收稿日期：2023-12-25

基金項(xiàng)目：淮安市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（鄉(xiāng)村振興類）項(xiàng)目（HAN202313）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32001213）；淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展基金（HNY202027）

作者簡介：董玉兵（1992-），男，山東梁山人，博士研究生，助理研究員，主要從事土壤肥料與綠肥研究。 （E-mail）dongyubing@jaas.ac.cn

通訊作者：孫春梅，（E-mail）20031201@jaas.ac.cn；陳 川，（E-mail）19921201@jaas.ac.cn

摘要： 冬閑田種植綠肥作物已經(jīng)成為提升耕地質(zhì)量的一種重要措施。為明確不同氮肥水平對毛葉苕子固氮特征的影響，本研究通過2年田間定位試驗(yàn)，設(shè)置不施氮肥對照（CK）、50 kg/hm2（N1）、100 kg/hm2（N2）3個施氮水平，測定毛葉苕子關(guān)鍵生育期的生物量、根瘤生物量、氮吸收量及固氮酶活性等指標(biāo)，明確氮肥調(diào)控措施對毛葉苕子固氮能力的影響及機(jī)制。結(jié)果表明：與CK相比，2個生長季N1處理和N2處理毛葉苕子生物量、氮吸收量和共生固氮量都有顯著增加。N1處理的共生固氮率與CK無顯著差異，而N2處理的共生固氮率下降明顯。N1處理的共生固氮量顯著高于N2處理。隨著施氮量的增加，現(xiàn)蕾期和盛花期固氮酶活性呈增加趨勢，N2處理的固氮酶活性比CK增加42.8%～76.1%。3個處理的根瘤生物量和根瘤固氮酶活性均在盛花期達(dá)到最大值。SQRT模型可較好擬合毛葉苕子固氮酶活性隨時間的變化特征，不同處理下擬合方程決定系數(shù)（R²）均≥0.87。與CK相比，N1和N2處理的固氮酶活性開始時間（Dmin）明顯推遲，固氮酶活性峰值出現(xiàn)時間（Dopt）提前。總之，N1處理（50 kg/hm2）能夠顯著增加植株生物量、共生固氮量及氮吸收量，可以作為試驗(yàn)地區(qū)冬閑田種植毛葉苕子的推薦施氮量。本研究結(jié)果可為江淮地區(qū)冬閑田的合理培肥提供依據(jù)和支撐。

關(guān)鍵詞： 毛葉苕子；氮肥調(diào)控；固氮酶活性；模型

中圖分類號： S158"" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1844-10

Effect and and mechanisms of nitrogen fertilizer regulation on the nitrogen fixation characteristics and nitrogenase activity of hairy vetch in winter fallow fields of the Yangtze River-Huaihe region

DONG Yubing^1，2， DONG Qingjun¹， LI Chuanzhe¹， LI Weihong¹， ZHANG Miao¹， SHAO Wenqi¹， SUN Chunmei¹， CHEN Chuan¹

（1.Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu， Huai’an 223001， China;2.College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： Planting green manure crops in winter fallow field has become an important measure to improve the quality of cultivated land. In order to clarify the effects of different nitrogen levels on the nitrogen fixation characteristics of hairy vetch， a two-year field positioning experiment was conducted to determine the effects of nitrogen regulation measures and mechanism on the nitrogen fixation ability of hairy vetch by setting three nitrogen levels of no nitrogen control （CK）， 50 kg/hm2 （N1） and 100 kg/hm2 （N2）， and by measuring the biomass， root nodule biomass， nitrogen uptake and nitrogenase activity of hairy vetch at the key growth stages. The results showed that compared with CK， the biomass， nitrogen uptake and symbiotic nitrogen fixation of hairy vetch under N1 and N2 treatments were significantly increased in the two growing seasons. The symbiotic nitrogen fixation rate of N1 treatment was not significantly different from that of CK， while the symbiotic nitrogen fixation rate of N2 treatment decreased significantly. The symbiotic nitrogen fixation of N1 treatment was significantly higher than that of N2 treatment. With the increase of nitrogen application rate， the nitrogenase activity in squaring stage and full-bloom stage showed an increasing trend， and the nitrogenase activity of N2 treatment increased by 42.8%-76.1% compared with CK. The nodule biomass and nitrogenase activity of the three treatments reached the maximum at the full-bloom stage. The SQRT model could well fit the variation characteristics of nitrogenase activity of hairy vetch with time， and the determination coefficients （R²） of the fitting equations under different treatments were all ≥ 0.87. Compared with CK， the start time （Dmin） of nitrogenase activity in N1 and N2 treatments was significantly delayed， and the peak time （Dopt） of nitrogenase activity was advanced. In conclusion， N1 treatment （50 kg/hm2） could significantly increase plant biomass， symbiotic nitrogen fixation and nitrogen uptake， which could be used as the recommended nitrogen application rate for planting hairy vetch in winter fallow fields of the experimental area. The results of this study provide a basis and support for the rational fertilization of winter fallow fields in the Yangtze River-Huaihe region.

