【摘要】 目的 探討與分析膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（GDNF）、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP-43）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、S-100蛋白在先天性巨結(jié)腸（HD）患兒中的表達(dá)水平及意義。

方法 選擇2019年9月至2022年10月診治的先天性巨結(jié)腸患兒72例作為巨結(jié)腸組，選擇同期因其他非腸神經(jīng)節(jié)病變而行結(jié)腸手術(shù)的患兒 72 例作為參照組。取兩組的結(jié)腸全層病理標(biāo)本并進(jìn)行 GDNF、GAP-43、NSE 及 S-100 蛋白表達(dá)免疫組化分析，同時(shí)進(jìn)行先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎（HAEC）診斷評(píng)分與相關(guān)性分析，取巨結(jié)腸組的不同腸段組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果 巨結(jié)腸組的結(jié)腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為77.8%、73.6%、81.9%、83.3%，顯著高于參照組的 22.2%、26.4%、20.8%、22.2%（Plt;0.001）。先天性巨結(jié)腸患兒不同結(jié)腸區(qū)域（狹窄段、移行段、擴(kuò)張段、正常段）的GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。巨結(jié)腸組的 HAEC 診斷評(píng)分與參照組相比明顯提高（Plt;0.001）。在巨結(jié)腸組中，Spearman 分析顯示 HAEC 診斷評(píng)分與結(jié)腸全層GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率呈正相關(guān)（Plt;0.001）。

結(jié)論 先天性巨結(jié)腸患兒多伴有 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白的高表達(dá)，與患兒病情存在相關(guān)性，值得臨床關(guān)注。

【關(guān)鍵詞】 先天性巨結(jié)腸；小兒；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43；S-100 蛋白；相關(guān)性

中圖分類號(hào)：R726.5 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ""DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.10.009

Expression levels and significance of GDNF， GAP-43， NSE， and

S-100 proteins in children with Hirscbsprung's disease

YAN Ran1a， GUO Chunna1a， XU Ke2， XU Jinzhong1b

（1a. Department of Pathology， 1b. The Second Department of Surgery， 1. Kaifeng Children's Hospital， Kaifeng 475000，

Henan， China; 2. Department of General Surgery， Affiliated Children's Hospital of Zhengzhou University—Henan

Provincial Children's Hospital ［Zhengzhou Children's Hospital］， Zhengzhou 450000， Henan， China）

【Abstract】 Objective To explore and analyze the expression levels and significance of glial cell derived neurotrophic factor （GDNF）， growth-associated protein-43 （GAP-43）， neuron-specific enolase （NSE）， and S-100 protein in children with Hirschsprung's disease （HD）.

Methods 72 children with HD who were diagnosed and treated from September 2019 to October 2022 were selected as HD group， and 72 children who underwent colon surgery for other non intestinal ganglion lesions during the same period were selected as control group. Colon full-thickness pathological specimens of the two groups were taken， and immunohistochemical analysis of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 protein expressions was performed. At the same time， diagnostic scoring and correlation analysis for Hirschsprungs-associated enterocolitis （HAEC） were conducted， and tissue samples from different intestinal segments of the HD group were collected for testing.

Results The positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in the full-thickness colonic specimens of the HD group were 77.8%， 73.6%， 81.9%， and 83.3%， respectively， which were significantly higher than those in the control group （22.2%， 26.4%， 20.8%， and 22.2%， respectively） （Plt;0.001）. There were statistically significant differences in the positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in different colonic regions （narrow segment， transitional segment， dilated segment， and normal segment） of children with HD （Plt;0.001）. The HAEC diagnostic score of the HD group was significantly improved compared to that of the control group （Plt;0.001）. In the HD group， Spearman analysis showed that there was a positive" correlation between the HAEC diagnostic score and the positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in the full-thickness of the colon （Plt;0.001）.

Conclusion Children with HD are mostly accompanied by high expressions of GDNF， GAP-43， NSE and S-100 protein， which is related with the condition of children and deserves clinical attention.

