摘要：為解析嗜熱鏈球菌發(fā)酵二荊條辣椒后產(chǎn)胞外多糖（SR-EPS）的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)探究其體外抗氧化活性，文章以水提醇沉法提取SR-EPS，經(jīng)Sevage法除蛋白、透析截留去雜質(zhì)后，測(cè)定了SR-EPS的基本成分，利用高效液相凝膠色譜儀、傅里葉紅外光譜儀、離子色譜儀、掃描電鏡等對(duì)SR-EPS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征，同時(shí)考察了其在體外的抗氧化活性。結(jié)果表明，SR-EPS的得率為94 mg/mL，可溶性總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量分別為39.23%、0.88%、9.03%；SR-EPS由3個(gè)主要組分構(gòu)成，包含α和β兩種類(lèi)型的糖苷鍵，是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主的酸性雜多糖，表觀結(jié)構(gòu)為顆粒堆疊狀、緊密且有規(guī)則；SR-EPS對(duì)ABTS+·、DPPH·和羥基自由基的清除能力以及鐵離子螯合能力均以劑量為依賴(lài)。綜上，該研究可為了解乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖的體外抗氧化活性提供參考，也為胞外多糖結(jié)構(gòu)有序性理論提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為乳酸菌胞外多糖在功能性食品中的研發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：嗜熱鏈球菌；辣椒；胞外多糖；結(jié)構(gòu)解析；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）11-0052-07

Extraction， Structural Characteristics and in Vitro Antioxidant Activity of

Extracellular Polysaccharides from Peppers Fermented by Streptococcus thermophilus

HU Ying1， LUO Fang1， YAN Zhang-jin-bo1， ZU Jiao1， MIN Li1， JIANG Wei2*

（1.Zunyi Medical University， Zunyi 563000， China; 2.Zunyi Medical and Pharmaceutical

College， Zunyi 563000， China）

Abstract： In order to analyze the structural characteristics of extracellular polysaccharides （SR-EPS） from Erjingtiao" peppers fermented by Streptococcus thermophilus， and to explore its in vitro antioxidant activity， in this paper， SR-EPS are extracted by water extraction and alconol precipitation method. After the protein is removed by Sevage method and impurities are removed by dialysis and entrapment， the basic components of SR-EPS are determined， and the structure of SR-EPS is preliminarily characterized by high performance liquid gel chromatograph， Fourier infrared spectrometer， ion chromatograph， scanning electron microscope and so on. At the same time， its in vitro antioxidant activity is investigated. The results show that the yield of SR-EPS is 94 mg/mL， and the content of total soluble sugars， proteins and uronic acids is 39.23%， 0.88%， 9.03% respectively. SR-EPS are composed of three main components， including two types of glycosidic bonds such as α and β. They are acidic heteropolysaccharides mainly composed of mannose， glucose and galactose. Their apparent structure is particle stacking， compact and regular. The scavenging capacity of SR-EPS on ABTS+， DPPH， hydroxyl radicals and iron ion chelation capacity are dose-dependent. In summary， this study can provide references for understanding the in vitro antioxidant activity of extracellular polysaccharides from peppers fermented by lactic acid bacteria， and provide data support for the theory of structural order of extracellular polysaccharides. At the same time， it can provide a certain theoretical basis for the research and application of lactic acid bacteria extracellular polysaccharides in functional foods.

Key words： Streptococcus thermophilus; pepper; extracellular polysaccharides; structure analysis; antioxidant activity

收稿日期：2024-04-29

基金項(xiàng)目：遵義市科技計(jì)劃項(xiàng)目（遵市科合HZ字[2021]226號(hào)）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2023]一般522號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：胡穎（1986—），女，講師，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生、農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)與保鮮。

