摘要" 以斑馬魚的氨基酸檢測為例，深入探討了其樣品前處理流程、進(jìn)樣濃度確定和程序操作規(guī)范，并列舉了操作過程中可能出現(xiàn)的常見問題及解決方案，為斑馬魚及類似樣品的前處理以及氨基酸檢測提供參考。斑馬魚因其體積小、含水量大的特性，在樣品稱重、粉碎和水解環(huán)節(jié)均需進(jìn)一步優(yōu)化；通過梯度合理設(shè)置稀釋濃度，可以確定最適進(jìn)樣濃度；嚴(yán)格規(guī)范操作程序有助于數(shù)據(jù)高效采集和處理，從而形成高質(zhì)量檢測報(bào)告；同時(shí)有效應(yīng)對試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的儀器操作不當(dāng)、程序設(shè)置錯(cuò)誤和數(shù)據(jù)處理偏差等方面的問題，能夠顯著提升檢測效率和結(jié)果的精準(zhǔn)度。

關(guān)鍵詞" 斑馬魚；氨基酸；樣品前處理；進(jìn)樣濃度；程序設(shè)置

中圖分類號(hào)" S-3；R446.1"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2024）22-0050-05

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.22.011

基金項(xiàng)目 安徽省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略與軟課題研究“依托羚羊工業(yè)互聯(lián)網(wǎng)建設(shè)虛擬研發(fā)機(jī)構(gòu)路徑研究”（202306f01050012）。

作者簡介 陳瑞瑞（1987—），女，安徽蚌埠人，碩士，助理研究員，從事中草藥和食品檢驗(yàn)檢測工作。

通信作者 梁偉（1986—），男，安徽合肥人，助理研究員，從事農(nóng)業(yè)科技咨詢與管理工作。

收稿日期 2024-08-27

Optimization of sample preprocessing and detection analysis process amino acid detection of zebrafish

CHEN Ruirui""" ZHANG Ying""" WANG Chenchen""" LIANG Wei

（Anhui Promotion Center for Technology Achievements Transfer， Anhui Academy of Science and Technology， Hefei 230031， China）

Abstract" Taking the amino acid detection in zebrafish as an example， this investigation delves into its sample pretreatment process， determination of injection concentration， and procedural operations standards. The common issues that may arise during the process were listed， to provide a reference for the pretreatment and amino acid detection of zebrafish and similar samples. Due to its small size and high water content， optimizations were required for the weighing， crushing， and hydrolysis stages of zebrafish samples. Setting up gradient dilution concentrations could determine the optimal injection concentration. Standardizing the operational procedures was beneficial for the efficient collection and processing of data， and form high-quality detection reports. Additionally， properly addressing issues related to instrument operation， procedure setup， and data processing during the test， which helps to make the testing process， more efficient and the results more accurate.

Keywords" zebrafish; amino acids; pre processing; injection concentration; program setting

氨基酸檢測是動(dòng)植物食品營養(yǎng)[1-3]、臨床醫(yī)學(xué)[4-5]、細(xì)胞代謝[6-7]以及基因編輯等領(lǐng)域[8-9]常用的一種掌握生物信息的手段。其檢測過程可分為樣品前處理、儀器進(jìn)樣、在線數(shù)據(jù)采集和線下數(shù)據(jù)處理4個(gè)部分。不同樣品類型和不同儀器的前處理方法和程序操作也不盡相同。斑馬魚因代謝較快在臨床醫(yī)學(xué)上常被作為用藥載體檢測氨基酸代謝[10-11]。該物種因其個(gè)體含水量較高且密度有差異，與其他干性固體、血液和植物葉片等樣品的前處理不同。樣品前處理是檢測分析試驗(yàn)中影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一[12]；動(dòng)物源性食品具有復(fù)雜的基質(zhì)，前處理方法會(huì)影響分析技術(shù)的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度和整體性能[13-14]。儀器使用、程序設(shè)置與數(shù)據(jù)處理等環(huán)節(jié)是氨基酸檢測的難點(diǎn)，陳金珍[15]和陳蕊君等[16]總結(jié)了氨基酸檢測過程中不同型號(hào)氨基酸分析儀的常見故障問題，并提出了相應(yīng)的解決辦法；姜濤等[17] 和王華等[18]優(yōu)化了氨基酸檢測程序，實(shí)現(xiàn)氨基酸檢測定量化。目前，氨基酸檢測程序設(shè)置、數(shù)據(jù)采集和處理鮮有詳盡的相關(guān)指導(dǎo)。為此，本研究針對氨基酸檢測中特殊樣品前處理優(yōu)化、數(shù)據(jù)采集和處理方法以及儀器使用過程中可能出現(xiàn)的問題及解決辦法進(jìn)行梳理，為一線檢測人員提供參考。

