關(guān)鍵詞：黑木耳；菌種退化；復(fù)壯；有機(jī)氮源物質(zhì)；螺旋藻粉

中圖分類號：S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0121-06

食用菌產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要地位和作用，隨著該產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，食用菌已成為我國繼糧、菜、油、果、棉之后的第六大種植業(yè)。同其他農(nóng)作物一樣，菌種是食用菌生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，是食用菌產(chǎn)業(yè)的“芯片”，決定著產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量，直接影響食用菌產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。在實際生產(chǎn)中，菌種的長期使用、長期保藏及多次轉(zhuǎn)管傳代等因素，都會導(dǎo)致菌絲活力下降，菌種品質(zhì)與產(chǎn)量降低，為了保持菌株的優(yōu)良性狀不發(fā)生退化且使其保持純度，還需要對菌種進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)。

目前，食用菌菌種復(fù)壯的方法主要有尖端菌絲分離法、基因工程法與培養(yǎng)基更換法等。尖端菌絲分離法簡單易行，但連續(xù)多次使用后會有促進(jìn)菌種退化的風(fēng)險：基因工程法效果較佳，但對技術(shù)人員操作技能的要求較高，且基因工程技術(shù)的使用還存在一定的爭議：相對來說，培養(yǎng)基更換法則兼具操作簡單與效果顯著兩優(yōu)點，在食用菌菌種復(fù)壯培養(yǎng)中被經(jīng)常使用，且有顯著的效果。適宜的培養(yǎng)基能使菌絲體健壯生長，可減少因營養(yǎng)過于豐富或不足等不利因素造成的菌種退化。菌種生長培養(yǎng)基應(yīng)用最多的是PDA培養(yǎng)基，但在實際使用中，不同食用菌有著不同的生物學(xué)特性，都有其特有的適宜培養(yǎng)條件，因此，菌種復(fù)壯培養(yǎng)所需的生長環(huán)境各不相同，具體的菌種還需要通過篩選不同培養(yǎng)環(huán)境而選擇出最適宜的培養(yǎng)基類型。國內(nèi)研究者對雙孢蘑菇母種生長培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯玉米粉培養(yǎng)基最適合雙孢菇菌絲體生長。還有研究表明，在PDA培養(yǎng)基中添加玉米粉、麩皮與酵母粉等成分，有利于杏鮑菇母種菌絲體的生長。

黑木耳（Auricularia auricula）是一種廣為人知的食藥用菌，不僅富含粗纖維、蛋白質(zhì)及各種礦物質(zhì)，還具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血糖等多種功能，有著廣闊的應(yīng)用前景與經(jīng)濟(jì)價值，是我國重要的食用菌品種之一。隨著黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其菌種在保藏與復(fù)壯過程中出現(xiàn)老化、退化等問題，進(jìn)而影響到黑木耳的產(chǎn)量與品質(zhì)。為此，本試驗通過設(shè)置PDA培養(yǎng)基中添加不同有機(jī)氮源物質(zhì)處理，研究其對老化、退化黑木耳菌種復(fù)壯效果的影響，以期為延緩黑木耳菌種的老化、退化提供技術(shù)支持和理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株 供試已退化黑木耳菌株保藏于河西學(xué)院甘肅省應(yīng)用真菌工程實驗室甘肅省食藥用菌菌種庫，保藏號為JZK0160。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑 對照組培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20%、MgSO₄ 0.1%、KH₂PO₄ 0.1%、瓊脂粉2%、葡萄糖2%，自然pH值。處理組培養(yǎng)基：對照組培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加玉米粉、蛋白胨、螺旋藻粉、麥芽浸膏、牛肉膏與酵母粉，含量均為1g/L，配制成6種添加不同有機(jī)氮源的菌種復(fù)壯培養(yǎng)基。螺旋藻粉購自甘肅凱源生物技術(shù)開發(fā)中心有限責(zé)任公司，其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2培養(yǎng)方法及菌絲體取樣

試驗于2023年3—10月在河西學(xué)院甘肅省應(yīng)用真菌工程實驗室內(nèi)進(jìn)行。

采用平板培養(yǎng)法，將生物學(xué)效率降低了52.56%的退化菌種菌絲體（1mm×1mm）接種于70mm平板中心部位，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每天定時在平板底部以接種塊為中心劃兩條垂直線，用數(shù)顯卡尺測量菌落直徑，于菌絲即將長滿平板時停止測量，并測算菌絲生長速度。待菌絲長滿平板后，輕輕將菌絲體刮下，用液氮迅速冷凍，于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3指標(biāo)測定及方法

1.3.1菌絲生長速度及生物量測定 菌絲生長速度參照胡延如等的方法測定，菌絲生物量參照Diamantopoulou等的方法測定。

1.3.2菌絲體營養(yǎng)成分含量測定 蛋白質(zhì)含量測定采用近紅外光譜法，多糖含量測定采用苯酚硫酸法。

1.3.4菌絲體酶活性測定 過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照決超的方法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用鉬酸銨比色法，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性測定采用二硫代雙硝基苯甲酸直接法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析與作圖，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1 PDA培養(yǎng)基中添加不同氮源物質(zhì)對菌絲生長速度及生物量的影響

如圖1所示，相較于對照組（CK），添加螺旋藻粉處理組與麥芽浸膏處理組的菌絲生長速度顯著提高，其菌絲生長速度分別增加34.23%和26.73%，菌絲生物量分別增加41.67%和25.00%。2.2 PDA培養(yǎng)基中添加不同氮源物質(zhì)對菌絲蛋白質(zhì)與多糖含量的影響

