摘要：利用十二烷基三甲基溴化銨（dodecyl trimethyl ammonium bromide，DTAB）-異辛烷-正己醇反膠束體系，對花椒籽中的蛋白質(zhì)和油脂同步萃取進行了探究。結(jié)果表明，前萃過程油脂直接溶解于有機相中，蛋白質(zhì)增溶于反膠束極性核中，蛋白質(zhì)的前萃率受DTAB濃度、萃取時間、緩沖溶液pH值、氯化鈉濃度、料液比的影響。隨后，反膠束溶液通過加入等體積含有一定離子強度和pH值的水相構(gòu)筑Winsor Ⅱ微乳體系來實現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。其蛋白質(zhì)后萃率和油脂萃取率受后萃水相的酸度和離子強度等因素的影響。

關(guān)鍵詞：反膠束；花椒籽；十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）；萃??；蛋白質(zhì)和油脂

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0071-04

Research on Extraction of Protein and Oil from Zanthoxylum bungeanum

Maxim. Seed by DTAB Reverse Micelle

ZHENG Yong-jun1，2， WANG Jian-guang1，2， ZHENG Yong1， LUO Feng1

（1.College of Chemical and Environmental Engineering， Anyang Institute of Technology，

Anyang 455000， China; 2.Henan Key Laboratory of Subcritical High-efficiency

Extraction， Anyang 455000， China）

Abstract： By using dodecyl trimethyl ammonium bromide （DTAB）-isooctane-n-hexanol reverse micelle system， the simultaneous extraction of protein and oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed is investigated. The results show that in the pre-extraction process， the oil is directly dissolved in the organic phase， while the protein is solubilized in the polar nucleus of the reverse micelle. The pre-extraction rate of protein is affected by the concentration of DTAB， extraction time， pH value of the buffer solution， the concentration of sodium chloride and solid-liquid ratio. Subsequently， the reverse micelle solution is used to construct Winsor Ⅱ microemulsion system by adding an equal volume of aqueous phase containing a certain ionic strength and pH value to achieve protein transfer. The post-extraction rate of protein and the extraction rate of oil are influenced by the acidity and ionic strength of the aqueous phase.

Key words： reverse micelle; Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed; dodecyl trimethyl ammonium bromide （DTAB）; extraction; protein and oil

收稿日期：2024-05-20

基金項目：安陽工學(xué)院科研項目培育基金（YPY2021012）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（22B530001）；安陽市科技攻關(guān)項目（2022C01NY002）

作者簡介：鄭永軍（1966—），男，教授，博士，研究方向：油料作物的提取。

花椒是太行山區(qū)的主要經(jīng)濟作物之一，是一種重要的原始調(diào)味品，而花椒籽是花椒調(diào)味品的主要副產(chǎn)物，常被當(dāng)作廢棄物來處理。然而，花椒籽中含有油脂25%～30%，其中不飽和脂肪酸含量占90%，人體必需但又不能自身合成的脂肪酸占45%以上，且粗蛋白含量在14%～31%之間[1]。因此，采用先進的萃取技術(shù)提取花椒籽中油脂和蛋白質(zhì)對花椒籽的深加工具有一定指導(dǎo)意義。

反膠束微乳液是表面活性劑在油水界面上自發(fā)形成的非極性基團向外與連續(xù)的油相接觸，極性基團排列在內(nèi)與水構(gòu)成“水池”熱力學(xué)穩(wěn)定的、均一透明的納米聚集體（W/O微乳液）[2]。當(dāng)反膠束微乳液與粉碎后的花椒籽接觸時，花椒籽中所含油脂等疏水性物質(zhì)直接溶解于連續(xù)的有機相中，其所含的蛋白質(zhì)等親水性物質(zhì)則增溶于“水池”中（此過程稱為前萃）[3]，再將含有蛋白質(zhì)和油脂的反膠束有機相與一定鹽度緩沖液的水相混合，蛋白質(zhì)通過超聲或振蕩從反膠束極性核中轉(zhuǎn)移到一定鹽度緩沖液的水相中，最終從含有一定鹽度緩沖液的水相中得到蛋白質(zhì)，從有機相中得到油脂（此過程稱為后萃）[4]。該反膠束萃取技術(shù)因萃取的蛋白質(zhì)可保持原有的生物活性且所用溶劑可以回收利用，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)與油脂的同時分離，日益受到業(yè)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注[5]。已有利用反膠束萃取技術(shù)以花生粕[6]、葵花粕[4]、大豆粕[7]、玉米胚芽[8]、小麥胚芽[9]、葡萄籽[10]為原料對其中的蛋白質(zhì)和油脂進行提取的報道。但對于花椒籽進行植物蛋白和油脂的提取還未見報道，本文利用反膠束分散體系對花椒籽中的蛋白質(zhì)和油脂進行萃取探究，討論在超聲輔助下表面活性劑、花椒籽與反膠束溶液的料液比、氯化鈉濃度、緩沖溶液pH值、萃取時間等因素對萃取率的影響，實現(xiàn)對花椒籽中蛋白質(zhì)和油脂的同步萃取，并優(yōu)化萃取條件，從而為花椒籽的深加工提供試驗支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料