1 斑馬魚氨基酸樣品材料前處理

1.1 樣品稱重

陳琛等[12]在檢測雞的胸肌、腿肌、肝臟和腸道組織中的游離氨基酸時(shí)，選擇將屠宰場凍存的樣品取出解凍后稱取組織或食糜重量作為最終計(jì)算氨基酸含量的參數(shù)；修磊等[19]檢測水產(chǎn)品中喹乙醇類藥物殘留時(shí)將魚、蝦等肌肉部分取出，除凈脂肪和結(jié)締組織，經(jīng)過簡單處理后，勻制成肉糜狀后稱重。新鮮斑馬魚的含水量在70%以上，新鮮魚樣在運(yùn)輸、勻漿等過程中含水量會(huì)發(fā)生變化，同一批斑馬魚樣品，含水量在72%～76%，此差異可造成氨基酸檢測含量存在較大誤差。因此，在本試驗(yàn)中先對新鮮樣品進(jìn)行稱重（稱重之前用吸水紙吸干表面水分），然后在60"℃下烘干處理4"h以上，保證烘干樣品達(dá)到恒重，再次稱重，最后求得鮮重和干重的氨基酸含量，供計(jì)算參考。

1.2 樣品粉碎

陳琛等[12]在處理雞各部分組織時(shí)，比較了超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)和高速勻漿機(jī)兩種設(shè)備，發(fā)現(xiàn)前者處理樣品的峰值和響應(yīng)值更高。斑馬魚個(gè)體非常小，合適的勻漿機(jī)較少，常見勻漿機(jī)普遍較大，無法將新鮮斑馬魚樣品徹底打碎或可能造成噴濺等。因此，在本研究中將樣品烘干后采用一次性研磨棒和圓底離心EP管研磨，利用小型振蕩器振蕩管底或利用離心機(jī)將管壁和管蓋上殘留魚粉離心至管底；此外，可以向離心管中傾倒液氮或冷凍離心管等方式輔助研磨，使樣品研磨更加徹底。手動(dòng)研磨耗時(shí)耗力，且力度和頻率均有所欠缺，可添加海砂（SiO2含量≥99.0%）輔助研磨，檢測結(jié)果無差異。

1.3 樣品水解

1.3.1 水解方式 酸水解是較常用的水解方法，包括鹽酸水解、硫酸水解法等[14]。本試驗(yàn)對照國標(biāo)[20]及其改進(jìn)方法[21]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況對水解方法進(jìn)行優(yōu)化：水解管中加入6"mol/L鹽酸10～15"mL，抽真空后充氮?dú)?，重?fù)3次，在充氮?dú)獾臓顟B(tài)下封口，110"℃水解22"h，然后用去離子水沖洗定容至50"mL容量瓶中，取1"mL定容溶液于40～50"℃條件下真空干燥，取1～2"mL水溶解后蒸干，對應(yīng)取1～2 mL pH 2.2的緩沖液溶解過濾，供儀器測定。