Key words： hairy vetch;nitrogen fertilizer regulation;nitrogenase activity;model

綠肥作為有機(jī)肥源，還田后能夠緩慢釋放養(yǎng)分供后茬作物吸收利用，是解決氮肥過量使用的一種綠色可持續(xù)生產(chǎn)肥源^[1-2]。綠肥還田還能夠改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤固碳能力和作物產(chǎn)量^[2-4]。因此，冬閑田種植綠肥作物已經(jīng)成為中國稻田化肥減量和耕地質(zhì)量提升的一項(xiàng)重要措施^[5-6]。在綠肥作物種植過程中，適量的氮肥投入可以促進(jìn)根瘤生長發(fā)育，提高根瘤固氮能力，但氮肥施用量過多也會對根瘤固氮產(chǎn)生抑制作用^[7-9]。目前氮肥對紫云英、苜蓿等綠肥作物的生長調(diào)控和固氮能力的影響已有一些研究^[10-14]。

毛葉苕子（Vicia villosa Roth.）具有高效的共生固氮系統(tǒng)，是中國江淮流域稻田常見的冬季豆科綠肥。目前有關(guān)毛葉苕子的腐解及養(yǎng)分釋放特征、對后茬水稻產(chǎn)量及N2O排放的影響已有一些研究^[2，15]，但氮肥調(diào)控對毛葉苕子共生固氮和生長影響、固氮酶活性隨時間的變化規(guī)律等研究較少^[16-17]。因此，為探究氮肥用量對毛葉苕子共生固氮及生長的影響，明確毛葉苕子適宜的氮肥管理措施，本研究通過為期2年的田間定位試驗(yàn)，研究不同氮肥用量對毛葉苕子固氮酶活性、共生固氮及生長狀況的影響，并對固氮酶活性隨時間變化的特征進(jìn)行模型擬合以明確固氮酶活性的初始時間和終止時間，為冬閑田毛葉苕子栽培調(diào)控、冬閑季節(jié)耕地培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)概況

試驗(yàn)于2020年11月至2021年5月和2021年11月至2022年5月在江蘇省淮安市清江浦區(qū)鹽河街道（33°18′N，119°29′E）開展。試驗(yàn)點(diǎn)處于中國南北地理分界線，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候與溫帶季風(fēng)氣候交匯區(qū)，年均氣溫14.4 ℃，年平均降雨量956.3 mm，全年日照時間為2 273.5 h，無霜期 225.0 d^[13，15]。土壤類型為淹育型水稻土，土壤質(zhì)地為黏壤土（黏粒20.4%、砂粒8.2%、粉粒71.4%），土壤容重1.08 g/cm3， pH值6.2，有機(jī)碳含量15.1 g/kg，全氮含量1.2 g/kg。試驗(yàn)期間月均氣溫與降雨量如圖1所示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為明確施氮量對毛葉苕子生長和固氮能力的影響，本研究設(shè)置3個施氮處理，分別為0（CK）、50 kg/hm2（N1）、100 kg/hm2（N2）。每個處理3次重復(fù)，各小區(qū)面積為30 m²（5 m×6 m）。小區(qū)之間設(shè)30 cm 深的隔板，并設(shè)置獨(dú)立的灌排水系統(tǒng)。試驗(yàn)田周圍設(shè)有3 m的保護(hù)行。

2020-2021年生長季，2020年10月31日施入基肥同時播種毛葉苕子（Vicia villosa Roth.），2021年3月13日追肥，2021年5月13日翻壓還田；2021-2022年生長季，2021年11月3日施入基肥同時播種毛葉苕子，2022年2月27日追肥，2022年5月15日翻壓還田。整個冬閑季不進(jìn)行人為灌水。毛葉苕子播種量為75 kg/hm2。所用氮肥均為尿素，按6∶4的基追肥比分2次施入。磷肥按60 kg/hm2 P2O5的標(biāo)準(zhǔn)施用過磷酸鈣，鉀肥按60 kg/hm2 K2O的標(biāo)準(zhǔn)施用氯化鉀，磷肥和鉀肥均作為基肥，在播種前一次性施用。