*通信作者：蔣緯（1988—），男，講師，博士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)與保鮮、糖化學(xué)與糖生物學(xué)。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）已被大量研究證實(shí)在腸道疾病治療、免疫力增強(qiáng)、飲品風(fēng)味改善、抗菌、結(jié)腸癌預(yù)防和過(guò)敏反應(yīng)緩解等方面扮演著正面角色[1-2]。此外，LAB利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物受到國(guó)內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注。在其眾多代謝產(chǎn)物中，胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）已被很多研究證實(shí)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物活性[3]，EPS是一種長(zhǎng)鏈、高分子量化合物，由重復(fù)單元和分支組成，分子量通常在4×104 ～6×106 Da之間[4]。來(lái)源于果蔬制品的EPS產(chǎn)生菌主要包括腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌和食源性干酪乳酸桿菌等乳酸菌[5-11]。而用于EPS產(chǎn)生菌分離的果蔬主要有四川泡菜、菊芋、紅薯、大棗汁、薄荷、東北酸菜等。值得關(guān)注的是，暫未發(fā)現(xiàn)關(guān)于乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖純提物的結(jié)構(gòu)表征及生物活性的相關(guān)研究。因此，關(guān)于乳酸菌發(fā)酵辣椒過(guò)程中EPS的產(chǎn)量、種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、功能活性及其變化規(guī)律的研究十分有意義，不僅能發(fā)掘出發(fā)酵型辣椒的應(yīng)用潛力，而且增加了辣椒的利用價(jià)值，對(duì)于辣椒的開(kāi)發(fā)和利用有著重要的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)以貴州遵義二荊條辣椒為研究對(duì)象，通過(guò)嗜熱鏈球菌純種發(fā)酵，獲取發(fā)酵辣椒胞外多糖后，主要從結(jié)構(gòu)表征和活性表現(xiàn)兩個(gè)方面初步探究SR-EPS，為提升貴州特色優(yōu)質(zhì)資源——辣椒及傳統(tǒng)發(fā)酵食品的應(yīng)用附加值提供了一定的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

原料：二荊條辣椒，購(gòu)于貴州省遵義市新蒲新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

菌株：嗜熱鏈球菌 IFF16038。

精制食鹽、60%紅星二鍋頭酒（均為食品級(jí)）；MRS瓊脂培養(yǎng)基（生物純級(jí)）；蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、甲醇、硫酸、磷酸、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽、EDTA、1，10-菲啰啉（鄰二氮菲）、抗壞血酸、氯化亞鐵、菲啰嗪、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、30%過(guò)氧化氫溶液、苯酚、無(wú)水葡萄糖、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵、考馬斯亮藍(lán)G-250、過(guò)硫酸鉀、D-半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯、無(wú)水四硼酸鈉、氫氧化鈉、單糖標(biāo)準(zhǔn)品等試劑（均為分析純）。

1.2 試驗(yàn)主要儀器

LC-LX-L60D臺(tái)式低速離心機(jī)、LC-10N-50A冷凍干燥機(jī)、LC-RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；KDC-1044 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；Multiskan SkyHigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Thermo ICS 5000+離子色譜系統(tǒng) 賽默飛世爾科技公司；TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；YP3002B電子天平 上海菁海儀器有限公司；SN-LM-75立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；VECTOR 22傅果葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；Aglient 1200高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

根據(jù)喬少婷等[12]的方法并稍作改動(dòng)，將貯藏于-80 ℃的嗜熱鏈球菌劃線接種于MRS平板，40 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，40 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，以3 500 r/min離心10 min，去除上清液，用無(wú)菌生理鹽水對(duì)菌體沉淀洗滌1～2次，再用10 mL無(wú)菌生理鹽水對(duì)其進(jìn)行重懸，渦旋混勻后作為發(fā)酵劑備用，以上操作均在無(wú)菌條件下操作。

1.3.2 原料預(yù)處理及發(fā)酵

挑選無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)腐爛的新鮮二荊條辣椒清洗后晾干，隨后去除辣椒的梗、瓤、籽，切成3～5 cm橫段，用60%的白酒浸泡1～2 min以除去原料表面可能附著的微生物，裝入已滅菌的發(fā)酵罐中后再加入一定量的無(wú)菌水和食鹽，然后以5×105 CFU/g的接種量添加發(fā)酵劑，封罐、充分混勻后發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)程中對(duì)pH值和OD值進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，當(dāng)pH值≤4.0且OD值趨于平穩(wěn)時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，可進(jìn)行EPS的提取制備。