1.3.2 水解管選擇與趕氧 氨基酸檢測水解管一般選擇安瓿管、耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)玻璃管等[22]。李梅等[14]在樣品前處理中比較了3種水解管搭配不同密封墊的使用體驗(yàn)和效果，結(jié)果顯示，螺旋口帶蓋試管搭配PP材質(zhì)的密封墊或氟硅橡膠墊的水解效果較好。本研究介紹了2種水解管（圖1），左側(cè)是螺旋口帶蓋試管，右側(cè)是帶側(cè)支水解管（兩種型號(hào)）。研磨樣品用6"mol/L鹽酸沖洗至水解管中，加入10～15"mL水解液；如選擇螺旋口帶蓋試管，則無需進(jìn)行抽真空操作，與氮吹儀配合使用，將氮吹儀與氮?dú)馄窟B接，調(diào)整適當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉伲瑢⑺夤苤糜诘滇樝?，使針接近液面，以能明顯看到液面出現(xiàn)凹坑為宜（圖2），持續(xù)30"s左右，然后在氮吹環(huán)境下擰緊蓋子；如選擇帶側(cè)支水解管，從主蓋處加入消解液后擰緊蓋子，側(cè)支接至真空泵，再連接至氮?dú)馄?，?dǎo)入氮?dú)?，持續(xù)30"s左右，擰緊側(cè)支，關(guān)閉氮?dú)馄俊Ｔ囼?yàn)證明，兩種水解管及其趕氧方式的結(jié)果無明顯差異，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇。

1.3.3 水解和緩沖液 嚴(yán)俊等[23]在檢測保健食品中?；撬岷繒r(shí)選擇用分析純鹽酸配制水解液；姜濤等[17]檢測飼料中賴氨酸含量時(shí)指出所用試劑級(jí)別須為分析純或優(yōu)級(jí)純。本試驗(yàn)選用優(yōu)級(jí)純和分析純鹽酸配制6"mol/L鹽酸水解液，兩者水解結(jié)果無差別，但分析純試劑性價(jià)比更高且易獲得。進(jìn)樣時(shí)如選用鹽酸代替檸檬酸鈉配制緩沖液，則建議使用優(yōu)純級(jí)試劑。

2 進(jìn)樣濃度優(yōu)化

2.1 檢測原理

與多糖、重金屬等的檢測不同，氨基酸分析無需做標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用單標(biāo)法，具體方法：取2.5"mmol/L氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品0.2"mL，用pH 2.2的優(yōu)純級(jí)鹽酸定容到5"mL容量瓶中，過濾后儀器默認(rèn)為2"nmol/20 L標(biāo)樣[23-24]；樣品濃度要求控制在0.4～10"nmol/20 L，且與標(biāo)樣濃度接近，如進(jìn)樣濃度太低則結(jié)果不準(zhǔn)，過高則會(huì)堵塞管路。

2.2 進(jìn)樣濃度

探索樣品進(jìn)樣濃度時(shí)，純蛋白樣品可直接估算，當(dāng)樣品濃度未知時(shí)，李梅等[14]研究提出，可采用試驗(yàn)估算法：取2個(gè)試管分別加入0.1"mL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入1"mL茚三酮試劑，在100"℃下加熱3"min，于波長570 nm處測定溶液吸光度值，進(jìn)行比較得出樣品稀釋或濃縮倍數(shù)。趙陽美瑾等[25]研究認(rèn)為，水產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中易發(fā)生蛋白質(zhì)和脂類氧化，造成其品質(zhì)下降；李銀等[26]研究發(fā)現(xiàn)，牛肉在解凍過程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致其品質(zhì)下降。因此，本研究基于已有相關(guān)研究并結(jié)合魚類蛋白質(zhì)含量和斑馬魚體型較小、均勻性較差等因素，以新鮮的斑馬魚為樣品，水解定容至50"mL，取1"mL定容樣品蒸干，設(shè)置pH 2.2的鹽酸10、5和2倍水解液，即第1次用鹽酸稀釋10倍，儀器自動(dòng)清洗運(yùn)行完畢后，觀察數(shù)值和峰值再?zèng)Q定是否進(jìn)行第2次稀釋，系統(tǒng)默認(rèn)標(biāo)樣濃度2"nmol/20 L給出響應(yīng)值或質(zhì)量，以此為參照確定檢測樣品的氨基酸含量。檢測后若氨基酸含量均在0.4～10.0"nmol/L即暫停（或根據(jù)已出數(shù)據(jù)計(jì)算適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)）。試驗(yàn)結(jié)果表明，2倍水解液20 L進(jìn)樣量時(shí)斑馬魚各氨基酸的含量在0.4～10.0"nmol/L，半胱氨酸（Cys）含量最低，為0.488"nmol/L，甘氨酸（Gly）含量最高，為9.591"nmol/L。

