摘要：為探究黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)土壤多環(huán)芳烴（PAHs）賦存及其與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，本研究以網(wǎng)格布點(diǎn)法選取黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)60個(gè)表層土壤樣本測定PAHs，并根據(jù)保護(hù)區(qū)功能區(qū)的劃分選取6個(gè)不同區(qū)域測定土壤微生物，利用相關(guān)性分析和蒙特卡洛排列檢驗(yàn)PAHs和微生物群落的關(guān)系。結(jié)果表明，在黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，西北部土壤PAHs含量高于東南部，土壤PAHs對(duì)微生物種群影響較大，且與多數(shù)細(xì)菌和古生菌在門水平上呈極顯著正相關(guān)。其中，二苯并[a，n]蒽（DBA）與擬桿菌門、芘（Pyr）與變形菌門、苯并[k]熒蒽（BkF）與厚壁菌門、苯并[g，h，I]芘（BgP）與深古菌門、苯并[b]熒蒽（BbF）與奇古菌門、DBA與廣古菌門之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.846、0.912、0.710、0.731、0.649、0.596。DBA、Pyr和Phe對(duì)細(xì)菌影響較大，Phe、Pyr和Ace對(duì)古生菌影響較大?？梢姡赑AHs脅迫下細(xì)菌和古生菌豐度皆有不同程度增加，表現(xiàn)出一定的PAHs降解潛力。

關(guān)鍵詞：黃河三角洲；多環(huán)芳烴；微生物群落結(jié)構(gòu)；相關(guān)分析；蒙特卡洛排列檢驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S154.34：X592 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 10-0127-07

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指含兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的芳烴，其造成的環(huán)境污染是目前世界各國所面臨的重大環(huán)境與公共健康問題之一。由于其性質(zhì)穩(wěn)定和難于降解等特性，PAHs在土壤環(huán)境中呈不斷積累的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著土壤生態(tài)服務(wù)功能、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康等。因此，PAHs是我國土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求嚴(yán)格管控的一類持久性有機(jī)污染物。

土壤是微生物生存的載體，包含了自然界中絕大部分的微生物群落。土壤微生物作用很多，如分解有機(jī)質(zhì)、分解礦物質(zhì)、固定氮素等，在降解PAHs的過程中同樣扮演著非常重要的角色。土壤中有多種微生物可以PAHs為碳源和能源或者利用其他物質(zhì)作為共代謝底物進(jìn)行PAHs的降解和礦化。微生物降解PAHs的速率，除了受PAHs本身的物理、化學(xué)性質(zhì)影響外，還會(huì)受到土壤溫度、濕度、土壤類型、通氣狀況、養(yǎng)分條件等外在因素的影響。PAHs也影響著土壤微生物群落的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，被PAHs污染后的土壤，其微生物群落的組成和活性、酶活性、降解基因等都會(huì)發(fā)生一定的變化。PAHs的污染程度對(duì)土壤微生物的數(shù)量也有一定的影響，當(dāng)污染程度較為嚴(yán)重時(shí)，細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量隨著污染程度的增加逐漸減少。但有研究表明，微生物本身具有適應(yīng)性的遺傳機(jī)制，微生物會(huì)因?yàn)镻AHs濃度的增加逐漸形成可以降解PAHs的優(yōu)勢(shì)菌群，進(jìn)一步利用土壤中的PAHs作為碳源或形成共代謝來降解PAHs?？梢姡骄縋AHs的賦存及其與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，將有助于揭示土壤中PAHs的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。

黃河三角洲是中國暖溫帶最年輕的濕地，該地區(qū)不僅是水鳥以及其他鳥類遷徙的重要轉(zhuǎn)折站，也為多種生物提供食物和棲息、孵化的場所。然而，在過去50年里，黃河三角洲已成為中國重要的石油工業(yè)基地。石油開采增加了PAHs排放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)的健康造成了巨大的威脅。因此，本研究測定土壤PAHs含量并對(duì)其與土壤微生物之間的關(guān)系進(jìn)行分析，以期為黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)的生態(tài)環(huán)境保護(hù)及有機(jī)污染物治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