花椒籽：河南安陽本地市售；十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；異辛烷（AR）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；正己醇（AR）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV2600型紫外可見分光光度計 日本島津公司；800B型低速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3型精密pH計 上海雷磁儀器廠；RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；ME204E型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DTAB反膠束溶液的配制

稱取一定量的DTAB，置于150 mL錐形瓶中，加入20 mL異辛烷-正己醇（體積比為4∶1），并加入一定濃度NaCl的緩沖液（Na2HPO4-KH2PO4，調(diào)節(jié)pH值）至飽和，超聲振蕩至DTAB完全溶解，溶液透明后，于室溫下存放備用[4]。

1.3.2 前萃試驗

稱取一定量的花椒籽粉末，置于150 mL錐形瓶中，然后加入一定量的反膠束微乳液，在溫度35 ℃、超聲功率150 W的條件下超聲50 min。將混合物放入離心機中，以2 300 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液，采用紫外可見分光光度計于280 nm和 260 nm波長處分別測定吸光度（以萃取前反膠束溶液做空白對照），平行測定3次后取平均值代入公式（1）中，根據(jù)公式（1）計算上清液中蛋白質(zhì)濃度，由此根據(jù)公式（2）得出花椒籽蛋白質(zhì)的前萃率。

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45×A280 nm-0.74×A260 nm[11]。（1）

式中：A280 nm和A260 nm分別為蛋白質(zhì)溶液在280 nm和260 nm處測得的吸光度。

蛋白質(zhì)前萃率（S，%）=反膠束溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）/試樣質(zhì)量（g）×試樣中蛋白質(zhì)含量（%）×100%。（2）

1.3.3 后萃試驗

在前萃試驗的上層有機相中加入等體積的一定濃度NaCl緩沖液（Na2HPO4-KH2PO4，調(diào)節(jié)pH值）。在溫度35 ℃、超聲功率150 W的條件下超聲振蕩，然后以2 300 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，經(jīng)分液漏斗分液。然后取下層水相，在波長280 nm和260 nm處分別測定其吸光度（以所加緩沖液做空白對照），平行測定3次后取平均值代入公式（1）中，根據(jù)公式（1）計算出水相中蛋白質(zhì)的濃度，求出花椒籽蛋白質(zhì)的后萃率。

蛋白質(zhì)后萃率（R，%）=水相中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）/反膠束溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）×100%[4]。（3）

1.3.4 油脂含量的測定

將經(jīng)分液漏斗分液的上層有機相先經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)回收溶劑異辛烷，再在余液中加入2倍體積的70%乙醇，在超聲波輔助技術(shù)下萃取5 min，然后加入與乙醇等體積的2 mol/L氯化鈉溶液，在超聲波輔助技術(shù)下萃取5 min，靜置分層后，取上清液在減壓蒸發(fā)回收乙醇和正己醇后得花椒籽油。用分析天平稱重后計算油脂萃取率。

油脂萃取率（%）=有機相中油脂的質(zhì)量（g）/萃取所用材料中油脂的質(zhì)量（g）×100%[12]。（4）

1.3.5 花椒籽成分測定方法

花椒籽中蛋白質(zhì)含量按文獻[13]前處理后利用紫外分光光度法測定，油脂按GB 5009.6—2016中索氏提取法測定，水分按GB 5009.3—2016中直接干燥法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒籽成分