3 儀器運(yùn)行與程序設(shè)置

3.1 儀器運(yùn)行

嚴(yán)俊等[23]、葛凱靖等[24]總結(jié)了L-8900氨基酸檢測儀的運(yùn)行條件，包括離子交換柱和反應(yīng)柱規(guī)格、柱溫、緩沖液、茚三酮流速、檢測波長、循環(huán)數(shù)和反應(yīng)時(shí)間等，并與其他氨基酸檢測分析儀進(jìn)行了比較。本試驗(yàn)中，L-8900氨基酸檢測儀運(yùn)行之前先打開儀器和聯(lián)機(jī)電腦，調(diào)用在線和離線程序。連接成功以后首先打開在線程序，選擇“單次運(yùn)行”作為開機(jī)預(yù)熱穩(wěn)定程序，調(diào)用方法默認(rèn)pH 4.6×60-2622（Stand-by）.met，其間2個(gè)柱溫箱（分離柱和反應(yīng)柱）均達(dá)到指定溫度，2個(gè)泵均達(dá)到指定流速，Stand-by作為單次運(yùn)行程序。管路B1-4：PH1-4為檸檬酸鈉緩沖液，B5為蒸餾水或純水，B6為PH-RG，以上管路均經(jīng)過泵1；R1、R2分別為茚三酮溶液和Buffer緩沖液，R3為5%的色譜級(jí)乙醇溶液，以上管路均經(jīng)過泵2。

3.2 檢測和數(shù)據(jù)處理

3.2.1 創(chuàng)建序列 姜濤等[17]和王華等[18]通過更換緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及設(shè)置分離程序等手段確定了檢測氨基酸的出峰時(shí)間和位置，實(shí)現(xiàn)氨基酸的快速分離和準(zhǔn)確定量。本試驗(yàn)中，進(jìn)樣前在離線程序中創(chuàng)建待測序列，創(chuàng)建方法：點(diǎn)擊“創(chuàng)建序列”“采集”，“樣品ID”和“日期”跳過，“未知數(shù)目”為所測樣品數(shù)量+2。第一行將樣品名和文件名均命名為RG，調(diào)用方法pH 4.6×60-2622（RG）.met，第一行不進(jìn)樣，體積為0，樣品瓶號(hào)隨意指定；第二行樣品名和文件名分別命名為STD和空白，樣品瓶號(hào)按實(shí)際放置順序填寫，調(diào)用方法pH 4.6×60-2622.met（一般默認(rèn)，可修改）。創(chuàng)建完成后將該序列保存為下拉列表中的“序列”類型，序列可命名為“待運(yùn)行序列”并保存在當(dāng)天日期文件夾中。

3.2.2 運(yùn)行序列 將標(biāo)樣和樣品按照創(chuàng)建序列時(shí)填寫的瓶號(hào)依次放進(jìn)樣品盤中，打開在線程序，序列名稱為待運(yùn)行序列，結(jié)果路徑可選擇與“待運(yùn)行序列”在同一日期文件夾中，結(jié)果名稱為運(yùn)行后未處理序列，另存為方法和PDF文件，提交。

3.2.3 矯正序列 運(yùn)行結(jié)束后，打開脫機(jī)程序，點(diǎn)擊創(chuàng)建序列，調(diào)用運(yùn)行序列方法pH 4.6×60-2622.met，從現(xiàn)有數(shù)據(jù)文件中選擇“未處理序列”，運(yùn)行后的序列列表選擇除RG外需要分析的其他序列，STD一行的處理類型選擇清除所有矯正，級(jí)別選1。以定容溶液50"mL，取1"mL蒸干，5"mL稀釋為例，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）＝，式中為報(bào)告中顯示每20 L樣品中氨基酸的質(zhì)量（ng），乘積因子為25，稀釋因子為20，對處理后序列做出以上選擇后，可另存在同一日期文件夾中，序列名稱為“矯正序列”。

