關(guān)鍵詞：玉米；莠去津；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S513：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）11-0028-08

玉米（Zea mays L.）作為主要的糧食、飼料和能源作物，在保證國(guó)家糧食安全和民生發(fā)展方面發(fā)揮著不可替代的作用。玉米生長(zhǎng)受雜草危害嚴(yán)重，雜草與玉米在地上激烈爭(zhēng)奪光照資源，并影響通風(fēng)，在地下?tīng)?zhēng)奪養(yǎng)分與水分，嚴(yán)重影響玉米的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，雜草還是一些病蟲(chóng)害的傳播媒介，易引發(fā)蚜蟲(chóng)、病毒病等病蟲(chóng)害?；瘜W(xué)除草是當(dāng)前玉米生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的除草方式，具有效果好、成本低等優(yōu)勢(shì)。然而，目前玉米生產(chǎn)中使用的除草劑種類繁多，如酰胺類、磺酰脲類、磺酰胺類、脲類、苯氧羧酸類和有機(jī)雜環(huán)類等，它們的作用方式、除草效果以及殘留等存在一定差異。莠去津（atrazine）作為三嗪類除草劑，屬選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，苗前、苗后均可使用，其通過(guò)抑制Di蛋白的活性，干擾光合作用過(guò)程中的電子傳輸系統(tǒng)，從而阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育，達(dá)到除草效果。由于莠去津的殺草功效好且價(jià)格較低，在世界各地迅速得到了應(yīng)用和推廣，成為使用最廣泛使用的除草劑之一。莠去津一般在玉米3～5葉期、雜草2～4葉期時(shí)施藥，對(duì)玉米較為安全。但是，不同玉米材料對(duì)莠去津也存在藥害差異，有的材料抗性較好，而有的材料則表現(xiàn)出藥害較重的現(xiàn)象，如噴施莠去津后呈褪綠斑、變黃、部分苗葉緣皺縮、葉片卷縮成筒狀等癥狀。而對(duì)造成這種抗性差異的遺傳機(jī)制的認(rèn)知還存在局限。因此，解析玉米種質(zhì)抗莠去津差異的遺傳機(jī)制，選育出有耐／抗除草劑內(nèi)源基因的玉米種質(zhì)資源，可減少莠去津除草劑對(duì)玉米雜交后代的藥害程度。在保證除草效果的基礎(chǔ)上，篩選出耐除草劑玉米種質(zhì)資源并深入解析其遺傳基礎(chǔ)對(duì)玉米抗莠去津除草劑種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

迄今為止，連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析方法均被證明是復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)解析的有效方法。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用上述兩種分析方法對(duì)作物抗除草劑性狀進(jìn)行QTL（quantitative trait locus，數(shù)量性狀基因座）定位研究。通過(guò)QTL連鎖定位，Bhoite等以小麥W7984×Westonia重組自交系為材料，苗期使用三嗪類除草劑處理，以相對(duì)葉綠素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共檢測(cè)到4個(gè)QTLs，其中4A染色體上2個(gè)，2D染色體和1A染色體上各1個(gè)；Javid等以豌豆Kaspa×PBA的重組自交系為材料，在除草劑脅迫條件下，以豌豆受藥害綜合評(píng)級(jí)為表型，檢測(cè)到16個(gè)抗莠去津除草劑相關(guān)QTLs；張銳劍以CA19×浙粳22重組自交系群體F_4：5的158個(gè)株系為材料，在三葉期噴濃度為2g/L的草甘膦溶液，以枯死時(shí)間、存活率和枯死指數(shù)3個(gè)性狀作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共檢測(cè)到3個(gè)耐草甘膦相關(guān)QTLs。但是，針對(duì)玉米抗莠去津差異QTL定位的研究較少。

本研究以包含234份玉米自交系關(guān)聯(lián)群體為材料，基于前期包含56000個(gè)SNPs（single nucle-otide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）芯片的基因型鑒定結(jié)果和該群體抗莠去津表型評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析，規(guī)?；b定控制玉米抗莠去津相關(guān)性狀變異的QTNs（ quantitative trait nu-cleotides，數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)）。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析方法，挖掘相關(guān)候選基因，為解析玉米抗莠去津變異的遺傳基礎(chǔ)提供理論支持，為培育抗除草劑玉米種質(zhì)資源提供科學(xué)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和田間設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用包含234份玉米自交系的關(guān)聯(lián)群體為材料，其中溫帶自交系96份，熱帶自交系138份，均種植于貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所溫室大棚內(nèi)。玉米種子播于蛭石和營(yíng)養(yǎng)土按照1：1比例混合的基質(zhì)內(nèi)，每份自交系播5粒種子，重復(fù)3次。溫室培養(yǎng)條件為：晝、夜溫度分別為30、26℃，自然光照。玉米二葉期噴施生產(chǎn)上常用的38%莠去津除草劑（12mL/L），對(duì)照組噴施清水。

