFA誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和凋亡

七葉苷處理經(jīng)FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著下降（Plt;0.01），且與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），見圖1A。與模型組比較，經(jīng)200μmol/L七葉苷處理后細(xì)胞內(nèi)GSH含量恢復(fù)至正常水平（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖1B。七葉苷處理經(jīng)FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ALT和AST含量恢復(fù)至正常水平（Pgt;0.05），見圖1C和圖1D。WB結(jié)果顯示模型組肝細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)量較對照組顯著增加（Plt;0.01），200μmol/L七葉苷處理后其表達(dá)量較模型組顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖1E和圖1F。

2.2""七葉苷通過脂質(zhì)代謝改善FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞脂肪變性

尼羅紅脂肪熒光染色結(jié)果表明，模型組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光顯示陽性的脂滴含量顯著增加（Plt;0.01），并廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)中，見圖2A和圖2B。與模型組比較，50μmol/L和200μmol/L七葉苷處理后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著下降（Plt;0.05，Plt;0.01），且隨著七葉苷濃度升高，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量顯著降低（Plt;0.01）。與模型組比較，50μmol/L和200μmol/L七葉苷處理后，細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低（Plt;0.01），見圖2C。與對照組比較，qRT-PCR結(jié)果顯示模型組肝細(xì)胞內(nèi)PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加（Plt;0.01），經(jīng)200μmol/L七葉苷處理后其表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖2D。

2.3""七葉苷下調(diào)PERK/eIF2A/ATF4信號通路

與對照組比較，模型組肝細(xì)胞中eIF2A的蛋白表達(dá)量及磷酸化PERK（Thr980）、磷酸化eIF2A（Ser51）和磷酸化ATF4（Ser245）水平顯著增加（Plt;0.05，Plt;0.01），但其PERK和ATF4的蛋白表達(dá)量未顯著改變（Pgt;0.05），見圖3。200μmol/L七葉苷處理可顯著降低肝細(xì)胞中eIF2A的蛋白表達(dá)量（Plt;0.01），同時顯著降低其磷酸化PERK（Thr980）、磷酸化eIF2A（Ser51）和磷酸化ATF4（Ser245）水平（Plt;0.05，Plt;0.01）。

3""討論

NAFLD正逐漸演變?yōu)槿蚍秶鷥?nèi)的主要慢性肝病[12-13]。據(jù)估算，全球約有24億人患有NAFLD，約占全球人口的30%[14]。目前，一些用于治療高脂血癥和糖尿病的藥物被發(fā)現(xiàn)對NAFLD有一定的治療效果。七葉苷也稱作秦皮甲素，是從七葉樹或中藥材秦皮等多種藥用植物中提取的有效成分[15]。這些植物中的七葉苷含量為15.96～38.70mg/g[16]。藥理學(xué)研究顯示，秦皮甲素在抗炎和抗氧化應(yīng)激方面表現(xiàn)出顯著效果[17-18]。此外，七葉苷還具有抗糖尿病的特性，這與其在改善胰腺損傷、促進(jìn)胰島素釋放及增強(qiáng)血糖穩(wěn)態(tài)方面的作用密切相關(guān)[19-20]。盡管已有研究表明七葉苷可改善NAFLD小鼠模型的肝脂肪變性，但其在調(diào)控ERS方面的具體作用機(jī)制尚不十分明確。本研究證實七葉苷通過抑制PERK/"eIF2A/ATF4信號通路改善肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的治療作用和機(jī)制。

肝細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)脂肪代謝和儲存的主要場所，在NAFLD的發(fā)病過程中，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的過度積累成為該病的一個顯著標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，使?jié)舛鹊挠?0μmol/L和200μmol/L七葉苷處理均可顯著改善肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化情況，提升其抗氧化能力，并減輕肝細(xì)胞的損傷。這些細(xì)胞狀態(tài)的改善與七葉苷降低細(xì)胞內(nèi)凋亡因子Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量的作用相吻合，進(jìn)一步證實七葉苷在抗脂質(zhì)氧化、提高抗氧化性及降低細(xì)胞凋亡方面的重要作用。值得注意的是與50μmol/L濃度相比，200μmol/L七葉苷處理在降低細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)量方面表現(xiàn)出更為顯著的效果。這一結(jié)果說明不同濃度的七葉苷可能對不同凋亡因子存在差異性調(diào)控或在調(diào)控時間上存在差異，這需要進(jìn)一步深入探究以更全面地了解七葉苷的作用機(jī)制和最佳用藥劑量。

為驗證七葉苷對FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的保護(hù)作用是否與改善脂質(zhì)代謝相關(guān)，本研究探討七葉苷對肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累和代謝的影響。本研究檢測肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量、TG含量及涉及脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因表達(dá)。實驗結(jié)果顯示七葉苷處理可顯著減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴積累和TG含量，說明七葉苷可顯著改善肝細(xì)胞的脂肪變性，這與NAFLD的治療目標(biāo)高度契合。本研究還發(fā)現(xiàn)七葉苷處理可顯著降低與脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)的基因如PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk和Acaca的轉(zhuǎn)錄水平。這些基因在TG及膽固醇合成等代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一結(jié)果提示七葉苷可通過這些途徑潛在調(diào)控肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示七葉苷可顯著降低肝細(xì)胞中PERK、eIF2A和ATF4的磷酸化水平，表明七葉苷對FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞ERS有顯著調(diào)控作用，且這種調(diào)控與肝細(xì)胞脂質(zhì)合成密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)七葉苷不僅可降低eIF2A的磷酸化水平，還顯著降低eIF2A蛋白的表達(dá)量；但對PERK和ATF4的蛋白表達(dá)量未產(chǎn)生明顯影響。該結(jié)果說明七葉苷可能不僅通過影響PERK/eIF2A/ATF4信號通路的磷酸化發(fā)揮作用，還可能通過其他途徑調(diào)控eIF2A的表達(dá)。

綜上，本研究結(jié)果表明七葉苷在FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中對PERK/eIF2A/ATF4信號通路具有顯著的調(diào)控作用。七葉苷可有效抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)合成過程，進(jìn)而改善肝細(xì)胞的脂肪變性、損傷及凋亡。本研究有望為七葉苷治療NAFLD的機(jī)制研究提供新的思路，同時為其作為潛在藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–08–08）

（修回日期：2024–10–27）