摘要：LEA蛋白是一類逆境脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白，為了解糜子PmLEA1基因在逆境中的作用，從河曲紅糜子中克隆出PmLEA1基因，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并分析PmLEA1蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，糜子PmLEA1基因全長549bp，編碼蛋白的分子量為17863.57Da，氨基酸數(shù)目為182個，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，屬親水性蛋白，其蛋白序列與柳枝稷LEA蛋白序列的同源性最高，無跨膜轉(zhuǎn)運信號，不是膜上受體。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，PEG-6000、NaCl、甘露醇、ABA、GA、H2O2、IAA、MeJa、SA脅迫下的PmLEA1基因相對表達(dá)量均發(fā)生不同程度的變化；各脅迫下PmLEA1基因的相對表達(dá)量變化在根中最大，葉片次之，莖中相對變化最小，且表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；PEG-6000脅迫下PmLEA1基因的相對表達(dá)量變化量大。上述結(jié)果說明，糜子PmLEA1基因參與了抗旱調(diào)控和不同激素信號傳導(dǎo)過程。研究結(jié)果為糜子的遺傳改良提供了優(yōu)良的抗旱基因，并為其他禾本科作物L(fēng)EA基因的挖掘提供了研究思路。

關(guān)鍵詞：糜子；PmLEA1；基因克?。槐磉_(dá)模式；蛋白性質(zhì)；結(jié)構(gòu)特征

Cloning and Expression Pattern Analysis of PmLEA1 Gene in Broomcorn Millet（Panicum miliaceum L.）under Abiotic Stress

REN Jiangling1，2，3，SHEN Lihong1，3，LIU Yuhan1，2，3，SONG Jian3，4，

LIU Sichen1，2，3，QIAO Zhijun1，2，3，CAO Xiaoning1，2，3

（1Center for Agricultural Genetic Resources Research，Shanxi Agricultural University，Taiyuan 030031；2College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，Shanxi；3Key Laboratory of Crop Gene Resources and Genetic Improvement of Germplasm Enhancement on Leoss Plateau，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Taiyuan 030031；

4Institute of Industrial Crop，Shanxi Agricultural University，F(xiàn)enyang 032200，Shanxi）

自20世紀(jì)末以來，全球氣候變暖且逐漸惡劣的發(fā)展趨勢導(dǎo)致了我國耕地中干旱面積的比例越來越大、干旱程度日漸加深，對生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重威脅。干旱不僅影響植物的代謝機制和生長發(fā)育，還影響著生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，是限制全球農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]，嚴(yán)重制約著作物增產(chǎn)和農(nóng)民增收[2]。糜子（Panicum miliaceum L.）也稱作黍稷，是起源于中國的一種古老作物[3]。糜子營養(yǎng)豐富，廣泛分布于北方干旱、半干旱地區(qū)。糜子因其抗旱性強、生育時期短、耐瘠薄、復(fù)水能力強等特點，成為研究作物耐旱性的理想載體[4-5]。目前已有關(guān)于玉米[6-7]、大豆[8]、甘薯[9]、小麥[10]等作物耐旱基因的研究，雖然在糜子中也有相關(guān)耐旱基因的研究，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子[11]、bZIP基因[12]、NAC基因家族[13]、TCP基因[14]等，但到目前為止，對糜子LEA基因的耐旱研究還未見報道。