1.3.3 SR-EPS提取流程

參考刁山山等[13]的方法并稍作修改，具體操作：1.3.2中發(fā)酵辣椒所得發(fā)酵液→離心（3 500 r/min，10 min）后取上清液→減壓濃縮（65 ℃）至300 mL→4倍體積無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜（4 ℃）→離心（3 500 r/min，10 min）取沉淀→減壓濃縮（70 ℃）以去除多余的乙醇→蒸餾水復(fù)溶→去離子水透析（截留量1×105 Da，48 h）→Sevage試劑（三氯甲烷∶正丁醇為4∶1）去除糖溶液中的蛋白質(zhì)→減壓揮干殘留Sevage試劑→減壓冷凍干燥→SR-EPS多糖樣品。按下式計(jì)算SR-EPS得率：

粗多糖得率（mg/mL）=粗多糖質(zhì)量（mg）濃縮發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.4 總糖含量的測(cè)定

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL）以及0.1 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，參照苯酚-硫酸法[14]測(cè)定樣品中總糖含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，獲得擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=8.220 3x+0.007 1，R2=0.999 9，SR-EPS樣品的可溶性總糖含量根據(jù)上述回歸方程計(jì)算[15]。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

配制牛血清的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02，0.04，0.08，0.12，0.16 mg/mL）以及1 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，參照考馬斯亮藍(lán)法[16]并稍作修改測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5.144 3x+0.014 2，R2=0.990 4，SR-EPS樣品的蛋白質(zhì)含量根據(jù)上述回歸方程計(jì)算[17]。

1.3.6 糖醛酸含量的測(cè)定

參考楊兵[18]的方法，配制D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.003，0.006，0.009，0.012，0.015 mg/mL）以及0.6 mg/mL的SR-EPS樣品溶液，采用3-苯基酚顯色法測(cè)定樣品中半乳糖醛酸的含量。以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=52.456x-0.019 4，R2=0.999 4計(jì)算SR-EPS樣品中糖醛酸的含量[19]。

1.3.7 SR-EPS結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 分子量及分布測(cè)定

采用高效液相凝膠色譜儀（HPLC）對(duì)SR-EPS的分子量進(jìn)行測(cè)定，精確稱(chēng)取1.00 mg的葡聚糖T-2000、T-500、T-70、T-40和T-10標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分別為2 000 000，500 000，70 000，40 000，10 000 Da）充分溶解于1.0 mL去離子水中，同時(shí)獲得濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和SR-EPS樣品進(jìn)行HPLC分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4，并計(jì)算SR-EPS的分子量。將SR-EPS測(cè)定的保留時(shí)間代入擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-0.346 2x+9.459 5，R2=0.992 7計(jì)算SR-EPS的平均分子量。

1.3.7.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測(cè)定

稱(chēng)取已干燥預(yù)處理的SR-EPS樣品2 mg與干燥恒重的溴化鉀粉末200 mg研磨，壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)利用FT-IR儀進(jìn)行掃描，掃描16次，以2 cm-1的分辨率收集紅外光譜。

1.3.7.3 單糖組成分析

分別精確稱(chēng)取單糖標(biāo)準(zhǔn)品后，加入去離子水配制成單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.4，0.8，4，8，16，24，32，40 μg/mL）；稱(chēng)取適量SR-EPS多糖樣品，加入1 mL 2 mol/L TFA溶液，121 ℃加熱2 h，用氮?dú)獯蹈桑尤?9.99%甲醇清洗，再吹干，重復(fù)甲醇清洗2～3次，加入去離子水溶解，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。采用Thermo ICS 5000+離子色譜系統(tǒng)，利用電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)單糖組分進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.3.7.4 掃描電鏡（SEM）觀察

用導(dǎo)電膠將少量SR-EPS樣品粘于樣品臺(tái)，噴金后，在高真空模式下利用SEM以觀測(cè)倍數(shù)分別為500×、1 000×、2 000×、5 000×觀察SR-EPS的表面形貌。

