摘要" 為探究脫水脅迫下花生根系生理特性和基因表達(dá)變化，本試驗(yàn)對花生幼苗進(jìn)行脫水處理，觀察其根系狀態(tài)，測定其根系總長度、體積和表面積等形態(tài)指標(biāo)，對根尖細(xì)胞進(jìn)行染色，測定根尖ATP（Adenosine 5’-triphosphate）含量和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，脫水脅迫后根系狀態(tài)較為萎蔫，總長度、體積、表面積和平均直徑均明顯降低，根尖細(xì)胞大量死亡，根系A(chǔ)TP含量明顯降低，線粒體相關(guān)基因表達(dá)受到干擾，可能是線粒體能量生產(chǎn)功能障礙，ATP合成減少，導(dǎo)致根系細(xì)胞死亡和根系生長受阻。研究為進(jìn)一步分析脫水脅迫對花生根系線粒體功能的影響提供參考。

關(guān)鍵詞" 脫水脅迫；花生；根系；ATP含量；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)" S565.2"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2024）21-0022-05

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.21.005

基金項(xiàng)目 肇慶市科技創(chuàng)新指導(dǎo)類項(xiàng)目（2023040308011）；肇慶學(xué)院博士啟動(dòng)基金（210073）；肇慶學(xué)院青年項(xiàng)目（QN202221）；肇慶學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210580054）。

作者簡介 李麗梅（1992—），女，廣東肇慶人，博士，講師，從事作物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制研究。

通信作者 陳剛（1974—），男，安徽宿州人，博士，教授，從事植物細(xì)胞工程和基因工程研究。

收稿日期 2024-05-29

Analysis of physiological characteristics and gene expression of peanut roots under dehydration stress

LI Limei""" LONG Boxi""" WANG Fei""" LIANG Jiayin""" QIU Yi’nan""" ZENG Jiayi""" ZHOU Yueting""" CHEN Gang

（Zhaoqing University， Zhaoqing 526061， China）

Abstract" To investigate the physiological characteristics and gene expression changes of peanut roots under dehydration stress， the peanut seedlings were dehydrated， their root status were observed， their total root length， volume， surface area and other morphological indicators were measured， root tip cells were stained， and root tip ATP （Adenosine 5’-triphosphate） content and mitochondrial related gene expression levels were measured. The results showed that after dehydration stress， the root system was more wilted， with a significant decrease in total length， volume， surface area， and average diameter. A large number of root tip cells died， and the ATP content in the root system was significantly reduced. The expression of mitochondrial related genes were disrupted， which may be due to mitochondrial energy production dysfunction， reduced ATP synthesis， lead to root cell death and root growth inhibition. The research provided a reference for further analyzing the effects of dehydration stress on the mitochondrial function of peanut roots.

Keywords" dehydration stress; peanut; root; ATP content; gene expression

花生是一種重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，是富含油脂和揮發(fā)油類的能源植物之一。近年來花生種植面積逐年擴(kuò)大，產(chǎn)量也隨之提高[1]。姚珍珠等[2]研究表明，花生主要種植在干旱、半干旱地區(qū)，地域降水量偏少或季節(jié)性干旱，可能使花生在不同生育階段受到干旱脅迫的影響。干旱是影響花生生產(chǎn)種植的因素之一。隨著氣候變化加劇，干旱脅迫發(fā)生的頻率和影響面積不斷增加，最終會(huì)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

根系為植物提供了強(qiáng)大的固著和支持作用，同時(shí)又負(fù)責(zé)吸收水分、礦物質(zhì)和儲(chǔ)存營養(yǎng)物質(zhì)等。根系的生長狀況與活力可能影響作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。谷嬌嬌等[3]研究表明，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致水稻的根系總長度、體積、表面積、根系活力和根干重下降，最終影響水稻產(chǎn)量；程貝等[4]研究表明，0.2%和0.3%的鹽濃度脅迫導(dǎo)致番茄幼苗根系干質(zhì)量和根系形態(tài)參數(shù)下降；徐芬芬等[5]研究表明，高濃度鋁脅迫降低了花生根系超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性，增大其根系細(xì)胞質(zhì)膜透性；魯曉峰等[6]研究表明，外源酚酸處理導(dǎo)致草莓根系活力明顯下降，影響其根系總根長、表面積、體積和平均直徑。可見，逆境脅迫會(huì)影響根的生長發(fā)育。