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白，Late embryogenesis abundant proteins）最早發(fā)現(xiàn)于木棉花中[15]，在種子發(fā)育后期形成，其累積與細(xì)胞對脫水的耐受性有關(guān)，與植物抗逆反應(yīng)密切相關(guān)。干旱、低溫及鹽脅迫均能以不同的途徑誘導(dǎo)其在營養(yǎng)組織中表達(dá)[16]。LEA蛋白是植物逆境脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生的，是一類大的家族基因，對其劃分并沒有一個統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。LEA蛋白分子量大約在10～30kDa之間[17]，其組成中含有大量氨基酸，導(dǎo)致其具有較高的親水性和熱穩(wěn)定性。在植物的抗旱過程中，LEA蛋白在維持植物基本代謝活動、保護(hù)細(xì)胞免受傷害等方面發(fā)揮了重要作用。LEA蛋白表達(dá)含量沒有組織特異性。王蓮哲等[18]研究表明，LEA蛋白在小麥（Triticum aestivum）中有抵御滲透脅迫的功能，在PEG-6000、NaCl、低溫和脫落酸（ABA）處理下，表達(dá)量顯著上調(diào)；何道一等[15]研究表明，大豆（Glycine max）LEA基因在胚發(fā)育過程中穩(wěn)定表達(dá)；杜永婷等[17]研究表明，白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）8個LEA基因中，僅有LEA5在干旱脅迫下呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)，說明LEA5基因參與了抗旱的調(diào)控。由此可見，許多植物中已有LEA基因相關(guān)功能的研究，但在糜子中還未見報道。糜子是耐旱作物，對糜子在干旱脅迫下LEA蛋白是否參與調(diào)控，以及對該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析在提高糜子抗旱性及抗旱品種的培育中具有重要科學(xué)價值。

本研究對糜子PmLEA1基因進(jìn)行克隆，并對PmLEA1基因的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，從干旱、鹽、糖以及植物激素處理方面入手，分析在不同處理時期，PmLEA1基因在糜子幼苗中的表達(dá)水平和表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步探究糜子LEA基因的功能提供理論基礎(chǔ)，也為糜子功能基因的發(fā)掘、利用提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本研究以河曲紅黍子為試驗材料，所用克隆載體pGM-Simple-T Fast Vector、總RNA提取試劑盒、預(yù)混試劑、菌種DH5α以及高GC PCR擴增試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 幼苗干旱脅迫處理 采用Liu等[14]所描述的試驗方法并稍作修改。挑選出籽粒飽滿的種子，用75%的乙醇處理種子2min，無菌水反復(fù)沖洗5～6次，然后置于培養(yǎng)皿中。種子在暗培養(yǎng)條件下發(fā)芽后，選擇長勢優(yōu)良且均勻的幼苗移植至花盆中進(jìn)行土培，每天16h光照/8h黑暗，10d后開始進(jìn)行以下4種脅迫處理。

干旱脅迫處理 干旱脅迫選用PEG-6000溶液進(jìn)行模擬，將糜子幼苗放入10%的PEG-6000溶液（干旱脅迫）和純水溶液（對照）中處理，分別在脅迫處理后的0h（CK）、1h、3h、6h、9h、12h、24h剪取糜子幼苗的根、莖和葉，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。鹽脅迫處理 用NaCl溶液對糜子幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理（表1），純水溶液處理為對照，處理步驟同干旱脅迫。甘露醇糖處理 用甘露醇溶液對糜子幼苗進(jìn)行處理，設(shè)置純水溶液處理作為對照，處理步驟同干旱脅迫。激素處理 分別使用脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJa）、水楊酸（SA）、生長素（IAA）、過氧化氫（H2O2）、赤霉素（GA）對糜子幼苗進(jìn)行處理，純水溶液處理為對照，處理方式同干旱脅迫。

1.2.2 植物總RNA提取 糜子總RNA采用植物總RNA提取試劑盒（DP432）進(jìn)行提取。使用FastKing一步法除基因組cDNA，第一鏈合成預(yù)混試劑（KR118）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作參照說明書中步驟。

1.2.3 基因克隆 從NCBI中Blastn柳枝稷的LEA家族基因，以柳枝稷LEA基因EST序列為模板，引物利用NCBI中的Primer-blast進(jìn)行設(shè)計，隨后利用軟件Primer 5.0檢查該引物的特異性。本次基因克隆設(shè)計的正向引物序列（5’-3’）：ATGGCGCAGCCGCAGCCGAG，反向引物序列（5’-3’）：CGGCGGCGAGGGGCAACTGA。

取等量不同處理下各個時間段的糜子葉片cDNA混合樣作為模板進(jìn)行PCR擴增。擴增體系總體積為50μL，其中包括：25μL的2×GC-Rich PCR Master Mix（KT206）、4μL（10mmol/L）正向引物、4μL（10mmol/L）反向引物、5μL（100ng/μL）模板cDNA，剩余部分為ddH2O。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，34次循環(huán)；最后72℃徹底延伸10min。