【Keywords】 Hirscbsprung' s disease（HD）; children; glial cell derived neurotrophic factor （GDNF）; neuron-specific enolase （NSE）; growth related protein-43; S-100 protein; relativity

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung's disease，HD）又稱為腸管無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，是一種腸神經(jīng)系統(tǒng)的先天性異常疾病，主要發(fā)生于小兒［1］。該疾病屬于胃腸道先天性發(fā)育畸形，是造成新生兒期低位腸梗阻的原因之一［2］。HD的基本病理改變包括肌間神經(jīng)叢內(nèi)缺乏、神經(jīng)纖維排列紊亂及遠(yuǎn)端痙攣結(jié)腸腸管組織的黏膜下層部分缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（intestinal ganglion cells，IGCs），導(dǎo)致腸管無(wú)法舒張，呈現(xiàn)痙攣狀態(tài)［3］。目前的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，多種蛋白的異常表達(dá)與HD的發(fā)生有關(guān)［4］。然而，關(guān)于膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（glia cells derived neurotrophic factor，GDNF）、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth-associated protein，GAP-43）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）及S-100蛋白與HD發(fā)生相關(guān)的研究較為匱乏。本文具體探討了GDNF、GAP-43、NSE及S-100蛋白在HD患兒中的表達(dá)水平及其意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年9月到2022年10月，選擇在河南省開(kāi)封市兒童醫(yī)院診治的 HD 患兒 72例作為巨結(jié)腸組，選擇同期因其他非腸神經(jīng)節(jié)病變而行結(jié)腸手術(shù)的患兒 72 例作為參照組。兩組患兒的基線資料對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。見(jiàn)表 1。巨結(jié)腸組中長(zhǎng)段型 22 例，普通型 38 例，短段型12 例；參照組中肛門閉鎖 35 例，直腸閉鎖 37例。倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究；患兒家長(zhǎng)知情同意。

1.2 樣本量計(jì)算方法

將合格率提高至80%，進(jìn)行病例的篩選，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取雙側(cè)檢驗(yàn)0.05，把握度（1-β）取80%，最終得出巨結(jié)腸組、參照組各需要樣本量72例。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合HD診斷標(biāo)準(zhǔn)（結(jié)合臨床查體肛查直腸壺腹部空虛，肛管狹窄，拔指后有爆破樣排氣、排便，腹脹可暫時(shí)緩解者；在病理診斷中，發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失或神經(jīng)干肥大）；其他非腸神經(jīng)節(jié)病變也依據(jù)病理確診（神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少、變形、消失等）；所有患兒都為首次手術(shù)；取樣前未給予任何治療；具有手術(shù)指征的患兒；年齡 2～8 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他主要臟器的先天性畸形患兒；合并高危傳染性疾病的患兒；合并嚴(yán)重心肝腎功能異常者。

1.4 GDNF、GAP-43、NSE 及 S-100 蛋白表達(dá)情況

所有患兒術(shù)前均行常規(guī)經(jīng)肛門鋇灌腸檢查，術(shù)中經(jīng)肛門切除腸段至擴(kuò)張結(jié)腸近端形態(tài)學(xué)上正常腸管處，包括結(jié)腸全層病理標(biāo)本，同時(shí)將巨結(jié)腸組的標(biāo)本在切除腸段中立即分出狹窄段、移行段、擴(kuò)張段、正常段。將標(biāo)本固定脫水后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋與切片，保持切片厚度為4 μｍ。將所有石蠟切片進(jìn)行免疫組化分析，抗體包括 GDNF、GAP-43、NSE、S-100，所有試劑均為鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，稀釋濃度分別為 1∶200、1∶500、1∶200、1∶500。

1.5 HD 相關(guān)性小腸結(jié)腸炎（HAEC）診斷評(píng)分

巨結(jié)腸組所有患兒都給予 HAEC 診斷評(píng)分，評(píng)估的項(xiàng)目包括臨床病史、食鹽水檢查、體格檢查、腹部立位 X線片影像學(xué)檢查等，HAEC評(píng)分系統(tǒng)≥10 分可診斷為 HD相關(guān)性小腸結(jié)腸炎，病情與患者的 HAEC 評(píng)分呈現(xiàn)正相關(guān)性。同時(shí)調(diào)查與記錄所有患兒的一般資料。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究的統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 25.00，HAEC 評(píng)分等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；GDNF 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率等計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 Spearman 分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) "果

2.1 兩組患兒結(jié)腸全層GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比

巨結(jié)腸組的結(jié)腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為 77.8%、73.6%、81.9%、83.3%，顯著高于參照組的 22.2%、26.4%、20.8%、22.2%（P＜0.001）。見(jiàn)表2。

2.2 HD患兒不同結(jié)腸區(qū)域的GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比

HD 患兒不同結(jié)腸區(qū)域（狹窄段、移行段、擴(kuò)張段、正常段）的 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比有明顯差異（P＜0.001），狹窄段和移行段顯著高于擴(kuò)張段和正常段（P＜0.001）。見(jiàn)表3。

2.3 HAEC診斷評(píng)分對(duì)比

巨結(jié)腸組的 HAEC 診斷評(píng)分與參照組相比明顯提高（Plt;0.001）。見(jiàn)表 4。

2.4 相關(guān)性分析

在巨結(jié)腸組中，Spearman分析顯示 HAEC 診斷評(píng)分與結(jié)腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白表達(dá)陽(yáng)性率呈正相關(guān)（Plt;0.001）。見(jiàn)表 5。