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)最先識(shí)別逆境脅迫的部位之一，其在維持非生物脅迫下細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中發(fā)揮不可或缺的作用[7]。線粒體呼吸系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡調(diào)控脅迫對植物的傷害[8-9]，還可以將應(yīng)激感知轉(zhuǎn)化為能量缺乏信號(hào)，然后重新建立代謝平衡[10]。植物受到脅迫后，呼吸和光合通量發(fā)生變化，產(chǎn)生能量虧缺信號(hào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞器和核基因表達(dá)的全局變化[11]。因此，研究線粒體在逆境脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)變化有助于了解逆境脅迫下線粒體的響應(yīng)機(jī)制。

花生遭遇脫水脅迫時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列的生理反應(yīng)，調(diào)節(jié)自身生長狀態(tài)以提高自身抗旱性。目前在花生對于脫水脅迫的響應(yīng)、抗旱性鑒定方法和抗旱相關(guān)基因定位、克隆等方面已有相關(guān)報(bào)道，而花生根系遭遇脫水脅迫時(shí)其內(nèi)部線粒體功能的響應(yīng)機(jī)制有待深入探究。因此，本試驗(yàn)對花生幼苗進(jìn)行脫水處理，觀察其根系狀態(tài)，測定其根系總長度、體積和表面積等形態(tài)指標(biāo)，對根尖細(xì)胞進(jìn)行染色，測定根尖腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine 5’-triphosphate，ATP）含量和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)變化，為進(jìn)一步分析脫水脅迫對花生根系線粒體功能的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理

選取飽滿均勻的花生種子浸泡萌發(fā)，在光照培養(yǎng)箱（28 ℃，光周期16 L∶8 D）中利用MS培養(yǎng)液培養(yǎng)至二葉期。挑選長勢相同的二葉期花生幼苗，從培養(yǎng)液中取出，脫水8 h作脫水材料。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 根系形態(tài)指標(biāo)測定 利用植物根系分析系統(tǒng)LD-GX01（山東萊恩德智能科技有限公司）對花生根系進(jìn)行掃描，利用根系分析軟件WinRHIZO測定根系總長度、體積、表面積和平均直徑。

1.2.2 根系相對含水量測定 將花生根系剪碎混勻，稱取重量為鮮重，放入105 ℃烘箱中殺青0.5 h，隨后50 ℃烘干至恒重，稱取重量為干重。相對含水量計(jì)算如式（1）。

相對含水量（%）=（鮮重－干重）/鮮重×100""""" （1）

1.2.3 根尖死亡細(xì)胞檢測 將花生根尖放入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染料中，置于室溫下染色15 min，然后用清水清洗5次后觀察拍照，各處理染色進(jìn)行10個(gè)重復(fù)。

1.2.4 根尖ATP含量測定 利用ATP含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定花生根尖ATP含量。稱取0.1 g花生根尖材料，加入1 mL提取液，進(jìn)行冰浴混勻，8 000 r/min， 4 ℃離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入500 μL氯仿充分震蕩混勻，10 000 r/min， 4 ℃離心3 min，取上清液用分光光度計(jì)測定700 nm處吸光度值。

1.2.5 基因表達(dá)分析 采取Trizol方法提取花生RNA，使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾維贊生物科技股份有限公司）的反應(yīng)體系，利用ABI QuantStudio? 6 Flex（Applied Biosystems）實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測基因表達(dá)變化。以花生UBI2為內(nèi)參，通過2- ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。引物序列如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系形態(tài)參數(shù)變化

幼苗期花生處于生長初期，對逆境脅迫敏感。由圖1可知，與對照相比，脫水脅迫后的根系根毛變少、狀態(tài)較為萎蔫。根系掃描分析結(jié)果顯示，由圖2可知，脫水脅迫后的花生根系的總長度、體積、表面積、平均直徑和相對含水量分別為49.58 cm、0.38 cm3、12.17 cm2、3.28 mm和51.11%，均明顯低于對照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），脫水脅迫后的根系相對含水量較對照低41.07百分點(diǎn)，根系總長度較對照降低26.85%，體積較對照降低20.83%，表面積較對照降低28.71%，平均直徑較對照降低9.14%。以上結(jié)果表明，脫水脅迫會(huì)對根系產(chǎn)生不利影響，并抑制其生長。

不同小寫字母表示處理間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.2 根尖細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色

為探究脫水脅迫導(dǎo)致花生根系生長受抑制的部位，對花生根尖細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，結(jié)果如圖3所示，對照的花生幼苗根尖沒有出現(xiàn)細(xì)胞被染色，脫水脅迫后的花生根尖被完全染色。表明脫水脅迫會(huì)引起花生根尖細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致根系生長受抑制。