擴增完成后產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收純化目的基因，將目的基因連接到克隆載體pGM-Simple-T Fast Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，使用藍(lán)白斑篩選法獲得重組質(zhì)粒。陽性克隆子經(jīng)菌液PCR檢測鑒定后送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)方法 運用SOPMA軟件分析糜子PmLEA1基因編碼的蛋白產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)；利用NetPhos軟件對PmLEA1蛋白的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測；利用Phytozome-blast獲得與糜子LEA氨基酸序列同源性較高的序列；跨膜結(jié)構(gòu)采用TMHMM Server v.2.0軟件進(jìn)行分析（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？DeepTMHMM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子PmLEA1基因的克隆 用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行回收純化，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，割膠回收后測序結(jié)果顯示得到的PmLEA1基因全長549bp，與預(yù)期結(jié)果相符，該基因序列為：ATGGCGCAGCCGCAGCCGAGAAGG

GAAGATCAGGAGCTGCGCCAGGCGCAGCAGG

GCAACATGGCCCCGGCAGCCGCCGCCCCGC

AGCAGGAGCCCATCAAGTACGGCGACGCCT

TCGCCGTGAAGGGCGAGCTGGCCGCGCAGCC

CATCGCGCCGCGCGACGCGGCGGCCATGCGC

TCCGCCGAGGACAGCGTGCCGGGCGTCCAGG

TCCCGCAGGAGAGCGGCGGCGGGTTCAGCGC

CGCGGCCTTCATGGAGTCCGCGGCCCAGTACA

ACGAGGCCGTCGGCGCCGTCCGGCCAGGCC

AGGCCAGCGACGCCGCCGCCAAGCACGGG

ATCAACGTCACCCAGGACGCCGTGCCCGGC

GGACGCATCGTCACCGAGTTCGTCGCAGGC

CAGGTGGTAGGGCAGTACGCCGTCGCCGAAG

CGGCGCCGGCGCAGCAGGACGCGGCGGGTG

CCAACAAGGCCGCCGTGGGCGGCGGTGGT

GCGGGCCACGGTGACGCAGGCGGAGCTCCCG

GAGCGCGCGGCGGGCCAGCGGCGGCGAGGG

GCAACTGA。

2.2 糜子PmLEA1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 糜子PmLEA1蛋白的氨基酸序列分析 NetPhos軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PmLEA1蛋白中能夠產(chǎn)生磷酸化的位點只有蘇氨酸（Threonine，2個）、絲氨酸（Serine，6個）以及酪氨酸（Tyrosine，3個）3種，說明該蛋白主要通過絲氨酸進(jìn)行磷酸化（圖1）。

2.2.2 糜子PmLEA1蛋白的同源性比較及進(jìn)化樹分析 使用Phytozome-blast與其他6種植物的LEA同源蛋白序列（柳枝稷Pahal.6G164500.1、青狗尾草Sevir.6G133200.1、谷子Seita.6G123500.1、水稻LOC_Os06g23350.1、玉米ZmPHJ40.01G036600.1、擬南芥AT3G22490.1）進(jìn)行多序列比對，同時利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，糜子PmLEA1蛋白序列與柳枝稷同源蛋白序列的相似度最高，親緣關(guān)系最近，同時還與青狗尾草和谷子的同源蛋白的親緣關(guān)系比較近，而與擬南芥和玉米LEA同源蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，水稻的LEA同源蛋白則單獨聚為一類。

2.2.3 糜子PmLEA1蛋白親水性和疏水性分析 PmLEA1蛋白質(zhì)的親水性與疏水性預(yù)測結(jié)果如圖3所示，PmLEA1蛋白第80位的丙氨酸疏水性最強，預(yù)測值為1.256；親水性最強的為第7位和第8位的精氨酸，其預(yù)測值為-3.300。PmLEA1蛋白平均親水系數(shù)為-0.348，屬于親水性蛋白，該蛋白的高度親水性是由于LEA蛋白的氨基酸序列中含有大量的帶電荷氨基酸殘基和其他小氨基酸，包括丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等。

2.2.4 糜子PmLEA1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PmLEA1基因所編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為182，分子式：C759H1200N240O253S4，分子量為17863.57Da，糜子PmLEA1