黃河三角洲國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于山東省東營市的黃河人?？?，地理坐標(biāo)為118°33＇～119°20＇E，37°35＇-38°12＇N，是以保護(hù)鳥類以及新生濕地生態(tài)系統(tǒng)為主要目標(biāo)的濕地型自然保護(hù)區(qū)。總面積15.3萬hm2，其中核心區(qū)5.8萬hm2，緩沖區(qū)1.3萬hm2，實(shí)驗(yàn)區(qū)8.2萬hm2。分為南北兩個(gè)區(qū)域，南部區(qū)域位于現(xiàn)行黃河人?？冢娣e10. 45萬hm2：北部區(qū)域位于1976年改道后的黃河故道人?？?，面積4.85萬hm2。土地為黃河泥沙填充渤海凹陷成陸的海相沉積平原，地勢(shì)平坦寬廣。

1.2 土壤PAHs含量的空間分布

實(shí)驗(yàn)區(qū)東西分布，土壤PAHs含量由西北部逐漸降低隨后在東部升高。西部和北部地區(qū)PAHs平均含量為69.31 - 80.02 ng/g，南部地區(qū)PAHs平均含量為28.74 - 40.46 ng/g，東部地區(qū)PAHs平均含量為61.61-69.31 ng/g（圖1）。

1.3 試驗(yàn)區(qū)域劃分及土壤微生物樣品采集與處理

根據(jù)保護(hù)區(qū)功能分區(qū)（實(shí)驗(yàn)區(qū)、緩沖區(qū)、核心區(qū)）具體位置（圖2）和PAHs空間分布情況，選取6個(gè)點(diǎn)位進(jìn)行取樣，區(qū)域位置見圖1和表1。以網(wǎng)格布點(diǎn)法在每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取10個(gè)樣點(diǎn)采集表層土壤，共選取60個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)重復(fù)3次。每個(gè)區(qū)域10個(gè)樣點(diǎn)的土壤樣品充分混勻后分成兩部分，一部分用于土壤PAHs檢測，一部分-80℃保存用于土壤微生物測定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 土壤PAHs提取與測定

采用Chai等的方法提取土壤中PAHs，收集萃取液和洗脫液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，恒溫下濃縮至于，用甲醇定容至2mL并通過0.22 μm膜過濾，用HPLC/UV-FLD測定濾液中PAHs的含量。測定結(jié)果使用美國環(huán)保署提出的優(yōu)先控制16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比對(duì)。

1.4.2 高通量測序

利用CTAB法提取土壤總樣品DNA，用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，使用TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列選取515A（5＇- GT-GCCAGCMGCCGCGGTAA -3＇）和806R（5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇）。測序工作委托北京奧維森科技有限公司通過Illumina MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PAHs基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行分析運(yùn)算，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與多樣性分析，確定微生物群落中OTU水平的總體結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究區(qū)土壤PAHs的含量

如表2所示，16種優(yōu)先檢測的PAHs在研究區(qū)內(nèi)均被檢出，其中Ace、芴（Fl）、Phe、蒽（Ant）、熒蒽（Flu）、BbF、BkF檢出率均為100%，萘（Nap）、Pyr、苯并[a]芘BaP、InP、BgP檢出率也均達(dá)到90%以上，只有苯并[a]蒽（BaA）、屈（CHR）和DBA的檢出率不足30%?？侾AHs含量介于10.92 - 125.98 ng/g之間，均值為56. 06ng/g，中值為53.42 ng/g。其中，低環(huán)PAHs（2-3環(huán)）含量范圍為7.43 - 83.36 ng/g，均值為32.13ng/g，中值為25.76 ng/g;高環(huán)PAHs（4-6環(huán)PAHs）含量范圍為3.14-66.91 ng/g，均值為23.93ng/g，中值為20.57 ng/g。致癌性最強(qiáng)的BaP含量范圍為0- 10.54 ng/g。