為測定毛葉苕子共生固氮水平，設(shè)置田間微區(qū)試驗(yàn)，在毛葉苕子播種前每小區(qū)埋入1個直徑25 cm、深度25 cm的聚氯乙烯（PVC）圓筒作為微區(qū)用于¹⁵N標(biāo)記。每次施肥時同步將豐度5%的¹⁵N標(biāo)記尿素施入到田間微區(qū)。以相同¹⁵N豐度標(biāo)記的小麥作為參比作物。在小區(qū)旁邊同步開展毛葉苕子的砂培試驗(yàn)，即將毛葉苕子種植于直徑25 cm、高度25 cm盛有沙土的塑料盆中，共6盆。塑料盆置于透光遮雨棚下，整個生育期均用無氮水灌溉。毛葉苕子出苗后，每個微區(qū)或者砂培盆栽進(jìn)行間苗，均保留長勢一致的8株毛葉苕子苗。

為明確施N量對毛葉苕子固氮酶活性的影響，試驗(yàn)開始前分別在每個小區(qū)提前埋入4個直徑15 cm、深度20 cm PVC圓筒，圓筒周圍打孔并用200目的尼龍網(wǎng)包裹，以便于將整株根系取出。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 植株共生固氮量的測定 采用同位素稀釋法測定毛葉苕子共生固氮量^[18]。在綠肥翻壓前取出微區(qū)或砂培試驗(yàn)的整株植株，分別測定地上部和地下部生物量，并采用Jena Multi N/C 3000碳氮元素分析儀（德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品）和Elementar Isoprime100同位素質(zhì)譜儀（德國元素分析系統(tǒng)公司產(chǎn)品）測定植株氮含量及¹⁵N豐度（δ¹⁵N）。毛葉苕子的共生固氮率及共生固氮量根據(jù)以下公式計(jì)算^[17]：

%Ndfa=（δ¹⁵Nref-δ¹⁵Nleg）/（δ¹⁵Nref-B）×100%（1）

SNF=Nuptake×%Ndfa（2）

式中，%Ndfa為植株共生固氮率，δ¹⁵Nleg和δ¹⁵Nref分別為毛葉苕子和小麥的δ¹⁵N值，B是砂培試驗(yàn)中毛葉苕子的δ¹⁵N值，SNF為共生固氮量（kg/hm2），Nuptake為毛葉苕子氮吸收量（kg/hm2）。

1.3.2 根瘤固氮酶活性和不同時期的植株生物量測定 固氮酶活性是研究豆科作物根瘤固氮能力的重要指標(biāo)^[19-20]。氮肥量是影響豆科作物根瘤固氮酶活性的重要影響因素之一^[21-24]。本研究采用乙炔還原法測定植株根系固氮酶活性^[25]。在毛葉苕子生長至分枝期、現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期從各小區(qū)分別取出1個PVC圓筒，將植株地上部和根系分開，地上部70 ℃殺青30 min后，置于烘箱于60 ℃烘干至恒重。植株根系用清水沖洗后用吸水紙吸去多余水分，連帶根瘤稱量鮮重，然后將根瘤與根系分離。根瘤裝入500 mL棕色頂空瓶中，蓋上蓋子進(jìn)行密封，立即用注射器從頂空瓶中抽取50 mL空氣，再從乙炔儲氣袋中抽取50 mL乙炔打入頂空瓶中，25 ℃反應(yīng)2 h，再用針筒從頂空瓶中抽取20 mL氣體，采用Agilent 7890B氣相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品）測定抽取氣體的乙烯和乙炔含量。采用下式計(jì)算固氮酶活性：

NA=（CC×V）/（22.4×T×M）（3）

式中，NA為固氮酶活性[μmol/（g·h）]，CC為乙烯濃度（μmol/mol），V為頂空瓶體積（L），T為培養(yǎng)時間（h），M為根瘤重量（g），22.4為標(biāo)準(zhǔn)摩爾體積。

固氮酶活性測定后，將根瘤與根系于70 ℃殺青30 min后，分別置于烘箱60 ℃烘干至恒重。

1.3.3 收獲期植株生物量和氮吸收量的測定 毛葉苕子翻壓前，分別在每個小區(qū)選取1 m×1 m長勢一致的植株，采集地上部植株，稱取鮮重，并隨機(jī)選取20株植株70 ℃殺青30 min后，60 ℃烘干至恒重，測定含水率。將烘干后的植株經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，采用Jena Multi N/C 3000碳氮元素分析儀測定植株氮含量。

Biomass=Biofw×Wc（4）

Nuptake=Biomass×Nc（5）

式中，Biomass為植株地上部生物量（t/hm²）；Biofw為植株地上部鮮重；Wc為植株地上部含水率；Nuptake植株地上部吸氮量（kg/hm2）；Nc為植株地上部含氮量（g/kg）。

