摘要：發(fā)酵牦牛肉是我國西藏地區(qū)的特色食品，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有獨特風味，深受消費者喜愛。然而，發(fā)酵牦牛肉目前的加工工藝較落后，大多仍然采用普通晾曬方式進行加工，生產(chǎn)周期長、效率低，且發(fā)酵牦牛肉的食品安全也得不到保障。該研究基于此，對發(fā)酵牦牛肉中的乳酸菌進行分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)適用于發(fā)酵牦牛肉的乳酸菌菌株有4株，菌株7和菌株8為乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12為清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）。將乳酸菌菌株與從北京微生物研究所種質(zhì)資源庫購買的低溫酵母菌德巴利氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）進行混合發(fā)酵牦牛肉，采用單因素試驗和正交試驗對發(fā)酵牦牛肉加工工藝進行研究和優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵牦牛肉的最佳加工工藝為接種量1.5%、清酒乳桿菌與德巴利氏酵母菌比例1∶3、發(fā)酵溫度33 ℃和發(fā)酵時間24 h。

關(guān)鍵詞：牦牛肉；發(fā)酵；分子生物學；乳酸菌

中圖分類號：TS201.3""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0079-05

Study on Isolation， Identification and Application of Strains in

Fermented Yak Meat

WANG Fu-qing， ZHANG Chun-ying， YAO Xue-qing， XU Li-xin

（National and Local Joint Engineering Research Center for Deep Processing of Special Agricultural

and Animal Husbandry Products in Tibetan Plateau， Lhasa 850600， China）

Abstract： Fermented yak meat is a special food in Tibet， China. It is rich in a variety of nutrients and has a unique flavor， so it is deeply loved by consumers. However， the current processing technology of fermented yak meat is relatively backward， most of it is still processed using ordinary air drying methods. The production period is long， the efficiency is low， and the food safety of fermented yak meat can't be guaranteed. Based on this， in this study， lactic acid bacteria in fermented yak meat are isolated and identified. It is found that there are four strains of lactic acid bacteria suitable for fermenting yak meat. Strains 7 and 8 are Lactococcus garvieae， and strains 10 and 12 are Lactobacillus sakei. The lactic acid bacteria strains and the low-temperature yeast Debaryomyces hansenii purchased from Beijing Institute of Microbiology are mixed to ferment yak meat. Single factor test and orthogonal test are used to study and optimize the yak meat processing technology. The results show that the optimal processing technology of fermented yak meat is inoculation amount of 1.5%， strain ratio of Lactobacillus sakei to Debaryomyces hansenii of 1∶3， fermentation temperature of 33 ℃ and fermentation time of 24 h.

Key words： yak meat; fermentation; molecular biology; lactic acid bacteria

收稿日期：2024-06-14

基金項目：2019年國家產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺項目（2019-00901-1-1）

作者簡介：王福清（1963—），男，正高級工程師，碩士，研究方向：食品加工技術(shù)。

牦牛肉是一種營養(yǎng)豐富的肉類，其主要營養(yǎng)成分包括高質(zhì)量蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)[1-2]。牦牛肉中的蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸組成均衡，有助于維持身體組織的生長和修復(fù)[3]。脂肪含量相對較低，但富含對人體有益的不飽和脂肪酸，如亞油酸和亞麻酸，有助于維護心血管健康[4]。此外，牦牛肉中還含有豐富的B族維生素和礦物質(zhì)，如鐵、鋅、硒等，對提高免疫力、促進新陳代謝和維持神經(jīng)系統(tǒng)功能都有益處[5]。

發(fā)酵牦牛肉是以新鮮的牦牛肉為原料，通過分割和腌制發(fā)酵后自然風干而成，深受消費者喜愛[6]。在自然環(huán)境條件下，發(fā)酵牦牛肉在環(huán)境微生物和內(nèi)源酶的作用下發(fā)生了一系列化學變化，生成了具有獨特風味的發(fā)酵牦牛肉干[7]。目前牦牛肉生產(chǎn)的主要方式為家庭小作+坊式，缺乏統(tǒng)一的生產(chǎn)標準，不規(guī)范的生產(chǎn)導致牦牛肉品質(zhì)參差不齊，給食品的安全性帶來了潛在風險[8]。

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，廣泛存在于自然界中，它們通過分解糖類產(chǎn)生乳酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品加工等領(lǐng)域，與人類生活密切相關(guān)[9]。乳酸菌有助于平衡腸道微生物群落，改善腸道環(huán)境并抑制有害微生物生長。研究表明，乳酸菌可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病微生物，能夠提高免疫力和發(fā)揮益生功效[10]。