基因編碼的蛋白產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)如圖4所示。結(jié)果表明，PmLEA1蛋白二級結(jié)構(gòu)包含：β-轉(zhuǎn)角（8.24%）、延伸鏈（10.99%）、無規(guī)則卷曲（47.25%）和α-螺旋（33.52%），α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比較大，說明PmLEA1蛋白結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，無序性較強。

2.2.5 糜子PmLEA1蛋白信號肽預(yù)測 信號肽預(yù)測結(jié)果如圖5所示，PmLEA1基因編碼的蛋白無信號肽，表明PmLEA1蛋白屬于非分泌性蛋白。

2.2.6 糜子PmLEA1蛋白跨膜區(qū)分析 TMHMM Server v.2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，PmLEA1蛋白跨膜螺旋線數(shù)為0，PmLEA1蛋白的1～182位氨基酸都位于細(xì)胞膜表面，其預(yù)測結(jié)果如圖6所示，該結(jié)果說明，PmLEA1蛋白無跨膜轉(zhuǎn)運信號，不是膜上受體。

2.3 糜子PmLEA1基因的表達(dá)分析

2.3.1 不同脅迫處理下PmLEA1基因的表達(dá)模式 由圖7可知，逆境脅迫下PmLEA1基因在糜子幼苗的根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá)。PEG-6000處理糜子幼苗后，PmLEA1基因在葉片中表達(dá)量最大，根部次之，莖中變化量較小。葉片和根中表達(dá)量均在脅迫處理1h時達(dá)到最高，葉片中的表達(dá)量是對照組的近15倍。與0h相比，根中表達(dá)量在1h、3h、12h、24h時達(dá)到顯著水平，1h、24h為表達(dá)量的2個最高峰點；莖中表達(dá)量在6h時顯著下降，在12h時顯著上升，1h、12h為表達(dá)量的2個最高峰點；葉中表達(dá)量在1h、3h、9h達(dá)到顯著水平，1h、9h為2個表達(dá)量最高峰點。

NaCl脅迫下，PmLEA1基因的表達(dá)量在糜子幼苗的根中最高，葉片次之，莖中最低。與0h相比，根中的表達(dá)量在3h、6h、9h、12h時顯著上調(diào)，9h為表達(dá)量最高峰點；莖中的表達(dá)水平在所有處理時間段均無顯著變化；葉中表達(dá)量隨處理時間先增加后下降，但相較于0h均未達(dá)到顯著水平，3h為表達(dá)量最高峰點。

糜子幼苗在甘露醇處理后，不同組織中PmLEA1基因表達(dá)量變化主要集中在處理后3～12h，其變化趨勢為根＞莖＞葉。與0h相比，根中PmLEA1基因表達(dá)量在3h、9h、12h均顯著升高，3h、12h為表達(dá)量的2個最高峰點，3h相對表達(dá)量為0h表達(dá)量的8.8倍；莖中表達(dá)量在3h、9h、12h顯著上升，3h、9h 為表達(dá)量的2個最高峰點；葉中表達(dá)量在3h、9h顯著上升，是葉中表達(dá)量的2個最高峰點。

以上結(jié)果表明，PmLEA1基因具有響應(yīng)非生物脅迫（干旱、NaCl、甘露醇環(huán)境）的表達(dá)模式，在調(diào)控糜子響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

2.3.2 不同植物激素處理下PmLEA1基因的表達(dá)模式 由圖8可知，植物激素處理后PmLEA1基因在糜子幼苗的根、莖、葉中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。在外源激素ABA脅迫下，糜子PmLEA1基因的相對表達(dá)量變化為葉gt;根gt;莖。PmLEA1基因在根部和葉中的相對表達(dá)量整體上在0～3h隨時間變化逐漸增加，3～24h逐漸降低。與0h相比，根中表達(dá)量在3h、6h、9h顯著上升，其中3h為表達(dá)量最高峰點；莖中表達(dá)量在12h顯著上升，在1h、3h、6h、9h、24h顯著降低；葉中表達(dá)量在3～12h顯著增加，3h、12h為表達(dá)量的2個最高峰點。