3 討 "論

HD在小兒先天性消化道畸形中發(fā)病率居第二位，男女比例約為4∶1。HD患兒在臨床上主要表現(xiàn)為近端正常腸管的代償性擴(kuò)張、糞便淤積和遠(yuǎn)端結(jié)腸痙攣等［5］。目前，越來(lái)越多的HD患兒在早期能夠被診斷，這可有效改善患兒的預(yù)后?，F(xiàn)代研究表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，如果受到內(nèi)外部負(fù)面因素的刺激，神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育、遷移和分化出現(xiàn)障礙，會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失和腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育停頓，從而誘發(fā)HD的發(fā)生［6］。本研究顯示，巨結(jié)腸組的結(jié)腸全層GDNF、GAP-43、NSE和S-100蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于參照組，表明HD患兒普遍伴有GDNF、GAP-43、NSE和S-100蛋白的高表達(dá)。從機(jī)制上分析，GDNF與其受體結(jié)合后能夠激活酪氨酸激酶，進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)靶蛋白磷酸化，傳遞與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等相關(guān)的信號(hào)，導(dǎo)致神經(jīng)化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)異常，同時(shí)伴隨神經(jīng)與腸壁的連接受限，從而引發(fā)HD的發(fā)生［7］。GAP-43是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在調(diào)節(jié)神經(jīng)再生和促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。GAP-43表達(dá)上升會(huì)導(dǎo)致其傳遞的腸神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)相應(yīng)減少，從而增強(qiáng)腸管收縮，導(dǎo)致抑制性神經(jīng)減弱，誘發(fā)HD的發(fā)生。NSE可介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的產(chǎn)生，高表達(dá)的NSE可抑制突觸的分化和構(gòu)成，并影響軸突生長(zhǎng)能力，導(dǎo)致神經(jīng)與效應(yīng)器之間的連接異常，從而造成神經(jīng)化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)腸道功能障礙［8］。S-100是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分解代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作為腸壁神經(jīng)元細(xì)胞的一種標(biāo)記，S-100蛋白的高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞體結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)的改變，使得神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不能移行至腸壁內(nèi)，這也是導(dǎo)致腸功能障礙的重要因素［9］。

HD是一種由多種基因改變引起的遺傳性先天性疾病，確診的依據(jù)是發(fā)現(xiàn)病變腸管中無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［10］。主要的病理變化為病變腸段持續(xù)性痙攣或狹窄狀態(tài)，腸內(nèi)容物在近端結(jié)腸處發(fā)生梗阻，進(jìn)而導(dǎo)致近端結(jié)腸的代償性肥厚和增生等現(xiàn)象［11］。本研究顯示，HD患兒不同結(jié)腸區(qū)域（狹窄段、移行段、擴(kuò)張段、正常段）中，GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率存在明顯差異，狹窄段和移行段的陽(yáng)性率顯著高于擴(kuò)張段和正常段。巨結(jié)腸組的HAEC診斷評(píng)分與參照組相比明顯提高；Spearman分析顯示，HD患兒的HAEC診斷評(píng)分與結(jié)腸全層中GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率呈正相關(guān)，表明HD患兒的GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達(dá)水平與病情存在相關(guān)性。與趙平等的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)S-100蛋白的表達(dá)與先天性巨結(jié)腸的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［9］。任傳濤等人也發(fā)現(xiàn)GAP-43可能參與HD的發(fā)病過(guò)程，這與本研究的結(jié)果一致［10］。分析顯示，HD多發(fā)生于狹窄段和移行段，在病理上可表現(xiàn)為突觸結(jié)構(gòu)異常和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少。而GDNF、GAP-43、NSE、S-100的高表達(dá)可能導(dǎo)致神經(jīng)分化受限，從而增加腸壁肌層中的巨噬細(xì)胞數(shù)量，損傷腸間隙中的星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)生［11-12］。GDNF、GAP-43、NSE、S-100的高表達(dá)并未促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育，反而可能影響神經(jīng)元的定植、存活和分化，導(dǎo)致相關(guān)區(qū)域的腸管缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，因此出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能異常，并形成相應(yīng)的HD組織病理學(xué)表現(xiàn)［13-14］。

總之，先天性巨結(jié)腸患兒多伴有GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的高表達(dá)，這與患兒的病情存在相關(guān)性，值得臨床關(guān)注。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-09-20 修回日期：2024-02-27）

（編輯：梁明佩）