1.3.4 土壤樣品采集與測定 毛葉苕子翻壓前，采用直徑為38 mm的土鉆，在每個小區(qū)采集5份0～20 cm土壤樣品，混勻樣品，去除植株根系等雜質(zhì)后，于陰涼處晾干。風(fēng)干后的樣品過篩后測定土壤基本理化性質(zhì)^[26]。按重量比5∶1將水和土混合后，采用雷磁PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品）測定土樣pH值；土壤樣品經(jīng)H2SO4消煮后，采用K9840型凱氏定氮儀（青島海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品）測定土壤全氮含量；采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機(jī)碳含量；土樣用0.5 mol/L碳酸氫鈉浸提后，采用靛藍(lán)比色法測定土壤有效磷含量；土樣以1 mol/L醋酸銨浸提后，采用AP1200型火焰光度計(jì)（上海傲譜分析儀器有限公司產(chǎn)品）測定土壤速效鉀含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

參考Taylor等^[27]的SQRT模型，并根據(jù)毛葉苕子全生育期共生固氮酶活性的變化特征，利用下式擬合固氮酶活性隨時間的變化：

NA=a×（x-Dmax）×[1-e^b（x-Dmin）]（6）

式中，NA為固氮酶活性[μmol/（g·h）]，x為播種后天數(shù)。利用Origin lab軟件進(jìn)行模型參數(shù)a、b、Dmin、Dmax的擬合。其中，Dmin、Dmax為擬合方程與x軸的交點(diǎn)，分別代表固氮酶活性gt;0的開始時間和結(jié)束時間；a、b為模型的修正參數(shù)。采用MATLAB軟件fminbnd函數(shù)求取擬合方程固氮酶活性峰值出現(xiàn)的時間（Dopt）。

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 22.0軟件及最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行處理間差異分析；采用Origin Lab軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對毛葉苕子地上部生物量、氮吸收量和共生固氮能力的影響

毛葉苕子翻壓時，2個生長季N1處理毛葉苕子生物量分別比CK增加13.4%和64.6%，N2處理生物量分別比CK增加32.6%和70.2%，但2個生長季N1處理和N2處理毛葉苕子生物量均無顯著差異。與CK相比，2個生長季N1處理毛葉苕子氮吸收量分別增加46.8%和55.8%，N2處理氮吸收量分別增加56.0%和81.6%。與CK相比，2個生長季N2處理共生固氮率分別顯著降低24.0%和31.4%。2個生長季毛葉苕子共生固氮量均以CK最低、N1處理最高。與CK相比，2個生長季N1處理共生固氮量分別增加47.4%和44.4%，N2處理分別增加18.6%和24.3%（表1）。

2.2 施氮量對毛葉苕子不同時期地上部和地下部生物量的影響

施氮量對毛葉苕子不同時期地上部和地下部生物量的影響如圖2所示。從圖中可以看出，從分枝期至結(jié)莢期，3個施N處理地上部和地下部生物量均逐漸增加。隨著施N量的增加，2個生長季4個時期地上部和地下部生物量總體上亦呈增加趨勢。2個生長季毛葉苕子現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期，N1處理和N2處理地上部生物量均無顯著差異，但盛花期和結(jié)莢期2個處理地上部生物量整體上顯著高于CK。2020-2021年生長季，3個處理生長初期（分枝期和現(xiàn)蕾期）地下部生物量無顯著差異，而生長后期（盛花期和結(jié)莢期）N2處理的地下部生物量顯著高于CK；而2021-2022年生長季，4個時期N1處理和N2處理的地下部生物量無顯著差異，但均顯著高于CK。

2.3 施氮量對毛葉苕子根瘤生物量的影響

施氮量對毛葉苕子根瘤生物量的影響如圖3所示。從圖中可以看出，3個施氮量處理下分枝期至結(jié)莢期根瘤生物量均呈先升高后降低的趨勢，根瘤生物量均在盛花期時達(dá)到最大值。2020-2021生長季，CK、N1和N2處理結(jié)莢期根瘤生物量分別比盛花期降低44.4%、35.5%和34.1%；2021-2022年生長季，CK、N1和N2處理結(jié)莢期根瘤生物量分別比盛花期降低33.4%、35.3%和52.7%。2個生長季4個發(fā)育期N2處理的根瘤生物量均為最低。與CK相比，4個生育期N2處理的根瘤生物量降低18.4%～47.6%。4個生育期N1處理和CK的根瘤生物量差異均不顯著。

2.4 施氮量對毛葉苕子根瘤固氮酶活性的影響

施氮量對毛葉苕子根瘤固氮酶活性的影響如圖4所示。從圖中可以看出，2個生長季不同處理下固氮酶活性具有相似的變化規(guī)律。3個施氮處理下，從分枝期至盛花期固氮酶活性逐漸增大，而從盛花期至結(jié)莢期固氮酶活性迅速降低，盛花期時固氮酶活性均達(dá)到最大值。隨著施氮量的增加，現(xiàn)蕾期和盛花期固氮酶活性呈增加趨勢，N2處理的固氮酶活性比CK增加42.8%～76.1%。