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況

細(xì)菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)如圖3所示。變形菌門相對(duì)豐度較高，占38.38% - 51.83%，其中E點(diǎn)位的相對(duì)豐度最高：土壤PAHs含量最低的A、B兩點(diǎn)位的綠灣菌門相對(duì)豐度較高，分別為22.13%、21.90%；擬桿菌門相對(duì)豐度在土壤PAHs含量較高的C點(diǎn)位明顯高于其他5個(gè)點(diǎn)位，較A、B兩點(diǎn)位分別高23.66%和24.66%。

古生菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)見圖4。齊古菌門相對(duì)豐度在土壤PAHs含量較高的C點(diǎn)位占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為97.18%：廣古菌門相對(duì)豐度在F點(diǎn)位占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為87.18%；深古菌門在A、B兩點(diǎn)位的相對(duì)豐度分別為6.42%和22.23%，高于土壤PAHs含量較高的其他4個(gè)點(diǎn)位。

2.3 土壤PAHs與土壤微生物間的相關(guān)性分析

2.3.1 土壤PAHs與土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性

土壤PAHs與土壤細(xì)菌群落相關(guān)性矩陣如表3所示。在門水平上，酸桿菌門與Flu、CHR呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.728、0.627：放線菌門與BgP呈極顯著正相關(guān)，與Phe、BaP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.754、-0.597、-0.590；擬桿菌門與DBA呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.846；綠彎菌門與Nap、DBA呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.710、-0.820;桿菌門與CHR、BbF、Fl呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.980、0.806、-0.636;纖維桿菌門與Flu和CHR呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.755和0.866；厚壁菌門與Flu、Pyr、CHR、BbF、BkF呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.638、0.667、0.615、0.759、0.710，與Phe呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.607：芽單胞菌門與InP和BgP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.748和-0.740；硝化螺旋菌門與Nap、Ace、Fl和總PAHs呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.930、0.703、0.682和0.796;浮霉菌門與Pyr、BaA、BgP、Phe、Ant、總PAHs呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.799、0.828、0.630、-0.895、-0.684、-0.554;變形菌門與Pyr、BaA、BbF、BkF、Phe呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0. 912、0.739、0.833、0.666、-0.817：螺旋菌門與Ace和InP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0. 595和-0.615;疣微菌門與BgP呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.669，與BbF、BkF、BaP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.678、-0.699、-0.893；藍(lán)藻菌門與BgP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.629。

2.3.2 土壤PAHs與土壤古生茵群落的相關(guān)性

土壤PAHs與土壤古生菌群落相關(guān)性矩陣如表4所示。在門水平上，深古菌門和廣古菌門多與PAHs各種化合物呈負(fù)相關(guān)。其中深古菌門與BgP呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.731，與BkF和BaP呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0. 711和-0.749，與Acy呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.558;廣古菌門與DBA呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.596，與Ace呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.592；奇古菌門與Pyr、BaA和BbF呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.861、0.825和0.649，與Phe和Ant呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.924和-0.670。

2.4 冗余分析

2.4.1 土壤PAHs與土壤細(xì)菌群落的冗余分析

土壤PAHs與土壤細(xì)菌之間存在顯著相關(guān)性，其貢獻(xiàn)率如圖5所示。各成分貢獻(xiàn)率由高到低排序?yàn)镈BA（50.2%）、Pyr（25.9%）、InP（11.4%）、CHR（5.1%）、Nap（3.2%）、BgP（2.9%）等。將PAHs視為環(huán)境因子，土壤細(xì)菌群落視為預(yù)測因子，通過蒙特卡洛排列檢驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05，圖6）可知，DBA與擬桿菌門之間、Phe與芽單胞菌門之間、Pyr與變形菌門之間、BkF與厚壁菌門之間存在極顯著相關(guān)。