左邊為對照花生幼苗根尖；右邊為脫水脅迫花生幼苗根尖。

2.3 根尖ATP含量測定

植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)，包括根系生長發(fā)育都需要能量。由圖4可知，脫水脅迫的花生根尖的ATP含量為1.29 μM/DW，較對照降低83.92%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。表明脫水后的根尖ATP含量明顯降低，推測脫水脅迫可能影響花生根尖細(xì)胞的能量代謝，從而導(dǎo)致其死亡。

2.4 根系線粒體相關(guān)基因表達(dá)分析

ATP合酶是利用跨膜質(zhì)子泵催化ADP和磷酸反應(yīng)生成ATP的一類蛋白復(fù)合體。對花生ATP合酶α亞基基因（arahy.0LX666）、編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞基基因（arahy.I2EFRY）、編碼NADH-泛醌氧化還原酶（arahy.8GMV2Y）和編碼CcmFC蛋白基因（arahy.AJMC4E）進(jìn)行表達(dá)量測定，結(jié)果如圖5所示，脫水脅迫后4個(gè)基因的表達(dá)均明顯降低，與對照差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。脫水脅迫后，arahy.0LX666相對表達(dá)量降低，可能是ATP合酶亞基在脫水脅迫下受到損傷，進(jìn)而導(dǎo)致花生根細(xì)胞ATP含量下降；arahy.I2EFRY、arahy.8GMV2Y和arahy.AJMC4E相對表達(dá)量降低，推測是脫水脅迫下花生根尖細(xì)胞線粒體功能出現(xiàn)障礙，ATP合成受阻、含量下降，從而抑制了花生根系的生長。

3 結(jié)論與討論

所有生物體維持生命活動(dòng)都需要能量的供應(yīng)。植物細(xì)胞中的能量轉(zhuǎn)換器是葉綠體和線粒體。植物根細(xì)胞中沒有葉綠體，因此線粒體是進(jìn)行能量生產(chǎn)的主要場所。細(xì)胞有氧呼吸的第二階段和第三階段，即三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化分別在線粒體基質(zhì)和內(nèi)膜上發(fā)生，通過分解碳水化合物產(chǎn)生ATP以滿足細(xì)胞各種代謝過程的能量需求[12]。

王楨珍等[13]研究表明，干旱脅迫抑制了2種藤本植物的氣生根生長，在干旱無支持物處理中表現(xiàn)出最小的氣根長度和數(shù)量。李冠軍等[14]研究表明，土壤鹽脅迫下，木麻黃幼苗根系活力、根系總長、總根表面積、總根體積和總根直徑均降低。本研究結(jié)果與此基本一致。植物在遭受非生物脅迫時(shí)，線粒體作為一個(gè)對環(huán)境變化較為敏感的細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)受到影響。金天等[15]研究表明，缺硼處理降低了線粒體膜流動(dòng)性、線粒體膜電位和細(xì)胞色素c/a值，缺硼明顯抑制枳幼苗的生長發(fā)育，其作用機(jī)制可能與線粒體結(jié)構(gòu)與功能受損有關(guān)；衛(wèi)星等[16]研究表明，干旱脅迫后，水曲柳苗木細(xì)根線粒體數(shù)量減少，分布密度降低，結(jié)構(gòu)遭受破壞，導(dǎo)致線粒體呼吸功能受阻。本研究表明，脫水脅迫導(dǎo)致花生根系線粒體能量生產(chǎn)受到抑制，ATP含量降低。

線粒體ATP合酶的活力與植物對脅迫的耐受性有關(guān)[17]。Moghadam等[18]研究表明，MtATP6是編碼ATP合酶亞基的基因，逆境脅迫下的耐鹽小麥品種中MtATP6表達(dá)的程度和時(shí)間均高于敏鹽品種。Zhang等[19]研究表明，過表達(dá) RMtATP6基因的轉(zhuǎn)基因煙草在幼苗期比未轉(zhuǎn)化煙草對鹽脅迫的耐受性更強(qiáng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫水脅迫下，花生ATP合酶亞基基因（arahy.0LX666）表達(dá)量明顯下調(diào)，推測ATP合酶活力下降，導(dǎo)致能量生產(chǎn)不足，根細(xì)胞死亡。除了ATP合酶之外，肖長運(yùn)[20]研究指出，雙酚A暴露下，大豆根細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶的活性均受到干擾，引起線粒體能量生產(chǎn)功能障礙，導(dǎo)致ATP合成減少，根尖細(xì)胞生長受阻。

綜上，脫水脅迫的花生根系的相對含水量、總長度和體積等均明顯降低，根尖ATP含量較對照也出現(xiàn)下降，脫水脅迫后的線粒體相關(guān)基因表達(dá)受到干擾，推測遭受脅迫后根尖線粒體能量生產(chǎn)功能發(fā)生障礙，可能導(dǎo)致根系生長受阻。研究為進(jìn)一步分析脫水脅迫對花生根系線粒體功能的影響提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 代小冬，杜培，秦利，等. 花生抗旱性研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2021，42（6）：1788-1794.