2.5 固氮酶活性擬合方程參數(shù)變化特征

2個生長季，各處理下固氮酶活性的擬合結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，2個生長季所有處理擬合方程的決定系數(shù)（R²）均≥0.87。在2個生長季，隨著施氮N的增加，方程擬合系數(shù)（Dmin）呈增加趨勢，Dmax差異不大，而Dopt呈減少趨勢。雖然處理間Dmax差異不大，但2個生長季Dmax差異較大，2020-2021年生長季為185.0～185.1 d，2021-2022年生長季為170.0～170.9 d。對比發(fā)現(xiàn)，2個生長季固氮酶活性大于0的持續(xù)時間（Dmax-Dmin）存在一定的差異，2020-2021年生長季固氮酶活性開始時間（Dmin）和結(jié)束時間（Dmax）均比2021-2022年生長季遲；2020-2021年生長季固氮酶活性大于0的持續(xù)時間為43.1～45.8 d，明顯低于2021-2022年生長季的47.7～62.8 d（表2）。

2.6 施N量對土壤基本理化性質(zhì)的影響

不同施N處理后，土壤理化性質(zhì)的差異如表3所示。從表中可以看出，隨著施N量的增加，種植毛葉苕子后土壤全氮含量呈增加趨勢，2021-2022生長季N1和N2處理的土壤全氮含量分別比CK增加11.2%和13.3%，差異顯著；土壤pH呈下降趨勢。同一生長季，3個處理的土壤有機(jī)碳含量、有效磷含量和速效鉀含量無顯著差異。

3 討論

3.1 毛葉苕子生物量、根瘤生物量及固氮酶活性對氮肥調(diào)控的響應(yīng)

本研究結(jié)果表明，施氮量增加能顯著提高毛葉苕子生物量。但N1處理和N2處理的生物量沒有顯著差異，這符合植物對氮肥的需求曲線^[28]。施用氮肥一方面能促進(jìn)毛葉苕子植株的生長，另一方面還能提高根系固氮水平，進(jìn)而導(dǎo)致植株氮吸收量的顯著增加。施氮后土壤全氮含量有增加趨勢，其中2021-2022生長季，N1和N2處理較CK增加顯著，這說明氮肥施用后，能加強(qiáng)根系共生固氮能力，顯著增加毛葉苕子的氮吸收累積量，進(jìn)而提高農(nóng)田土壤的全氮含量。即長期種植毛葉苕子可以改善土壤質(zhì)量，這與前人的研究結(jié)果一致^{[11，29-30]}。

本研究結(jié)果表明，高氮處理能顯著降低根瘤生物量，這與前人研究結(jié)果^[9，19]一致。其原因在于高氮處理能增加土壤無機(jī)氮濃度，抑制根系結(jié)瘤；另外，由于根系結(jié)瘤和固氮都需要大量的能量作為支撐，豆科作物會優(yōu)先利用土壤中的氮素，其次才是結(jié)瘤固氮^[22]。然而，本研究N2處理在前期可以為植株供應(yīng)充足的養(yǎng)分，減弱了植株對固氮的需求，進(jìn)而減弱了植株根系的結(jié)瘤信號^[9]，降低了根瘤生物量。與不施N對照相比， N2處理雖然導(dǎo)致根瘤生物量的降低，但是并未減少共生固氮量，其原因主要在于N2處理能提高現(xiàn)蕾期和盛花期的根瘤固氮酶活性。本研究中N1處理具有最高的共生固氮量，主要是因?yàn)镹1處理能在不影響根系結(jié)瘤的情況下，顯著增加根瘤固氮酶活性。這說明根瘤固氮酶活性也是豆科作物共生固氮的重要指標(biāo)^[19]。本研究中的2個氮肥用量均能增加共生固氮量，但N2處理下，共生固氮量和共生固氮率均低于N1處理，這說明高氮處理會抑制植株的共生固氮能力。