3.2.4 處理序列 序列矯正后，選中菜單欄中“處理”，彈出對話框確認(rèn)并選擇，序列名稱如E/同一日期文件/矯正處理，結(jié)果路徑為E/同一日期文件，結(jié)果名稱為處理后序列。點(diǎn)擊“開始”，儀器將自動(dòng)處理數(shù)據(jù)。實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，需重復(fù)此操作一次，不必重新命名，處理后的序列雙擊，可查看檢測結(jié)果報(bào)告。

3.3 常見問題

3.3.1 儀器操作方面 陳金珍[15]列舉了S-433D型氨基酸分析儀溫控系統(tǒng)、壓力系統(tǒng)等方面出現(xiàn)的故障以及解決辦法；胡亮等[27]分析了L-8800氨基酸分析儀的泵壓異常和基線不穩(wěn)等故障，并提出了相應(yīng)的解決辦法；陳蕊君等[16]為L-8900氨基酸分析儀分析柱的重新填充提供了方法。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L-8900氨基酸分析儀如果長時(shí)間未使用或更換茚三酮溶液后，需對儀器進(jìn)行鼓泡（purge）30"min，排出管內(nèi)氣體，鼓泡之前先后打開泵1和泵2閥門，鼓泡結(jié)束后閥門關(guān)閉順序與打開時(shí)相反；自動(dòng)進(jìn)樣針也可能會(huì)出現(xiàn)堵塞，一般火燒進(jìn)樣針即可通暢；更換溶液之前打開N2閥門，為管路降壓。

3.3.2 程序設(shè)置錯(cuò)誤 程序使用按順序?yàn)閯?chuàng)建序列并命名為“未運(yùn)行序列”，調(diào)用序列后命名為“未處理序列”，對未處理序列進(jìn)行矯正，命名為“矯正序列”，處理序列后命名為“處理序列”，以上操作中，一是要清楚每一步的處理節(jié)點(diǎn)，二是序列的保存方式和途徑不能出錯(cuò)。

3.3.3 數(shù)據(jù)處理偏差 姜濤等[17]和王華等[18]對氨基酸出峰問題進(jìn)行了探索，不同儀器各種氨基酸的出峰設(shè)置存在差異。本試驗(yàn)按照系統(tǒng)默認(rèn)的各氨基酸出峰時(shí)間，直接處理后發(fā)現(xiàn)，個(gè)別氨基酸出峰偏離，導(dǎo)致檢測數(shù)據(jù)為0。其原因可能是氨基酸標(biāo)樣放置時(shí)間過長。針對這一結(jié)果，可以根據(jù)實(shí)際出峰時(shí)間進(jìn)行修正，具體辦法是打開“結(jié)果集”，找到“未處理序列”，點(diǎn)擊序列出現(xiàn)峰圖，根據(jù)實(shí)際出峰時(shí)間，選擇“方法”中“峰/組”更改氨基酸出峰時(shí)間，點(diǎn)擊“分析”確認(rèn)每種氨基酸均能被準(zhǔn)確讀出。調(diào)整出峰時(shí)間后系統(tǒng)自動(dòng)以更新的設(shè)置時(shí)間為準(zhǔn)，無需保存。在此基礎(chǔ)上，可通過兩種方法得到準(zhǔn)確的氨基酸含量：一是調(diào)出“未處理序列”重新處理，二是選中“處理后序列”重新處理，即可按照新的出峰時(shí)間更改并覆蓋原結(jié)果。

綜上，樣品前處理是氨基酸檢測中試驗(yàn)誤差的主要來源，控制人為誤差，實(shí)現(xiàn)樣品處理的一致性，是獲得客觀數(shù)據(jù)的保障。本研究對斑馬魚氨基酸檢測樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，以L-8900為氨基酸檢測儀器，為保證氨基酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在樣品前處理的稱重、粉碎和消解環(huán)節(jié)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件提出優(yōu)化操作方法以及進(jìn)樣濃度的控制辦法；系統(tǒng)梳理總結(jié)了檢測程序設(shè)置和數(shù)據(jù)處理方法，以及儀器運(yùn)作和程序分析中常出現(xiàn)的問題，提升其檢測效率和結(jié)果的精準(zhǔn)度。

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（責(zé)任編輯：何" 艷）