1.3.8 體外抗氧化活性的測(cè)定

ABTS+·、DPPH·和羥基自由基清除能力以及Fe2+螯合能力的測(cè)定常被用于檢測(cè)抗氧化活性，在本試驗(yàn)中，3種自由基檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照為抗壞血酸（VC），F(xiàn)e2+螯合能力測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照為乙二胺四乙酸（EDTA），SR-EPS多糖樣品被分別配制成0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的系列濃度后待測(cè)。以下試驗(yàn)每個(gè)濃度均進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.3.8.1 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作改動(dòng)，稱(chēng)取38.4 mg ABTS和6.623 mg過(guò)硫酸鉀混合溶解并定容至10 mL，室溫下避光放置過(guò)夜（12 h），用蒸餾水稀釋至溶液在734 nm處的吸光度值為0.700±0.02左右，得到ABTS工作液。吸取50 μL待測(cè)樣液加入96孔板中，再加入ABTS工作液150 μL，在室溫下反應(yīng)30 min后于734 nm處測(cè)定吸光度值。用蒸餾水替代樣品溶液測(cè)定空白值。按下式計(jì)算ABTS自由基清除率：

ABTS+·清除率（%）=（1-ASA0）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代樣品溶液的空白值。

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

采用曹磊等[21]的試驗(yàn)方法，配制150 μmol/L DPPH溶液，用80%的甲醇溶液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光待用。分別于96孔板中加入50 μL待測(cè)樣液和DPPH溶液200 μL，室溫下避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度值。用80%甲醇溶液替代樣品溶液測(cè)定空白值。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH·清除率（%）=（1-ASA0）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；A0為80%甲醇溶液替代樣品溶液的空白值。

1.3.8.3 羥基自由基清除能力測(cè)定

參照李淑敏等[22]的方法并略作修改：待測(cè)樣液取200 μL，加入0.75 mmol/L 1，10-菲啰啉溶液、0.75 mmol/L FeSO4、0.01% 過(guò)氧化氫溶液200 μL，充分混勻后，取反應(yīng)體系液250 μL于96孔板中，37 ℃下反應(yīng)60 min，在536 nm處測(cè)其吸光度值。按下式計(jì)算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）=（AS-AbA0-Ab）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；Ab為蒸餾水替代胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代過(guò)氧化氫溶液和胞外多糖溶液的吸光度值。

1.3.8.4 Fe2+螯合能力測(cè)定

取待測(cè)樣液400 μL于1.5 mL EP管中，依次加入2.0 mmol/L FeCl2溶液20 μL、蒸餾水740 μL，渦旋混勻，于室溫下反應(yīng)3 min，再加入5.0 mmol/L菲啰嗪40 μL，渦旋混勻，于室溫下反應(yīng)10 min后，取250 μL于96孔板中，在562 nm處測(cè)其吸光度值。按下式計(jì)算鐵離子螯合能力：

鐵離子螯合能力（%）=（1-AS-A0Ab）×100%。

式中：AS為胞外多糖溶液的吸光度值；Ab為蒸餾水替代胞外多糖溶液的吸光度值；A0為蒸餾水替代FeCl2溶液的吸光度值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Origin 2022和SPSS 27.0軟件。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SR-EPS基本成分分析

發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌接種量為5×105 CFU/g，在40 ℃條件下發(fā)酵二荊條辣椒至pH值≤4.0且OD值處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，獲取含有嗜熱鏈球菌胞外多糖的發(fā)酵液。通過(guò)水提醇沉法提取SR-EPS，對(duì)上述工藝SR-EPS得率、總糖含量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 SR-EPS的分子量分布

由圖5可知，SR-EPS洗脫出的峰主要分布在7～22 min之間，將SR-EPS測(cè)得的3個(gè)峰的保留時(shí)間代入由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的回歸方程中，計(jì)算得到SR-EPS的分子量分布，見(jiàn)表2。