1.2葉綠素含量（SPAD）測(cè)定及分析

根據(jù)《除草劑防治轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米田雜草田間藥效實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》，于噴藥后第15天，使用攜便式葉綠素儀檢測(cè)每株幼苗第2片葉的葉綠素含量。

利用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS Statistics 27.0.1軟件進(jìn)行基本描述、方差等數(shù)據(jù)分析。

1.3關(guān)聯(lián)群體抗藥性調(diào)查與分析

噴施莠去津后15天，按照除草劑藥害癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1）進(jìn)行藥害分級(jí)調(diào)查，根據(jù)抗性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表2）確定玉米對(duì)莠去津的抗藥級(jí)別。玉米受害率計(jì)算公式為：X（%）=[∑（N×S）/（T×M）]×100。其中：X為受害率，N為同級(jí)受害株數(shù)；S為級(jí)別值；T為總株數(shù)；M為最高級(jí)別。

1.4基因型鑒定與分析

基因型鑒定工作項(xiàng)目組前期已經(jīng)完成。即采用CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)。將質(zhì)檢合格的DNA原液一部分稀釋至100ng/μL送康普生物（北京）科技有限公司進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)測(cè)定，一部分-20℃保存?zhèn)溆?。利用MaizeSNP50芯片對(duì)關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行基因型鑒定，剔除數(shù)據(jù)缺失頻率gt;20%、最小等位基因頻率lt;5%的SNP標(biāo)記，剔除無(wú)明確位置的SNP標(biāo)記，獲得高質(zhì)量的SNP標(biāo)記，用于全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.5全基因組關(guān)聯(lián)分析

結(jié)合已有的基因型和表型評(píng)價(jià)結(jié)果，使用R軟件GAPIT（genome associated prediction integrat-ed tool）程序包，對(duì)SPAD以及玉米受害率進(jìn)行全基因組掃描，顯著性閾值設(shè)置為Plt;0.001。根據(jù)項(xiàng)目組前期的研究結(jié)果，該群體的平均LD（link-age disequilibrium，連鎖不平衡）距離為50kb。根據(jù)Wu等描述的方法，參照各SNP在基因組中的物理位置，利用MaizeGDB（https：//www.maizegdb.org/genome/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Uniprot（https：//www.uniprot.or）等數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)顯著性SNP位點(diǎn)上、下游各50kb區(qū)段內(nèi)的基因進(jìn)行候選基因篩選及功能注釋。

2結(jié)果與分析

2.1噴施莠去津?qū)τ衩兹~片葉綠素含量的影響

由表3可見(jiàn)，玉米噴施莠去津處理組與對(duì)照組SPAD值有較大差異，組間變異系數(shù)為4.05%。從直方圖擬合曲線上看，關(guān)聯(lián)群體處理與對(duì)照的SPAD均符合正態(tài)分布。方差分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)聯(lián)群體噴藥處理組與對(duì)照組葉綠素含量呈極顯著差異（圖1）。

2.2玉米幼苗莠去津抗性鑒定結(jié)果

玉米對(duì)莠去津除草劑抗感數(shù)量和比例均呈偏正態(tài)分布趨勢(shì)（圖2），其中，高抗的材料較少，感的材料較多，其次分別為中抗、抗以及高感材料。受害率≤10%的高抗材料有20份，占8.55%：受害率gt;10%～30%的抗性材料有40份，占17.09%：受害率gt;30%～50%的中抗材料54份，占比23.08%：受害率gt;50%～70%的感的材料有91份，占38.89%；受害率gt;70%的高感的材料有29份，占12.39%。48.72%的材料表現(xiàn)出中抗及以上，感及高感材料共占51.28%。

2.3玉米葉片SPAD值及玉米受害率全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（圖3、圖4）顯示，共檢測(cè)到62個(gè)莠去津藥害脅迫下與SPAD值和受害率顯著相關(guān)的QTNs。與SPAD值相關(guān)的顯著QTNs有35個(gè)，分別位于玉米的1、3、4、5、6、7、8、9號(hào)染色體上，其中1號(hào)染色體上有10個(gè)，3號(hào)和6號(hào)染色體上各有5個(gè)，4號(hào)染色體上有8個(gè)，5、8號(hào)和9號(hào)染色體上各有2個(gè)，7號(hào)染色體上有1個(gè)。與玉米受害率顯著相關(guān)的QTNs位點(diǎn)有27個(gè)，分別位于玉米的1、2、3、4.8、9、10號(hào)染色體上，其中1號(hào)染色體上有7個(gè)，2、8、9號(hào)染色體上各有3個(gè)，3號(hào)染色體上有2個(gè)，4號(hào)染色體上有5個(gè)，10號(hào)染色體上有4個(gè)。其中PZE-104041162和PZE-104041163為兩性狀中均定位到的QTNs位點(diǎn)。

2.4玉米抗莠去津相關(guān)候選基因預(yù)測(cè)