研究牦牛肉加工工藝不僅可以提高牦牛肉制品的品質(zhì)和口感，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，而且可以開發(fā)出更多種類的牦牛肉制品，滿足消費者的需求。此外，優(yōu)化加工工藝還能提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，促進牦牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[11-12]。另外，研究加工工藝還有助于探索牦牛肉的營養(yǎng)特點和功能成分，為開發(fā)更多具有營養(yǎng)保健功能的牦牛肉制品提供科學依據(jù)。

不同的海拔、氣候環(huán)境、加工方式對發(fā)酵牦牛肉中的微生物多樣性影響較大[13]，因此，本研究通過分離純化的方法獲得適用于西藏地區(qū)牦牛肉發(fā)酵的乳酸菌，并對西藏地區(qū)發(fā)酵牦牛肉的加工工藝進行研究和優(yōu)化，旨在為西藏地區(qū)發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

西藏傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛肉、新鮮牦牛肉、食用鹽：購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；MRS培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；冰醋酸：南京松冠生物科技有限公司；NaNO2：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇：汾陽堂（上海）實業(yè)有限公司。

1.2 試驗儀器

恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；冰箱 東莞市昊昕儀器設(shè)備有限公司；電子天平 常州萬泰天平儀器有限公司；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子顯微鏡 北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司；pH計 優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；PCR儀 西安天隆科技有限公司；振蕩儀 廣東潔盟超聲實業(yè)有限公司；電泳儀 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

將含有乳酸菌的發(fā)酵牦牛肉適當稀釋，以便在培養(yǎng)基中形成單個菌落。使用MRS培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)，將處理后的樣品在制備好的培養(yǎng)基表面均勻涂布，培養(yǎng)后可以在培養(yǎng)皿上觀察到乳酸菌形成的菌落。根據(jù)形態(tài)特征，挑選單個菌落進行分離，利用無菌技術(shù)，使用接種環(huán)或接種針進行分離。將分離得到的單個菌落進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，確保培養(yǎng)物中只含有一種乳酸菌，將獲得的乳酸菌保存于低溫冰箱中待用。

1.3.2 乳酸菌生物量測定

取50 mL樣品，使用高速離心機在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的條件下離心10 min，之后將上清液移除，獲得沉淀，將沉淀置于50～60 ℃的烘箱中快速烘干，最后稱取重量并記錄。

1.3.3 乳酸菌分子生物學鑒定

利用DNA試劑盒對乳酸菌中的DNA進行提取，DNA提取方法按照說明書進行，提取后的DNA以通用引物RSJ-F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）/RSJ-N（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）作為模板，利用PCR儀進行擴增，之后將擴增結(jié)果送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

將獲得的序列于NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進行比對，得到物種的近似種，將近似種與試驗獲得的結(jié)果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，最終明確菌株的分類學地位。

1.3.4 單因素試驗

控制接種量1%、清酒乳酸桿菌與德巴利氏酵母菌比例2∶3、發(fā)酵溫度30 ℃和發(fā)酵時間18 h，分別研究不同接種量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、不同菌種比例（1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、2∶1、3∶2）、不同發(fā)酵溫度（24，27，30，33，36，39 ℃）、不同發(fā)酵時間（6，12，18，24，30，36 h）對發(fā)酵牦牛肉感官評分和pH值的影響。

1.3.5" 感官評價

邀請20位具有發(fā)酵牦牛肉感官評分經(jīng)驗的人員對發(fā)酵牦牛肉進行評分，以發(fā)酵牦牛肉的顏色、氣味、組織結(jié)構(gòu)和硬度為指標進行感官評分。感官評分標準見表1。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以接種比例、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為變量，發(fā)酵牦牛肉的感官評分為指標，進行四因素三水平正交試驗，正交試驗表見表2。

2 結(jié)果和討論

2.1 牦牛肉中的乳酸菌分離鑒定及其生物學特性研究

2.1.1 菌株的分離鑒定

從發(fā)酵牦牛肉中分離獲得25株革蘭氏陽性菌，采用3M測試片對所有菌株進行篩選，一共獲得13株符合乳酸菌特征的菌株，分別編號為1～13號。

2.1.2 不同溫度對菌株生長能力的影響

低溫發(fā)酵劑相比于常溫發(fā)酵劑能夠很好地維持食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，有效防止食物中的營養(yǎng)物質(zhì)流失。在低溫環(huán)境條件下，采用低溫發(fā)酵劑對食物進行發(fā)酵，能夠更好地將食物中的原料分解成相關(guān)的功能因子。我國西藏地區(qū)海拔高，菌株需在低溫條件下生長繁殖，所以，本研究對13株乳酸菌在不同溫度條件下的生物量進行測定對比，分析不同溫度對乳酸菌生物量的影響。13株乳酸菌菌株在不同溫度條件下的生物量變化見表3。