由表2中峰面積大小可知，第二個(gè)組分（峰號(hào)2）的占比較其他兩個(gè)組分更高，為80.58%，說(shuō)明該組分可能是構(gòu)成SR-EPS的最主要組分，這也為后續(xù)的進(jìn)一步純化提供了思路。綜上所述，嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)胞外多糖分子量分布呈現(xiàn)多峰結(jié)構(gòu)，所形成的SR-EPS胞外多糖組成成分較復(fù)雜，為雜多糖。

2.3 SR-EPS的FT-IR分析

由圖6可知，在3 400 cm-1左右出現(xiàn)由—OH的拉伸振動(dòng)引起的吸收峰，在2 900 cm-1左右出現(xiàn)由C—H拉伸振動(dòng)引起的吸收峰，由此可綜合判斷SR-EPS為糖類(lèi)化合物[23]；此外，在1 730 cm-1附近有一個(gè)弱吸收峰，可判斷為—COOH伸縮振動(dòng)信號(hào)峰，表明SR-EPS含有糖醛酸[24]；在1 640，1 420 cm-1左右分別出現(xiàn)由C—O彎曲振動(dòng)和C—H彎曲振動(dòng)引起的吸收峰，可判斷為多糖的紅外特征吸收峰[25]；在1 240 cm-1左右出現(xiàn)由—OH的彎曲振動(dòng)引起的吸收峰以及800～900 cm-1含有的α和β構(gòu)型糖苷鍵共同構(gòu)成多糖物質(zhì)的特征峰圖[26-28]；此外，lt;1 000 cm-1出現(xiàn)的峰形常被認(rèn)為是構(gòu)成多糖類(lèi)物質(zhì)的指紋圖譜，依托指紋圖譜能對(duì)多糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單區(qū)分。綜上可知，SR-EPS是一種典型的酸性胞外多糖。

2.4 SR-EPS的單糖組成分析

9種單糖和4種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖見(jiàn)圖7。

由圖8可知，SR-EPS主要由巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）6種單糖以及半乳糖醛酸（Gal-UA）和葡萄糖醛酸（Glc-UA）2種糖醛酸組成，8種組分物質(zhì)的量的比值為Fuc∶Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Man∶Gal-UA∶Glc-UA為0.71∶9.55∶7.46∶11.64∶27.66∶38.41∶1.52∶3.04，這也進(jìn)一步說(shuō)明SR-EPS是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主的酸性雜多糖。

2.5 SR-EPS表觀結(jié)構(gòu)分析

利用SEM對(duì)SR-EPS的表觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖9。SR-EPS呈顆粒堆疊狀，堆疊顆粒呈現(xiàn)緊密且有規(guī)則排列狀態(tài)。

2.6 SR-EPS體外抗氧化活性分析

2.6.1 SR-EPS對(duì)ABTS自由基的清除能力

由圖10可知，陽(yáng)性對(duì)照VC表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化能力，當(dāng)VC濃度為0.125～4.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+·的清除率保持在較高水平。而SR-EPS濃度在0.125～4.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)ABTS+·的清除率與其濃度呈正相關(guān)；當(dāng)SR-EPS濃度超過(guò)0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率顯著上升（Plt;0.05）；當(dāng)SR-EPS濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)到最高值，為37.81%。

2.6.2 SR-EPS對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖11可知，在0.125～4.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH自由基的清除率基本保持在89%以上，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化能力。SR-EPS對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，即在0.125～4.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率表現(xiàn)出隨濃度增加而上升的趨勢(shì)；但是，從上升趨勢(shì)可以看出，當(dāng)SR-EPS濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率顯著提高（Plt;0.05）；當(dāng)SR-EPS濃度提升至4.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大值?？傊?，SR-EPS對(duì)DPPH自由基的清除能力與其對(duì)ABTS自由基的清除能力保持相對(duì)一致性[29]。