[2] 姚珍珠，夏桂敏，王淑君，等. 花生對水分脅迫的響應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2016，38（5）：699-704.

[3] 谷嬌嬌，胡博文，賈琰，等. 鹽脅迫對水稻根系相關(guān)性狀及產(chǎn)量的影響[J]. 作物雜志，2019（4）：176-182.

[4] 程貝，王衛(wèi)華. 水培番茄側(cè)根對鹽脅迫的響應(yīng)[J]. 中國蔬菜，2019（8）：47-53.

[5] 徐芬芬，程詩雨，田玉清. 鋁脅迫對花生根系生長和生理特性的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（9）：52-55.

[6] 魯曉峰，杜國棟，邵靜，等. 草莓根系線粒體對外源酚酸脅迫的生理響應(yīng)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（5）：1029-1042.

[7] 王忠妮，李魯華，徐如宏，等. 響應(yīng)植物逆境脅迫的線粒體蛋白研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2018，54（2）：221-231.

[8] DUTILLEUL C，GARMIER M，NOCTOR G，et al. Leaf mitochondria modulate whole cell redox homeostasis，set antioxidant capacity，and determine stress resistance through altered signaling and diurnal regulation[J]. The plant cell，2003，15（5）：1212-1226.

[9] SCHERTL P，BRAUN H P. Respiratory electron transfer pathways in plant mitochondria[J]. Frontiers in plant science，2014，5：163.

[10] PU X J，LV X，TAN T H，et al. Roles of mitochondrial energy dissipation systems in plant development and acclimation to stress[J]. Annals of botany，2015，116（4）：583-600.

[11] LIBERATORE K L，DUKOWIC-SCHULZE S，MILLER M E，et al. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance[J]. Free radical biology and medicine，2016，100：238-256.

[12] LIANG C，ZHANG Y J，CHENG S F，et al. Impacts of high ATP supply from chloroplasts and mitochondria on the leaf metabolism of Arabidopsis thaliana[J]. Frontiers in plant science，2015，6：922.

[13] 王楨珍，范體鳳，翁殊斐. 吸附類2種藤本植物對攀附面和干旱脅迫的生長響應(yīng)[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，44（5）：9-17.

[14] 李冠軍，余雯靜，溫昕怡，等. 鹽脅迫下接種內(nèi)生真菌對短枝木麻黃幼苗生長的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2024，30（4）：777-785.

[15] 金天，徐月美，鄺冠翎，等. 缺硼脅迫對枳幼苗根系生長及線粒體功能的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2024，51（1）：121-132.

[16] 衛(wèi)星，王政權(quán)，張國珍. 干旱脅迫下水曲柳苗木細(xì)根線粒體的形態(tài)及活性變化[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，34（12）：1454-1462.

[17] HAMILTON C A，GOOD A G，TAYLOR G J. Induction of vacuolar ATPase and mitochondrial ATP synthase by aluminum in an aluminum-resistant cultivar of wheat[J]. Plant physiology，2001，125（4）：2068-2077.

[18] MOGHADAM A A，EBRAHIMIE E，TAGHAVI S M，et al. How the nucleus and mitochondria communicate in energy production during stress：nuclear MtATP6，an early-stress responsive gene，regulates the mitochondrial F1F0-ATP synthase complex[J]. Molecular biotechnology，2013，54（3）：756-769.

[19] ZHANG X X，TAKANO T，LIU S K. Identification of a mitochondrial ATP synthase small subunit gene （RMtATP6） expressed in response to salts and osmotic stresses in rice （Oryza sativa L.）[J]. Journal of experimental botany，2006，57（1）：193-200.

[20] 肖長運(yùn). 雙酚A對大豆植株根系生長及線粒體功能與結(jié)構(gòu)的影響[D]. 無錫：江南大學(xué)，2019.

（責(zé)任編輯：吳思文）