2.4.2 土壤PAHs與土壤古生茵群落的冗余分析

土壤PAHs與土壤古生菌之間存在顯著相關(guān)性，其貢獻(xiàn)率如圖7所示。各成分貢獻(xiàn)率由高到低排序?yàn)镈BA（35. 8%）、Ace（33.0%）、Pyr（20.0%）、Phe（4.4%）、Ant（4.7%）、Nap（0.7%）等。將PAHs視為環(huán)境因子，土壤古生菌群落視為預(yù)測因子，通過蒙特卡洛排列檢驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05，圖8）可知，InP與深古菌門之間，BbF、Acy與奇古菌門之間，DBA與廣古菌門之間存在極顯著相關(guān)，Phe、Pyr和Ace對(duì)古生菌影響較大。

3 討論與結(jié)論

Peralta研究發(fā)現(xiàn)，濕地的土壤狀況與硝化螺旋菌門群落的變化密切相關(guān)：Jackson等研究發(fā)現(xiàn)，咸水入侵和營養(yǎng)鹽富集對(duì)濕地微生物群落有影響，鹽分和氮、磷處理會(huì)對(duì)微生物多樣性和不同微生物的活性產(chǎn)生不同的作用。目前，已知篩選出至少有40多個(gè)種屬的微生物具有PAHs降解能力，它們大部分是從PAHs污染的土壤或底泥中分離出來的。比較常見的細(xì)菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、分枝桿菌屬（Mycobacte-rium）以及鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等，這些細(xì)菌均能夠降解低分子量和高分子量的PAHs。

張晶等研究表明，PAHs污染會(huì)造成土壤細(xì)菌群落多樣性的改變。一些與PAHs降解相關(guān)的微生物逐漸得到富集，而一些對(duì)PAHs敏感的微生物種群數(shù)量逐漸減少，失去優(yōu)勢(shì)。PAHs的降解與細(xì)菌種群的豐度和多樣性呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，不同處理方式對(duì)種群結(jié)構(gòu)的影響差異較大。這說明PAHs降解菌具有一定特異性，主要表現(xiàn)為對(duì)PAHs毒性的耐性及以PAHs作為碳源的適應(yīng)性。韓文輝等研究發(fā)現(xiàn)，放線菌經(jīng)過一段時(shí)間的PAHs脅迫后，對(duì)污染物的降解能力有所提高，PAHs降解后的小分子物質(zhì)為放線菌的生長提供了營養(yǎng)和能量來源，從而促進(jìn)其繁殖和增長。本研究中，相關(guān)性分析與冗余分析均顯示，土壤PAHs對(duì)土壤微生物群落影響較大，且與多數(shù)細(xì)菌和古生菌呈極顯著正相關(guān)，在不同程度上對(duì)微生物群落有著促進(jìn)作用，可能有助于微生物群落對(duì)土壤中PAHs的降解。但是由于本研究區(qū)域土壤PAHs污染水平較低，微生物自身對(duì)污染存在耐受性，無法更加準(zhǔn)確地判定微生物對(duì)PAHs的降解性，存在一定的局限，需要進(jìn)一步研究。

相關(guān)性分析可知，土壤PAHs引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)上的改變。冗余分析可知，土壤PAHs對(duì)土壤細(xì)菌和古生菌群落貢獻(xiàn)率不同，能夠體現(xiàn)出樣本的變異水平，經(jīng)過蒙特卡洛檢驗(yàn)后，篩選出DBA、Pyr和Phe主要影響細(xì)菌群落，Phe、Pyr和Ace主要影響古生菌群落。

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“環(huán)渤海鹽堿地耕地質(zhì)量與產(chǎn)能提升技術(shù)模式及應(yīng)用”子課題（2021YFD190090308）；山東省黃河三角洲國家自然保護(hù)區(qū)土壤定位研究項(xiàng)目（20163702011309）；黃三角國家農(nóng)高區(qū)科技專項(xiàng)（2022SZX33）