針對(duì)鑒定出的62個(gè)玉米抗莠去津除草劑相關(guān)性狀顯著性QTNs位點(diǎn)，分別在目標(biāo)位點(diǎn)上、下游各50 kb范圍內(nèi)篩選候選基因。結(jié)合基因功能注釋，共挖掘出57個(gè)與玉米抗莠去津相關(guān)的候選基因，其中，與SPAD值相關(guān)的基因23個(gè)，與玉米受害率相關(guān)的基因34個(gè)，含未知功能基因19個(gè)。其中，候選基因GRMZM2C030768由共定位QTNsPZE-104041162和PZE-104041163共同篩選到，編碼SWI/SNF及基質(zhì)相關(guān)的肌動(dòng)蛋白依賴性染色質(zhì)亞家族A成員3-樣3調(diào)節(jié)因子：候選基因GRMZM2C311465編碼超敏反應(yīng)蛋白2（HIR2），GRMZM2C017536編碼DUF4378結(jié)構(gòu)域蛋白，GRMZM2G172826編碼細(xì)胞色素P45071A1，GRMrZM2G129431編碼鋅指相關(guān)蛋白，GRMZM2G334791編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（SAPK4）、GRMZM2G177878編碼SR01蛋白，這些基因主要參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物免疫、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，生物脅迫以及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程等；GRMZM2C064962、GRMZM2C457309、GRMZM2G157010等19個(gè)功能基因未知。各候選基因信息見(jiàn)表4。

3討論與結(jié)論

本研究共鑒定出62個(gè)與玉米抗莠去津除草劑相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的QTNs（Plt;0.001），分析獲得相關(guān)候選基因57個(gè)。其中候選基因GRMZM2G311465編碼HIR2蛋白，參與植物免疫反應(yīng)、花青素合成、生物脅迫以及非生物脅迫應(yīng)答等過(guò)程。Nadimpalli等在玉米中發(fā)現(xiàn)Zm-HIR2與植物抗病反應(yīng)相關(guān)，參與植物防御；在擬南芥中，AtHIR2參與RPS2復(fù)合物的形成、RPS2介導(dǎo)的ETI反應(yīng)，以及對(duì)丁香假單胞菌的抗性：在蘋(píng)果中，MdHIR2與MdJA22互作可增強(qiáng)JAZ蛋白的穩(wěn)定性從而抑制花青素的合成。候選基因GRMZM2G017536在擬南芥中參與脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控，Koops等發(fā)現(xiàn)其參與擬南芥的激素調(diào)控應(yīng)答，不僅多方面調(diào)控植物發(fā)育，還參與植物對(duì)溫度、干旱、滲透和鹽脅迫的應(yīng)答。候選基因GRMZM2G172826編碼細(xì)胞色素P45071A1，植物細(xì)胞色素P450主要參與生物合成與生物解毒途徑。CYP71A1的首次報(bào)道是在鱷梨中，編碼一個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的酶，Chen等研究發(fā)現(xiàn)水稻在使用五氟磺草胺除草劑后45071A1被過(guò)表達(dá)和誘導(dǎo)。候選基因GRMZM2G129431編碼光系統(tǒng)Ⅰ的PSI-H亞基，Lunde等研究表明在缺乏PSI亞基PSI-H的情況下，捕光天線蛋白無(wú)法將能量轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)Ⅰ，并且狀態(tài)轉(zhuǎn)換受損。Varotto等發(fā)現(xiàn)敲除PSI-H的擬南芥葉片較野生型顏色淺，其葉綠素含量相對(duì)減少，生長(zhǎng)速度顯著降低，在逆境脅迫下可能導(dǎo)致植物受到更嚴(yán)重的影響。候選基因GRMZM2G334791編碼的SAPK4是響應(yīng)代謝、生物和非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵元件。Diedhiou等通過(guò)培養(yǎng)過(guò)表達(dá)SAPK4的轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)SAPK4的表達(dá)可以促進(jìn)鹽脅迫下種子的萌發(fā)與成熟植株的生長(zhǎng)發(fā)育。鹽脅迫下，過(guò)表達(dá)SAPK4的水稻Na+和Cl-積累量減少，光合作用改善。候選基因CRMZM2G177878在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，應(yīng)對(duì)干旱、冷、氧化、鹽堿以及重金屬等非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。候選基因GRMZM2G030768編碼SWI/SNF及基質(zhì)相關(guān)的肌動(dòng)蛋白依賴性染色質(zhì)亞家族A成員3-樣3調(diào)節(jié)因子，屬于SWI/SNF蛋白家族，與染色體重塑相關(guān)，主要參與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖發(fā)育、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)以及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程，其具體功能尚未可知。這些QTNs可作為后續(xù)玉米種質(zhì)抗莠去津改良的分子標(biāo)記，所分析的基因可能是影響玉米對(duì)莠去津抗性的重要候選基因，為開(kāi)發(fā)玉米抗莠去津分子標(biāo)記、深入研究基因功能等提供重要靶標(biāo)。