在外源激素GA脅迫下，糜子幼苗中的PmLEA1基因相對表達(dá)量變化為根gt;葉gt;莖。PmLEA1基因在根中的相對表達(dá)量在0～6h逐漸增加，在6～24h逐漸降低。根、莖、葉的相對表達(dá)量均在6h達(dá)到最高值。與0h相比，根中表達(dá)量在3～12h顯著增加，莖中表達(dá)量在9～24h顯著降低，葉中表達(dá)量在3h、6h顯著增加。

經(jīng)外源激素H2O2處理后，PmLEA1基因在糜子幼苗中的相對表達(dá)量為根最高，莖次之，葉片中最少。與0h相比，根中表達(dá)量在3h顯著升高，且為表達(dá)量最高峰點；莖中表達(dá)量在1～6h顯著增加，在24h顯著降低，1h為表達(dá)量最高峰點；葉中表達(dá)量在9h、12h顯著升高，在1h顯著降低，9h為表達(dá)量最高峰點。

在外源激素IAA脅迫下，PmLEA1基因在糜子幼苗不同器官中的相對表達(dá)量變化趨勢為根gt;葉gt;莖。根中PmLEA1基因的表達(dá)量在0～6h隨著時間的推移逐漸上升，在6～24h逐漸下降，在6h上調(diào)至最大值，為0h的7倍左右。與0h相比，PmLEA1基因在根中表達(dá)量于1～12h均顯著增加；莖中的表達(dá)量在所有時段均顯著降低；葉中的相對表達(dá)量在1～6h均顯著上升，并在3h上升至最高值，約為0h的5倍。

糜子幼苗在外源激素MeJa脅迫下，不同器官中PmLEA1基因相對表達(dá)量變化狀況為葉最高，根次之，莖最少。根中表達(dá)量在0～6h隨著時間的推移逐漸上升，在6～24h逐漸降低。與0h相比，根中相對表達(dá)量在6h顯著上升，在24h顯著降低，6h為表達(dá)量最高峰點；莖中表達(dá)量在1h、6h顯著升高，且為表達(dá)量的2個最高峰點；葉中表達(dá)量在3～9h顯著升高，在9h達(dá)到最大值，為對照組的6倍左右，3h、9h為表達(dá)量的2個最高峰點。

糜子幼苗在外源激素SA脅迫下，不同器官中PmLEA1基因相對表達(dá)水平變化趨勢為根＞葉＞莖。與0h相比，根中PmLEA1基因表達(dá)量在1h、3h顯著上升，在3h達(dá)到峰值，為0h的4.3倍；莖中表達(dá)量均無顯著變化；葉中表達(dá)量在所有處理時間點均顯著上升，其中3h為表達(dá)量最高峰點。

3 討論

植物L(fēng)EA蛋白作為逆境表達(dá)蛋白，已在許多植物中對其功能有了廣泛研究，小麥[19]、番茄[20]、煙草[21]、大豆[17，22]、水稻[23]、花生[24]、月季[25]等均有相關(guān)報道。LEA蛋白大量富集于種子胚胎發(fā)育后期，在植物中廣泛存在，參與植物非生物脅迫調(diào)控，在植株受到低溫、干旱等非生物脅迫時，表達(dá)水平顯著上調(diào)，其異源表達(dá)可以提升受體植株對外界脅迫的抗性[26]，因此，該蛋白在植物抵御非生物脅迫中有著極其重要的作用，可以提高植物在不利環(huán)境中的存活率。

當(dāng)植物處于逆境時，會自發(fā)地感知周圍環(huán)境的變化，并在生理生化多個方面對逆境形成適應(yīng)機制來減輕損害[16，27-28]。糜子的非生物脅迫響應(yīng)涉及多個基因，但目前僅有少數(shù)基因被克隆和分析。研究發(fā)現(xiàn)，枳（Poncirus trifoliata）LEA蛋白對冷、脫水和ABA脅迫非常敏感，受鹽脅迫輕微誘導(dǎo)后，過表達(dá)株系與野生型植株相比，具有強脫水性和耐旱性，因此可以通過增強抗氧化能力來提高干旱耐受