去除花椒籽中的雜質(zhì)，將花椒籽粉碎，過20目篩，測得花椒籽油脂含量為21.45%，粗蛋白含量為14.12%，水分含量為9.67%，其余為不溶性纖維。將粉碎過篩的花椒籽粉末在80 ℃的真空干燥箱中烘干6 h，保存?zhèn)溆茫鳛楹罄m(xù)試驗的原料。

2.2 前萃試驗因素對蛋白質(zhì)前萃率和油脂萃取率的影響

2.2.1 反膠束DTAB濃度

固定pH值為6，氯化鈉緩沖液濃度為0.1 mol/L，花椒籽粉末與反膠束溶液的比例為1∶20 （g/mL），考察不同反膠束DTAB濃度對蛋白質(zhì)前萃率的影響，結(jié)果見表1。

由表1可知，蛋白質(zhì)的前萃率隨著DTAB濃度的增加而逐漸增加。當(dāng)DTAB濃度達到12 mg/mL時，前萃率達到最大值，這是由于在異辛烷非極性有機溶劑中，隨著DTAB濃度的增加，單位體積內(nèi)DTAB所形成的反膠束數(shù)量增多，萃取的蛋白質(zhì)也會增加，而且DTAB濃度的增加會使體系的極性增加，反膠束與蛋白質(zhì)分子間的作用力增強，有利于蛋白質(zhì)的萃取。但DTAB濃度增加到一定程度會使體系的黏稠度增加，從而影響蛋白質(zhì)的萃取[14]。由于DTAB在非極性的異辛烷中存在超低的界面張力而使油脂從花椒籽中釋放出來，又因油脂與異辛烷的非極性相似，而全部溶解于足量的有機相中[7]。

2.2.2 超聲振蕩時間

固定DTAB濃度為12 mg/mL，花椒籽粉末與反膠束溶液的比例為1∶20 （g/mL），pH值為6，氯化鈉緩沖液濃度為0.1 mol/L，考察不同超聲振蕩時間對蛋白質(zhì)前萃率的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，萃取時間在20～50 min內(nèi)，隨著萃取時間的增加，花椒籽蛋白質(zhì)從原料表面遷移至反膠束“水池”中的量不斷增多，因而萃取率不斷增加，由于花椒籽中的油脂和其蛋白質(zhì)一樣，也是從花椒籽原料表面逐漸遷移到連續(xù)的有機相中，所以，隨著萃取時間的增加，萃取出來的油脂也將不斷增加。由于隨著萃取時間的增加，原料中的蛋白質(zhì)和油脂逐漸減少，蛋白質(zhì)和油脂向原料表面遷移的速率也減少，而反膠束“水池”中蛋白質(zhì)濃度增加和異辛烷中的油脂量增多，導(dǎo)致其傳質(zhì)推動力減小，當(dāng)萃取時間達到50 min時，花椒籽與反膠束微乳液萃取基本達到平衡[7]，萃取率最大。但在50 min以后，蛋白質(zhì)的萃取率開始下降，這可能是因為隨著萃取時間繼續(xù)增加，反膠束由于離子強度等因素的影響而發(fā)生了滲濾現(xiàn)象，使反膠束結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降，故選取萃取時間為50 min進行后續(xù)試驗。

2.2.3 pH值

由于DTAB的濃度為6 mg/mL與12 mg/mL時對蛋白質(zhì)前萃率的影響較小，且DTAB濃度較大時，分離的油脂會有附著一定量的表面活性劑，為了減少表面活性劑對油脂提純純度的影響，故固定DTAB濃度為6 mg/mL進行試驗，花椒籽粉末與反膠束溶液的比例為1∶20 （g/mL），氯化鈉溶液濃度為0.1 mol/L，放入超聲清洗機中超聲50 min后，將混合物放入離心機中以2 300 r/min離心20 min，取上清液，分別測定在波長為280 nm和260 nm處的吸光度值，考察不同pH值對蛋白質(zhì)前萃率的影響，結(jié)果見表3。