本研究結(jié)果顯示，施用氮肥能顯著增加毛葉苕子現(xiàn)蕾期和盛花期的固氮酶活性，這與前人的研究結(jié)果^[8，31]一致。劉曉靜等^[24]研究發(fā)現(xiàn)施氮處理的紫花苜蓿固氮酶活性顯著高于不施氮對照。楊建波等^[8]研究發(fā)現(xiàn)，低氮處理能顯著提高甘蔗固氮酶活性。馮博政等^[32]同樣發(fā)現(xiàn)少量施氮能顯著增加紫花苜蓿根瘤固氮酶活性。而高氮處理對植物固氮酶活性的抑制亦得到許多證實(shí)^[9，32]。針對高氮抑制豆科作物結(jié)瘤固氮的原因，柯丹霞等^[9]提出了高氮的亞硝酸鹽毒性假說和碳饑餓假說。本研究中N1處理和N2處理均能顯著增加現(xiàn)蕾期和盛花期固氮酶活性，并未觀測到高氮對該時期固氮酶活性抑制的現(xiàn)象，這可能是由于本研究的氮肥水平相對較低。本研究中隨著氮肥施用量增加，固氮酶活性顯著增加，這可能是因?yàn)殡S著氮肥用量的增加，植株光合產(chǎn)物增加，這給根瘤共生固氮提供直接的能量來源^[33]。Taylor等^[31，33]研究發(fā)現(xiàn)，光合產(chǎn)物的多少能調(diào)控豆科作物根瘤固氮酶活性，進(jìn)而影響到共生固氮量。本研究中，與不施N對照相比，N2處理根瘤生物量較低，但植株生物量較高，進(jìn)而使得單位重量的根瘤可獲得更多的光合產(chǎn)物，從而提高根瘤固氮酶活性，這與Taylor等^[31]的研究結(jié)果一致。

本研究中不同施氮處理下，根瘤固氮酶活性均在盛花期時達(dá)到最大值，而盛花期至結(jié)莢期根瘤固氮酶活性迅速降低，這與前人研究結(jié)果^[34-35]一致。盛花期時，植株?duì)I養(yǎng)生長最為旺盛，植株對氮素的需求亦最為強(qiáng)烈^[36]，因此，此時期固氮酶活性達(dá)到最大值。而結(jié)莢時，植株開始由營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段轉(zhuǎn)變，植株對氮素需求降低，植株根、莖、葉的養(yǎng)分向莢部轉(zhuǎn)移，造成根瘤的死亡和菌體自溶^[37-38]。本研究中3個施N量處理下，結(jié)莢期的根瘤生物量均低于盛花期，這也說明結(jié)莢過程中，根瘤組織存在死亡和菌體自溶現(xiàn)象。

3.2 固氮酶活性對氮肥調(diào)控的響應(yīng)

為明確施N量對固氮酶活性的影響，本研究首次提出了固氮酶活性動態(tài)變化模型，取得了較好的擬合效果，模型可直觀地體現(xiàn)固氮酶活性隨時間變化特征?？傮w來說，3個施N處理的固氮酶活性隨著時間均先緩慢升高，至盛花期時達(dá)到最大值，而盛花期至結(jié)莢期固氮酶活性快速下降，這一特征與前人研究結(jié)果^[34-35]一致。模型擬合參數(shù)顯示，2個生長季（2020-2021年、2021-2022年）的擬合參數(shù)存在著一定的差異，這可能與年際之間的氣象要素變化導(dǎo)致毛葉苕子的生育進(jìn)程差異有關(guān)。由于本研究中擬合模型參數(shù)時僅用4個時間點(diǎn)的測定數(shù)據(jù)，導(dǎo)致模型可能不能精確體現(xiàn)毛葉苕子固氮酶活性動態(tài)變化。此外，由于氣象要素的年際變化，2個生長季毛葉苕子的發(fā)育進(jìn)程存在一定的差異，本研究中利用播種后天數(shù)為時間指標(biāo)進(jìn)行固氮酶活性動態(tài)擬合，會導(dǎo)致2個生長季的擬合參數(shù)差異較大。在后續(xù)的研究中一方面要增加固氮酶活性的測定次數(shù)，另一方面要利用定量化的生育期指標(biāo)來進(jìn)行擬合。

前人研究中雖然推斷出固氮酶活性開始于越冬后的返青期，結(jié)束于結(jié)莢期和成熟期左右^[39-40]，但并未具體量化固氮酶活性開始時間和結(jié)束時間。本研究結(jié)果還顯示，施用氮肥能推遲固氮酶活性開始時間，這可能是由于施氮處理能保證毛葉苕子生長前期充足的養(yǎng)分供應(yīng)，使得毛葉苕子前期并非迫切需要根瘤共生固氮提供養(yǎng)分。Dovrat等^[22]提出，由于共生固氮需要消耗大量能量，因此豆科作物會優(yōu)先吸收土壤中可利用氮，只有可利用氮不能滿足自身需求時，才進(jìn)行自身的共生固氮。本研究還發(fā)現(xiàn)施用氮肥會導(dǎo)致最優(yōu)固氮酶活性最大值出現(xiàn)時間提前，這可能是由于氮肥的施用能增加土壤養(yǎng)分供應(yīng)和毛葉苕子生物量，植株的氮素需求更容易得到滿足^{[20，41]}，從而更早地減少植株對共生固氮的依賴，進(jìn)而導(dǎo)致固氮酶活性峰值出現(xiàn)時間提前。這與田艷洪等^[40]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