圖2顯示，菌絲蛋白質(zhì)與多糖含量在CK與部分處理組之間表現(xiàn)出顯著差異，添加不同有機(jī)氮源物質(zhì)對復(fù)壯菌絲體營養(yǎng)成分的影響各不相同。與CK相比，添加麥芽浸膏、螺旋藻粉、蛋白胨處理組的菌絲蛋白質(zhì)含量分別增加41.07%、36.26%和17.96%，添加麥芽浸膏、螺旋藻粉處理組的菌絲多糖含量分別增加21.94%和35.13%，其他處理組的蛋白質(zhì)、多糖含量間均無顯著差異?？傮w來說，添加螺旋藻粉與麥芽浸膏處理組培養(yǎng)基上的復(fù)壯菌絲體含蛋白質(zhì)與多糖較高。

2.3 PDA培養(yǎng)基中添加不同氮源物質(zhì)對菌絲體活性氧含量的影響

2.4 PDA培養(yǎng)基中添加不同氮源物質(zhì)對菌絲體抗氧化酶活性的影響

由表1可知，相較于CK，菌絲體POD活性顯著升高的是添加螺旋藻粉、麥芽浸膏處理，其活性值分別上升49.23%、59.98%。添加螺旋藻粉處理菌絲體SOD、CAT活性均表現(xiàn)為最高值，較對照組分別升高24.85%、40.04%，差異顯著。值得注意的是，菌絲體GPX活性在處理組與對照組之間無顯著差異。

3討論與結(jié)論

黑木耳作為我國栽培產(chǎn)量第二的食用菌品種，在食用菌產(chǎn)業(yè)中具有重要地位，享有“素中之葷”、“中餐中的黑色瑰寶”等美稱，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值與開發(fā)潛力。在實際栽培生產(chǎn)中，黑木耳菌種通常以菌絲體的形式進(jìn)行傳代利用與復(fù)壯保藏。近年來，隨著黑木耳產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級及生產(chǎn)設(shè)施化、規(guī)?；⒓s化的快速發(fā)展，黑木耳菌種在多次傳代與無性繁殖過程中會出現(xiàn)一定程度的變異，且隨著菌絲體性狀變異的不斷積累而致菌種出現(xiàn)明顯的老化、退化現(xiàn)象，進(jìn)而影響黑木耳的栽培品質(zhì)與產(chǎn)量，阻礙黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。有研究表明，黑木耳菌絲生長速度、菌絲分枝數(shù)及分解木屑料的能力隨著繼代次數(shù)的增加而逐漸降低。另一方面，食用菌產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主力產(chǎn)業(yè)之一，不僅是鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的新支柱與實施農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的新路徑，更是“一帶一路”戰(zhàn)略實施的新方向與大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新引擎。2020年4月20日，習(xí)近平總書記在陜西省柞水縣小嶺鎮(zhèn)金米村考察脫貧攻堅工作時就夸贊，該地區(qū)黑木耳產(chǎn)業(yè)為“小木耳，大產(chǎn)業(yè)”。因此，尋找較優(yōu)的黑木耳菌種復(fù)壯方法生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種，已成為食用菌生產(chǎn)企業(yè)、合作社及菇農(nóng)們的迫切需求。

PDA培養(yǎng)基常用于食用菌菌種培養(yǎng)，其配方長期固定不更換會減弱菌絲體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而導(dǎo)致菌種進(jìn)一步退化，因此，在食用菌栽培生產(chǎn)中，適當(dāng)改進(jìn)培養(yǎng)基配方是用來進(jìn)行菌種復(fù)壯、防止菌種退化的有效方法。在菌絲生長發(fā)育過程中，氮源可為蛋白質(zhì)、核酸與碳水化合物等的合成提供原料，是培養(yǎng)基組分中重要的營養(yǎng)源之一。孫瑤等的研究表明，更換培養(yǎng)基氮源可明顯增加馬鞍菌菌絲生長速率，提升菌絲生長指數(shù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加螺旋藻粉培養(yǎng)基的黑木耳菌絲生長速度與菌絲生物量顯著增加。食用菌菌絲合成蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)的能力會隨著菌種的退化而逐漸減弱，因此通過測定菌絲體蛋白質(zhì)與多糖含量，可在一定程度上反映出菌種的復(fù)壯效果。本研究發(fā)現(xiàn)，添加麥芽浸膏培養(yǎng)基的菌絲蛋白質(zhì)含量最高，添加螺旋藻粉培養(yǎng)基次之；添加螺旋藻粉培養(yǎng)基的菌絲多糖含量最高，添加麥芽浸膏培養(yǎng)基次之。以上結(jié)果說明，添加螺旋藻粉與麥芽浸膏的培養(yǎng)基能在一定程度上有效復(fù)壯黑木耳菌種。

綜上所述，PDA培養(yǎng)基中添加螺旋藻粉可對黑木耳菌種進(jìn)行有效復(fù)壯。螺旋藻是一種優(yōu)質(zhì)微藻資源，蛋白質(zhì)含量高，可為各類細(xì)胞生長提供營養(yǎng)蛋白，還富含維生素、多糖、礦質(zhì)元素與多種微量元素，被稱為“細(xì)胞工廠”。目前，以螺旋藻為原料的研究多集中在保健食品與藥品等方面，與食用菌菌種復(fù)壯相關(guān)的研究鮮見報道，因此在PDA培養(yǎng)基中添加螺旋藻粉可有效復(fù)壯黑木耳菌種的生理機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可為黑木耳及其他食用菌菌種的復(fù)壯研究提供理論基礎(chǔ)與參考依據(jù)。