性[29]。這與本研究中PmLEA1蛋白受干旱脅迫強烈誘導(dǎo)的結(jié)論一致，但與受ABA處理輕微誘導(dǎo)的結(jié)論不一致，可能是物種間差異導(dǎo)致，例如大多數(shù)油菜花LEA蛋白在葉片和后期種子中的表達(dá)量會增加[30]。陸地棉的LEA3基因在干旱和鹽脅迫下表達(dá)量更高，特別是在葉和根中對干旱和鹽分脅迫表現(xiàn)出更明顯的應(yīng)答反應(yīng)[31]，這與本研究結(jié)果基本一致，說明糜子在受到干旱脅迫時能促進(jìn)LEA蛋白的合成，從而降低干旱對植株的損害。王國瑞等[32]研究表明，玉米LEA-2家族中的ZmLEA7、ZmLEA53等基因在干旱脅迫下表達(dá)量升高，且在復(fù)水后這些基因表達(dá)量又降低，因此推測玉米的抗旱能力受這些基因調(diào)控，這表明LEA蛋白在不同植物中逆境下的表達(dá)模式有一定共性。

高度親水性和結(jié)構(gòu)無序性是LEA蛋白最顯著的2個特征[33]，本研究中的糜子PmLEA1蛋白符合這2個重要特性。高親水性使LEA蛋白吸收更多的水分到細(xì)胞內(nèi)，增強了其保水能力[34]，進(jìn)而提高植物應(yīng)對干旱的耐受力。本研究通過對糜子幼苗設(shè)置PEG-6000、NaCl和甘露醇脅迫處理，分析了PmLEA1基因在糜子幼苗中的轉(zhuǎn)錄水平，實時熒光定量發(fā)現(xiàn)，PmLEA1基因通常在莖中表達(dá)較低，在根、葉中表達(dá)量較高。當(dāng)糜子幼苗受PEG-6000脅迫后，脅迫處理1h時葉片中表達(dá)量最高，這表明在干旱脅迫條件下PmLEA1基因被誘導(dǎo)表達(dá)，干旱脅迫顯著上調(diào)葉中PmLEA1基因的表達(dá)量。當(dāng)受甘露醇和NaCl脅迫時，PmLEA1基因在根中的表達(dá)量大于葉片和莖中的表達(dá)量，說明該基因在感受到這2種脅迫時優(yōu)先在根中表達(dá)。6種植物激素處理糜子幼苗時，PmLEA1基因在根和葉中的表達(dá)量整體上隨處理時間的推移先增加后減少，ABA和MeJa處理時葉片的相對表達(dá)量最高。在GA、H2O2、SA、IAA處理時，糜子PmLEA1基因的表達(dá)水平在根中變化最大，GA和IAA處理在6h時達(dá)到峰值，H2O2和SA處理在3h時達(dá)到峰值，且該基因相對表達(dá)量變化在GA和IAA處理中較大。

4 結(jié)論

本研究從糜子中克隆到抗旱相關(guān)基因PmLEA1，結(jié)果表明該基因所編碼的蛋白有182個氨基酸，分子式：C759H1200N240O253S4，分子量為17863.57Da；PmLEA1蛋白屬親水性蛋白，無跨膜轉(zhuǎn)運信號，不是膜上受體，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主；在柳枝稷、青狗尾草、谷子、水稻、玉米和擬南芥這6種植物中，與PmLEA1蛋白同源蛋白序列相似度最高的是柳枝稷。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，PmLEA1基因表達(dá)量變化在受H2O2脅迫處理后最小，在PEG-6000脅迫處理后變化最大，說明該蛋白對H2O2脅迫不敏感，受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在糜子響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮作用，參與抗旱調(diào)控。大部分處理組根與葉片PmLEA1蛋白的表達(dá)量高于對照組，說明糜子在受到環(huán)境脅迫時該蛋白在根與葉片中響應(yīng)迅速，尤其是在PEG-6000脅迫處理1h后的葉片中。PmLEA1蛋白在受逆境脅迫和激素脅迫處理時，根和葉中的表達(dá)量變化趨勢基本都為先增加后減少，說明該蛋白在感受到脅迫時迅速在葉和根中表達(dá)，隨著脅迫的持續(xù)，糜子通過消耗該蛋白來抵御脅迫。本研究進(jìn)一步明晰了LEA基因在糜子抗逆響應(yīng)中的機制，為進(jìn)一步明確糜子耐旱分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2024-06-05）