施用50kg/hm2（N1）和100 kg/hm2（N2）的氮肥能顯著增加毛葉苕子植株生物量和氮吸收量。施用100 kg/hm2氮肥雖然會降低毛葉苕子根瘤生物量，但能提高固氮酶活性，因而植株共生固氮量并未降低；施用50 kg/hm2氮肥處理根瘤生物量與不施N對照無顯著差異，但能顯著提高固氮酶活性，進(jìn)而能顯著增加共生固氮量，維持共生固氮率。施用50kg/hm2（N1）和100 kg/hm2（N2）的氮肥均能顯著提高固氮酶活性，其中增加較顯著的時期在現(xiàn)蕾期和盛花期。固氮酶活性隨時間變化的擬合模型顯示，施用氮肥能導(dǎo)致固氮酶活性開始時間推遲，固氮酶活性峰值出現(xiàn)時間提前，但對固氮酶活性結(jié)束時間影響不明顯。綜上，少量施用氮肥（50 kg/hm2）既能提高毛葉苕子的植株生物量和氮吸收量，又可以顯著提高共生固氮量，維持共生固氮率，是較為合理的氮肥用量運(yùn)籌方案。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIANG H， LI S， ZHANG L， et al. Long-term green manuring enhances crop N uptake and reduces N losses in rice production system[J]. Soil and Tillage Research，2022，220：105369.

[2] 張成蘭，劉春增，李本銀，等. 不同施肥條件下毛葉苕子的腐解及養(yǎng)分釋放特征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2019，30（7）：2275-2283.

[3] HUANG S， ZENG Y J， WU J F， et al. Effect of crop residue retention on rice yield in China：a meta-analysis[J]. Field Crops Research，2013，154：188-194.

[4] LIU C， LU M， CUI J， et al. Effects of straw carbon input on carbon dynamics in agricultural soils：a meta-analysis[J]. Global Change Biology，2014，20（5）：1366-1381.

[5] ZHANG D B， YAO P W， ZHAO N， et al. Contribution of green manure legumes to nitrogen dynamics in traditional winter wheat cropping system in the Loess Plateau of China[J]. European Journal of Agronomy，2016，72：47-55.

[6] 陳靜蕊，秦文婧，王少先，等. 化肥減量配合紫云英還田對雙季稻產(chǎn)量及氮肥利用率的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào)，2019，33（6）：280-287.

[7] GUO K， YANG J， YU N， et al. Biological nitrogen fixation in cereal crops：progress，strategies，and perspectives[J]. Plant Communications，2023，4（2）：100499.

[8] 楊建波，彭東海，覃劉東，等. 低氮條件下間作大豆對宿根蔗內(nèi)生固氮菌固氮酶活性、氮素積累及產(chǎn)量的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46（2）：210-215.

[9] 柯丹霞，徐勤朕，楊 娜，等. 高氮抑制豆科植物結(jié)瘤固氮機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（10）：40-45.

[10]常單娜，劉春增，李本銀，等. 翻壓紫云英對稻田土壤還原物質(zhì)變化特征及溫室氣體排放的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2018，27（12）：133-144.

[11]高嵩涓，周國朋，曹衛(wèi)東. 南方稻田紫云英作冬綠肥的增產(chǎn)節(jié)肥效應(yīng)與機(jī)制[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2020，26（12）：2115-2126.

[12]韓 可，孫 彥，張 昆，等. 接種不同根瘤菌對紫花苜蓿生產(chǎn)力的影響[J]. 草地學(xué)報(bào)，2018，26（3）：639-644.

[13]張軍倩，董玉兵，焦穎等. 氮肥調(diào)控對紫云英-水稻輪作系統(tǒng)結(jié)瘤固氮特征及生產(chǎn)力的影響 [J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2024，30（1）：1-11.

[14]高麗敏，蘇 晶，田 倩，等. 施氮對不同水分條件下紫花苜蓿氮素吸收及根系固氮酶活性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（3）：130-136.

[15]DONG Y， ZHANG J， XU X， et al. Symbiotic nitrogen fixation enhanced crop production and mitigated nitrous oxide emissions from paddy crops[J]. Field Crops Research，2024，307：109261.

[16]劉 蕊，常單娜，高嵩涓，等. 西北小麥與豆科綠肥間作體系箭筈豌豆和毛葉苕子生物固氮效率及氮素轉(zhuǎn)移特性[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2020，26（12）：2184-2194.

[17]張久東，包興國，曹衛(wèi)東，等. 長期施用綠肥減施化肥對毛葉苕子產(chǎn)草量和土壤肥力的影響[J]. 中國土壤與肥料，2017（6）：66-70.

[18]CHALK P M， HE J， PEOPLES M B， et al. ¹⁵N2 as a tracer of biological N2 fixation：a 75-year retrospective[J]. Soil Biology and Biochemistry，2017，106：36-50.