2.6.3 SR-EPS對(duì)羥基自由基的清除能力

由圖12可知，在0.125～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)羥基自由基的清除率呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（Plt;0.05），而當(dāng)VC濃度在2.0～4.0 mg/mL之間，對(duì)羥基自由基的清除率并沒(méi)有因VC濃度的增加而表現(xiàn)出顯著提升（P＞0.05）。SR-EPS在0.125，0.25 mg/mL較低濃度時(shí)表現(xiàn)出極低的羥基自由基清除率，然而，當(dāng)SR-EPS濃度范圍調(diào)整到0.5～4.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率顯著上升（Plt;0.05），同時(shí)也體現(xiàn)出清除率與多糖濃度的劑量依賴(lài)關(guān)系。

2.6.4 SR-EPS對(duì)鐵離子螯合能力的影響

由圖13可知，在0.125～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，EDTA對(duì)鐵離子的螯合能力呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（Plt;0.05），然而，當(dāng)EDTA濃度大于0.5 mg/mL后，EDTA對(duì)鐵離子的螯合能力并未進(jìn)一步顯著提升（P＞0.05）。當(dāng)EDTA濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，SR-EPS濃度改變對(duì)鐵離子螯合能力的影響不顯著（P＞0.05）；但是，當(dāng)SR-EPS濃度范圍在1.0～2.0 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到了平穩(wěn)增長(zhǎng)期；當(dāng)SR-EPS濃度提升至4.0 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到最大值，為20.5%。

由上述結(jié)果可知，SR-EPS作為一種新型的由嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)生的胞外多糖，具有較高的得率，相對(duì)容易獲取。SR-EPS的基本成分并不復(fù)雜，且由SR-EPS的分子量分布可知，該胞外多糖共包括3個(gè)主要組分，其中組分2因其較高的響應(yīng)值被認(rèn)為是SR-EPS的重要組成成分，也為后續(xù)對(duì)SR-EPS雜多糖的進(jìn)一步分離、純化提供了方便和可能。在抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn)，SR-EPS具有一定的體外抗氧化活性，這為其后續(xù)用于功能食品的深入開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。其抗氧化能力可能與多糖中含羥基等官能團(tuán)密切相關(guān)[30]；SR-EPS對(duì)ABTS自由基、DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均與糖濃度保持劑量依賴(lài)關(guān)系，總體呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究利用嗜熱鏈球菌對(duì)貴州遵義特產(chǎn)二荊條辣椒進(jìn)行純種發(fā)酵，并以此為基礎(chǔ)采用水提醇沉法對(duì)發(fā)酵液中的胞外多糖進(jìn)行提取制備后得到SR-EPS。通過(guò)對(duì)SR-EPS得率計(jì)算，嗜熱鏈球菌發(fā)酵辣椒所得胞外多糖的產(chǎn)量較高。SR-EPS是一種含糖量較高、蛋白質(zhì)含量較少的酸性雜多糖，其主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成。作為一種易獲取且產(chǎn)量高的粗制雜多糖，其在抗氧化能力和鐵離子螯合能力方面的表現(xiàn)較良好，在今后會(huì)繼續(xù)對(duì)SR-EPS進(jìn)行再分離和再純化以提升其在活性和功能上的表現(xiàn)力。綜上，本文可為了解乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)生的胞外多糖的抗氧化作用的表現(xiàn)提供參考，也為胞外多糖結(jié)構(gòu)有序性理論提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為乳酸菌胞外多糖在功能性食品中的研發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓雪冰，元香南，方俊，等.乳酸菌維持動(dòng)物腸道健康的研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2023，53（4）：464-479.

[2]都玉蓉.Weissella cibaria D-2-EPS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2022.

[3]譚鳳翔，余元善，溫靖，等.乳酸菌胞外多糖的合成、生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2023，42（9）：7-13.

[4]李夢(mèng)媛.乳酸菌胞外多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[5]程雅韻.不同腸膜明串珠菌菌株發(fā)酵對(duì)四川泡菜D-/L-乳酸含量及品質(zhì)的影響[D].延吉：延邊大學(xué)，2017.