由表3可知，蛋白質(zhì)的前萃率隨著緩沖液pH值的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH值為6時，蛋白質(zhì)的前萃率最大。由于DTAB是陽離子表面活性劑，在其構(gòu)成反膠束時，表面活性劑極性端和蛋白質(zhì)所帶電荷間的靜電作用是蛋白質(zhì)進入反膠束極性核的主要推動力[9]。當(dāng)“水池”中的pH值高于花椒籽蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)所帶電荷與陽離子表面活性劑的極性端所帶電荷的靜電引力使蛋白質(zhì)進入反膠束的極性核中。當(dāng)pH值為9時，在界面上出現(xiàn)絮狀物，發(fā)生蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致前萃率下降[15]?；ń纷阎械挠椭捎谌芙庥谶B續(xù)相的異辛烷中，故不會因極性核中pH值的改變而變化，所以，選定緩沖液的pH值為6進行后續(xù)試驗。

2.2.4 氯化鈉濃度

固定DTAB濃度為6 mg/mL，花椒籽粉末與反膠束溶液的比例為1∶20 （g/mL），緩沖液pH值為6，考察不同濃度的氯化鈉對蛋白質(zhì)前萃率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，花椒籽蛋白質(zhì)的前萃率受氯化鈉濃度的影響顯著，花椒籽蛋白質(zhì)的前萃率大致隨鹽濃度的增大先增大后減小，這是因為在緩沖液中鹽濃度影響反膠束“水池”的粒徑大小，同時影響蛋白質(zhì)和反膠束之間的靜電作用[6]。較低濃度的氯化鈉能增加反膠束“水池”的極性，促進蛋白質(zhì)進入“水池”中，提高體系增溶蛋白質(zhì)的量，進而提高蛋白質(zhì)的萃取率。除此之外，水與鹽離子的作用增強，減弱表面活性劑分子與水的相互作用力，促進表面活性劑與異辛烷的反膠束形成，有利于蛋白質(zhì)的萃取[16]。因此，0.1 mol/L的氯化鈉是蛋白質(zhì)前萃率的最佳濃度。而當(dāng)氯化鈉濃度過高時，一是過量的離子在反膠束極性核周圍形成靜電層，從而減少帶電蛋白質(zhì)與反膠束極性核之間的靜電吸引；二是由于較高濃度的氯化鈉存在，使進入“水池”的蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析，導(dǎo)致蛋白質(zhì)萃取率下降。

2.2.5 料液比

固定DTAB濃度為12 mg/mL、pH值為6、氯化鈉濃度為0.1 mol/L，考察不同花椒籽粉末與反膠束體系的比例對蛋白質(zhì)前萃率的影響，結(jié)果見表5。

由表5可知，蛋白質(zhì)前萃率隨著花椒籽粉末加入量的增加而降低，可能是由于對一定體積的反膠束體系來說，其“水池”的聚集數(shù)是一定的，增溶蛋白質(zhì)的能力也是有限的，隨著花椒籽粉末加入量的增加，相同體積、相同反膠束體系增溶蛋白質(zhì)的能力反而減小，蛋白質(zhì)進入反膠束“水池”內(nèi)核產(chǎn)生了競爭機制，因而蛋白質(zhì)的前萃率逐漸降低。綜合考慮蛋白質(zhì)前萃率和蛋白質(zhì)產(chǎn)量，為了保證前萃率較高且有較大的產(chǎn)量，選取料液比1∶20較適宜，此時，對于油脂萃取，較低的料液比也可以使花椒籽與反膠束體系充分接觸，將油脂充分萃取出來，完全溶解于連續(xù)相的異辛烷中[17]。

2.3 后萃試驗因素對蛋白質(zhì)后萃率和油脂萃取率的影響

2.3.1 氯化鈉濃度

向pH值為6、氯化鈉濃度為0.1 mol/L前萃試驗的上清液中加入等體積、pH值為8、不同濃度的氯化鈉緩沖液進行充分接觸，超聲振蕩50 min，離心20 min。提取下層水相，對其后萃蛋白質(zhì)進行測定，上層油相經(jīng)處理后得萃取油脂，用分析天平稱其質(zhì)量，結(jié)果見表6。