[19]BELLENGER J P， DARNAJOUX R， ZHANG X， et al. Biological nitrogen fixation by alternative nitrogenases in terrestrial ecosystems：a review[J]. Biogeochemistry，2020，149（1）：53-73.

[20]FAN X， YUAN G， LIU W. Response strategies of N-fixation by epiphytic bryophytes to water change in a subtropical montane cloud forest[J]. Ecological Indicators，2022，135：108527.

[21]BAHULIKAR R A， CHALUVADI S R， TORRES-JEREZ I， et al. Nitrogen fertilization reduces nitrogen fixation activity of diverse diazotrophs in switchgrass roots[J]. Phytobiomes Journal，2019，5（1）：80-87.

[22]DOVRAT G， BAKHSHIAN H， MASCI T， et al. The nitrogen economic spectrum of legume stoichiometry and fixation strategy[J]. New Phytologist，2020，227（2）：365-375.

[23]黃曉財(cái)，胡浩南，李欣欣，等. 氮、磷、鉀脅迫對甘蔗生長及固氮酶活性的影響[J]. 甘蔗糖業(yè)，2019（3）：23-29.

[24]劉曉靜，蒯佳林，李文卿，等. 硝態(tài)氮與銨態(tài)氮對紫花苜蓿根系生長及結(jié)瘤固氮的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（5）：106-110.

[25]夏 玄. 氮素營養(yǎng)對大豆結(jié)瘤固氮及相關(guān)調(diào)控物質(zhì)影響的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[26]鮑士旦，江榮風(fēng)，楊超光，等. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[27]TAYLOR A E， GIGUERE A T， ZOEBELEIN C M， et al. Modeling of soil nitrification responses to temperature reveals thermodynamic differences between ammonia-oxidizing activity of archaea and bacteria[J]. ISME J，2017，11（4）：896-908.

[28]巨曉棠. 理論施氮量的改進(jìn)及驗(yàn)證——兼論確定作物氮肥推薦量的方法[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2015，52（2）：249-261.

[29]程會丹，魯艷紅，聶 軍，等. 減量化肥配施紫云英對稻田土壤碳、氮的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2020，39（6）：1259-1270.

[30]劉春增，常單娜，李本銀，等. 種植翻壓紫云英配施化肥對稻田土壤活性有機(jī)碳氮的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2017，54（3）：657-669.

[31]TAYLOR B N， MENGE D N L. Light，nitrogen supply，and neighboring plants dictate costs and benefits of nitrogen fixation for seedlings of a tropical nitrogen-fixing tree[J]. New Phytologist，2021，231（5）：1758-1769.

[32]馮博政，劉曉靜，郝 鳳，等. 外源氮對紫花苜蓿固氮酶活性和酰脲含量的影響及其相關(guān)關(guān)系研究[J]. 草地學(xué)報(bào)，2016，24（2）：351-357.

[33]TAYLOR B N， MENGE D N L. Light regulates tropical symbiotic nitrogen fixation more strongly than soil nitrogen[J]. Nature Plants，2018，4（9）：655-661.

[34]王 晶，許修宏. 不同根瘤菌、大豆品種、土壤類型對固氮酶活性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：36-39.

[35]于曉波，蘇本營，龔萬灼，等. 玉米-大豆帶狀套作對大豆根瘤性狀和固氮能力的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（9）：1743-1753.

[36]劉春增，呂玉虎，李本銀，等. 不同播期對紫云英“信紫1號”生長狀況、產(chǎn)量及養(yǎng)分積累的影響[J]. 中國土壤與肥料，2018（1）：127-133.

[37]DOVRAT G， MASCI T， BAKHSHIAN H， et al. Drought-adapted plants dramatically downregulate dinitrogen fixation：evidences from Mediterranean legume shrubs[J]. Journal of Ecology，2018，106（4）：1534-1544.

[38]焦銀山. 苦參根瘤菌多樣性及苦參與各種根瘤菌共生關(guān)系混雜性的分子機(jī)制研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[39]NIEWIADOMSKA A， SULEWSKA H， WOLNA-MARUWKA A， et al. The influence of biostimulants and foliar fertilisers on the process of biological nitrogen fixation and the level of soil biochemical activity in soybean （Glycine max L.） cultivation[J]. Applied Ecology and Environmental Research，2019，17（5）：12649-12666.

[40]田艷洪，劉元英，張文釗，等. 不同時期施用氮肥對大豆根瘤固氮酶活性及產(chǎn)量的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（5）：15-19.

[41]MCCULLOCH L A， PORDER S. Light fuels while nitrogen suppresses symbiotic nitrogen fixation hotspots in neotropical canopy gap seedlings[J]. New Phytologist，2021，231（5）：1734-1745.

（責(zé)任編輯：石春林）