[6]黃承敏.植物乳桿菌Y-20的分離鑒定及其所產(chǎn)胞外多糖的抗氧化作用研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[7]徐清萍，郭苗苗，唐百芬，等.嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌單獨(dú)發(fā)酵對(duì)菊芋泡菜的影響[J].中國(guó)調(diào)味品，2020，45（9）：48-54.

[8]王進(jìn).乳酸菌在發(fā)酵紅薯飲料中的應(yīng)用及工藝研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2020.

[9]王彤.嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁的工藝及其對(duì)小鼠慢性肝損傷保護(hù)作用的研究[D].銀川：寧夏大學(xué)，2021.

[10]劉賀，彭聲靜，瑜瑜，等.應(yīng)用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵薄荷抗氧化功能研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2021（5）：21-25.

[11]徐小輕.食源性干酪乳桿菌NA-2抑菌特性及其胞外多糖功效研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2021.

[12]喬少婷，解敏，代安娜爾，等.嗜熱鏈球菌MGB80-7所產(chǎn)胞外多糖的表型結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2022，49（7）：2686-2699.

[13]刁山山，張雨，馮浩，等.亞臨界水提取南瓜皮多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化能力[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2023，44（23）：90-98.

[14]阮文靜，趙耀鑫，周捷，等.神農(nóng)香菊莖葉廢棄物中多糖與總黃酮的含量測(cè)定和抗氧化活性研究[J].武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，39（4）：9-14.

[15]劉慧香，李啟艷，牛水蛟，等.分光光度法測(cè)定玉竹藥材中多糖[J].化學(xué)分析計(jì)量，2023，32（1）：17-20.

[16]姜惠萍，劉萬(wàn)順，宋福來(lái)，等.改良考馬斯亮藍(lán)試劑法測(cè)定殼聚糖及其衍生物中蛋白質(zhì)含量[J].現(xiàn)代食品，2022，28（17）：173-178.

[17]郭利娟，劉愛(ài)娟，孫興霞.硫酸解交聯(lián)-考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)的含量[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2022，58（2）：148-151.

[18]楊兵.拐棗多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)解析及其降血糖活性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2021.

[19]陳麗葉，常希光，馮曉光，等.山藥多糖的體外抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2021，42（19）：122-128.

[20]董偉，馬生健，馬文欣，等.涼粉草多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化活性[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2023，44（9）：52-58.

[21]曹磊，劉偉，王俊龍，等.硫酸化制備圓苞車(chē)前子低黏多糖及其結(jié)構(gòu)表征和抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2024，36（1）：26-36.

[22]李淑敏，何瑞娟，任寶旗，等.不同提取工藝對(duì)生姜渣中多糖結(jié)構(gòu)的影響及其抗氧化活性分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2023，48（10）：113-116.

[23]熊雙麗，李安林.酸性多糖的最新研究進(jìn)展[J].食品科技，2010，35（5）：80-83.

[24]SU Y， LI L. Structural characterization and antioxidant activity of polysaccharide from four auriculariales[J].Carbohydrate Polymers，2020，229：115407.

[25]郭南生，江和棟，張兵，等.三葉青根多糖提取工藝優(yōu)化、分離純化及結(jié)構(gòu)表征[J].食品與機(jī)械，2018，34（7）：143-147，210.

[26]JIANG W， HU Y， ZHU Z Y. Structural characteristics of polysaccharide from Zingiber striolatum and its effects on gut microbiota composition in obese mice[J].Frontiers in Nutrition，2022，9：1012030.

[27]朱彩平.枸杞多糖的結(jié)構(gòu)分析及生物活性評(píng)價(jià)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[28]韋勇，李世源，劉玉申.辣椒多糖的提取及組成、分子量分布的測(cè)定[J].中國(guó)食品添加劑，2015，138（8）：159-164.

[29]LUO Q L， TANG Z H， ZHANG X F， et al.Chemical properties and antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide from Dendrobium officinale[J].International Journal of Biological Macromolecules，2016，89：219-227.

[30]馬廣強(qiáng)，李國(guó)群，吳靜，等.白蓮蓮房多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化與免疫活性[J].食品與機(jī)械，2021，37（5）：156-162.