由表3可知，在不同溫度條件下，乳酸菌菌株的生長能力存在差異，在15 ℃條件下，所有乳酸菌的生物量均較低，此時13株乳酸菌的平均生物量為0.05 g/50 mL，隨著溫度不斷升高，乳酸菌的生物量開始有一定提升。當溫度為35 ℃時，13株乳酸菌的平均生物量為0.615 g/50 mL。當溫度低于20 ℃時，13株乳酸菌生長速率均較緩慢，分離所獲得的大部分乳酸菌在35 ℃條件下均能正常生長。菌株7，8，10，12的生物量在30 ℃時最高，相比于其他菌株，生長所需要的最適溫度也偏低，因此判斷菌株7，8，10，12適用于西藏牦牛肉發(fā)酵。

由圖1可知，當培養(yǎng)時間為0～12 h時，4株乳酸菌生長緩慢，主要是因為將乳酸菌接種到新環(huán)境中，需要一定的時間來適應(yīng)新環(huán)境，所以其生長速度緩慢。當培養(yǎng)時間為16～32 h時，4株乳酸菌快速生長。當培養(yǎng)時間大于36 h時，乳酸菌的生長進入平緩階段，說明此時乳酸菌的出生率和死亡率相等。

2.1.3 菌株的耐NaCl測試

食鹽在肉制品發(fā)酵過程中有著不可替代的作用。高濃度的食鹽在制作發(fā)酵制品時能夠有效地防止腐敗微生物生長，同時在保證發(fā)酵制品品質(zhì)的基礎(chǔ)上也能有效延長發(fā)酵制品的貨架期。所以，研究乳酸菌在鹽溶液中的生長能力尤為重要。4株乳酸菌在NaCl溶液中的生物量見圖2。

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的不斷增加，菌株的生長能力逐漸減弱，說明NaCl濃度對乳酸菌存在一定程度的抑制作用。當NaCl濃度為0%時，4株菌株的乳酸菌生長較快，生物量為1.3～2 g/50 mL，當NaCl濃度為20%時，乳酸菌的狀態(tài)較差，生長速度較緩慢，生物量為0.1～0.4 g/50 mL。隨著NaCl濃度的提升，4株菌株中的生物量雖然不斷減少，但生物量減緩的速度變慢。

2.1.4 不同NaNO2濃度對菌株生長能力的影響

在制作發(fā)酵食品時，為了改善風味和延長貨架期，通常會添加一些亞硝酸鹽。在發(fā)酵肉制品中，亞硝酸鹽與肉中的肌紅蛋白反應(yīng)，形成亞硝基肌紅蛋白。隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵肉中也會產(chǎn)生亞硝酸鹽，從而影響乳酸菌的耐受性。4株乳酸菌受NaNO2濃度的影響見圖3。

由圖3可知，隨著培養(yǎng)基中NaNO2濃度的持續(xù)增加，4株菌株的生物量不斷下降。當沒有添加NaNO2時，4株菌株的生長情況良好，生物量為0.8～1.1 g/50 mL。當NaNO2濃度升高至5 mg/mL時，乳酸菌的生物量開始降低，此時生物量為0.8～0.95 g/50 mL；當NaNO2濃度為15 mg/mL時，乳酸菌的生物量相對較低，為0.5～0.62 g/50 mL。隨著NaNO2濃度的不斷增加，4株菌株的生長速率均不斷下降，但下降速度較緩慢，說明這4株菌株對NaNO2溶液的耐受性較高。

2.1.5 菌株產(chǎn)酸能力測定

在牦牛肉發(fā)酵過程中，pH值是檢驗發(fā)酵食品是否成熟的重要指標，肉在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使得pH值逐漸降低。所以，本研究對4株菌株的產(chǎn)酸能力進行測定，見圖4。

由圖4可知，當4株乳酸菌培養(yǎng)2 d后，培養(yǎng)基中的pH值為4～5，表明4株乳酸菌菌株的產(chǎn)酸能力較強，可以用于制作發(fā)酵劑。

2.1.6 基于16S rDNA序列對菌株進行鑒定

采用分子生物學手段對4株菌株進行鑒定，見圖5。

由圖5可知，菌株7和菌株8為乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12為清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）。