由表6可知，蛋白質(zhì)的后萃率隨著氯化鈉濃度的增加先升高后降低，當(dāng)氯化鈉濃度為1.2 mol/L時，蛋白質(zhì)的后萃率達到最大值，這是由于氯化鈉濃度的增大減少了表面活性劑極性端之間的斥力，使反膠束增溶量減少，蛋白質(zhì)隨著反膠束容量的減少而逐漸溶出，同時，由于蛋白質(zhì)不斷溶出到后萃水相體系中，致使反膠束“水池”中與水相中蛋白質(zhì)形成濃度差，不斷促進蛋白質(zhì)后萃取到水相中，因此，在氯化鈉濃度未達到1.2 mol/L時，蛋白質(zhì)的后萃率逐漸增大。但當(dāng)氯化鈉濃度過高時，由于鹽析作用使蛋白質(zhì)后萃率減小。油脂的萃取率隨著氯化鈉濃度的增加先升高后降低，當(dāng)氯化鈉濃度為1.2 mol/L時，油脂萃取率達到最大值。后萃試驗實際上是反膠束微乳液加入等體積的水相后構(gòu)成的Winsor Ⅱ型微乳體系，少量的氯化鈉電解質(zhì)有利于含有油脂的有機相與水相的分層，此時獲得的油脂最多，但過量的電解質(zhì)使該體系轉(zhuǎn)變成水包油膠束的水相與含油脂的有機相構(gòu)成的Winsor Ⅰ型微乳體系，造成油脂不能充分分離，從而使油脂的萃取率下降[18]。由表6可知，氯化鈉濃度為1.2 mol/L時可以同時獲得較高的蛋白質(zhì)后萃率和油脂萃取率。

2.3.2 緩沖液pH值對蛋白質(zhì)后萃率和油脂萃取率的影響

向DTAB為6 mg/mL、pH值為6、氯化鈉濃度為0.1 mol/L的上清液中加入等體積、不同pH值的1.0 mol/L的氯化鈉緩沖液，超聲振蕩50 min，離心20 min。提取下層水相，對其后萃蛋白質(zhì)進行測定，上層油相經(jīng)處理后得萃取油脂，用分析天平稱其質(zhì)量，結(jié)果見表7。

由表7可知，隨著緩沖液pH值的增加，蛋白質(zhì)的后萃率和油脂的萃取率也隨之增加，當(dāng)pH值為8時，蛋白質(zhì)的后萃率和油脂的萃取率最大，這是因為pH值的增加使蛋白質(zhì)表面所帶負(fù)電荷量增加，蛋白質(zhì)所帶的負(fù)電荷與反膠束表面活性劑所帶的負(fù)電荷靜電斥力增加，蛋白質(zhì)在反膠束“水池”的增溶性降低，從而使蛋白質(zhì)增溶到水相中[19]，蛋白質(zhì)后萃率隨之增加。但當(dāng)pH值過高時，在兩相界面形成絮狀物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，使其后萃率下降，同時，由于油脂部分皂化造成油脂在水相中乳化而分離困難，從而使油脂的萃取率下降[3]。

3 結(jié)論

利用DTAB（十二烷基三甲基溴化銨）-正己醇-異辛烷反膠束體系對花椒籽蛋白質(zhì)和油脂進行萃取，發(fā)現(xiàn)反膠束溶液與一定濃度和酸度的水相構(gòu)筑Winsor Ⅱ微乳體系來達到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，說明蛋白質(zhì)與油脂的同步萃取是可行的。

通過試驗可知前萃較優(yōu)條件：DTAB濃度為6 mg/mL，花椒籽與反膠束溶液的料液比為1∶20（g/mL），氯化鈉濃度為0.1 mol/L，緩沖溶液pH值為6，萃取時間為50 min，后萃試驗條件為緩沖溶液pH值8、水相的氯化鈉濃度1.2 mol/L，可以獲得較高的蛋白質(zhì)后萃率和油脂萃取率。然而，由于配制的飽和反膠束體系存在人為誤差，萃取油脂中附著一定的表面活性劑，致使試驗結(jié)果存在一定的偏差，所以，進一步配制準(zhǔn)確的反膠束體系，去除萃取油脂附著的表面活性劑以及對前萃和后萃的最佳條件進一步優(yōu)化，將是進一步研究的方向。

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