2.2 低溫復(fù)合發(fā)酵劑的混合應(yīng)用研究

2.2.1 單因素試驗

不同菌株之間會產(chǎn)生拮抗作用和協(xié)同作用，就發(fā)酵劑而言，菌種的比例非常重要，直接決定發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)。將本研究分離獲得的10號菌株清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）與從北京微生物所種質(zhì)資源庫購買的德巴利氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）進行混合接種，研究不同比例的菌種對發(fā)酵牦牛肉品質(zhì)的影響。

由圖6可知，當清酒乳酸桿菌和德巴利氏酵母菌的比例為2∶3時，發(fā)酵牦牛肉的感官評分最高。

接種量直接影響發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)和貨架期，因此，菌種的接種量非常重要，本研究分析了不同接種量對牦牛肉品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵牦牛肉的感官評分先升高后降低。當接種量為1%時，發(fā)酵牦牛肉的感官評分最高，為90分。

發(fā)酵溫度會對發(fā)酵劑產(chǎn)生影響，溫度過低或者過高均會影響清酒乳酸桿菌和德巴利氏酵母菌的活性，從而影響發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)。所以，在生產(chǎn)發(fā)酵牦牛肉過程中，合適的發(fā)酵溫度能夠最大限度提高牦牛肉產(chǎn)能。不同發(fā)酵溫度對牦牛肉感官評分和pH值的影響見圖8。

由圖8可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵牦牛肉的pH值和感官評分先升高后降低。當發(fā)酵溫度為30 ℃時，牦牛肉的感官評分最高，為80分，pH值為5.6。

發(fā)酵時間也是影響牦牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，若發(fā)酵時間過短，會導致發(fā)酵牦牛肉未能充分釋放功能性成分；若時間過長，可能會引發(fā)雜菌滋生，影響其品質(zhì)。不同發(fā)酵時間對發(fā)酵牦牛肉品質(zhì)的影響見圖9。

由圖9可知，隨著發(fā)酵時間的不斷增加，發(fā)酵牦牛肉的感官評分先升高后降低，pH值不斷降低。當發(fā)酵時間為18 h時，發(fā)酵牦牛肉的感官評分最高，為93分，此時發(fā)酵牦牛肉的pH值為5.6。若發(fā)酵時間過短，牦牛肉中并未形成完整的風味物質(zhì)；發(fā)酵時間若過長，使得牦牛肉中積累的酸性物質(zhì)過多，從而影響牦牛肉中的風味物質(zhì)，導致其感官評分下降。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵牦牛肉的加工工藝進行優(yōu)化，發(fā)酵牦牛肉正交試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，對比4個因素（接種比例、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度）對發(fā)酵牦牛肉品質(zhì)的影響，接種比例、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度4個因素的R值分別為3.9，7.2，1.5，6.9，說明接種量對發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)影響最大，而發(fā)酵時間對發(fā)酵牦牛肉的品質(zhì)影響最小。對比9組試驗，第3組發(fā)酵牦牛肉的感官評分最高，感官評分為95.8分，此時發(fā)酵牦牛肉的加工工藝為接種量1.5%、清酒乳酸桿菌與德巴利氏酵母菌比例1∶3、發(fā)酵溫度33 ℃和發(fā)酵時間24 h。

3 小結(jié)

我國西藏地區(qū)牦牛肉資源豐富，牦牛肉中富含營養(yǎng)物質(zhì)，但由于交通運輸不便，發(fā)酵將是未來很長一段時間內(nèi)牦牛肉加工的主要加工方法之一[14]。

發(fā)酵牦牛肉是西藏地區(qū)的特色食品，具有獨特的風味，能夠長時間貯藏。以前的發(fā)酵牦牛肉主要通過家庭小作坊式加工處理，采用晾曬方式，發(fā)酵牦牛肉的生產(chǎn)周期較長且效率較低，貯藏后期容易發(fā)生霉變現(xiàn)象[15]。本研究基于此，先對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛肉中的乳酸菌菌株進行分離，同時對分離菌株的生物學特性進行研究，發(fā)現(xiàn)牦牛肉中適合在西藏地區(qū)發(fā)酵的菌株共有4株，其中菌株7和菌株8為乳酸球菌（Lactococcus garvieae），菌株10和菌株12為清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）。

利用分離到的菌株10清酒乳酸桿菌結(jié)合從北京微生物所種質(zhì)資源庫購買的菌株德巴利氏酵母菌，對牦牛肉加工工藝進行研究和優(yōu)化，研究結(jié)果表明，發(fā)酵牦牛肉的最佳加工工藝為接種量1.5%、清酒乳酸桿菌與德巴利氏酵母菌比例1∶3、發(fā)酵溫度33 ℃和發(fā)酵時間24 h。

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