收稿日期：2023-09-13

基金項(xiàng)目：江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目[JBGS（2021）018]

作者簡(jiǎn)介：婁麗娜（1982-），女，河南濮陽(yáng)人，博士，研究員，主要從事瓜類作物遺傳育種研究。（Tel）025-84391221；（E-mail）linabeibei@163.com

通訊作者：徐錦華，（Tel） 025-84390264;（E-mail）jinhuaxu@jaas.ac.cn

摘要： 為明確課題組從地方收集的黃瓜黃綠葉色突變體中黃綠葉色突變基因，本研究利用綠葉（野生型）與黃綠葉色（突變體）黃瓜材料為親本，配制正反雜交一代及二代分離群體，在分析黃綠葉色突變基因遺傳規(guī)律的基礎(chǔ)上，利用BSA-seq技術(shù)對(duì)雙親及F2代葉色極端混池進(jìn)行測(cè)序，篩選黃瓜黃綠葉色突變性狀的關(guān)聯(lián)標(biāo)記及候選基因。結(jié)果表明，綠葉色對(duì)黃綠葉色為完全顯性，黃綠葉色突變基因?yàn)殡[性基因。突變性狀關(guān)聯(lián)分析（SNP-index檢測(cè)）得到1個(gè)與黃綠葉色突變相關(guān)的候選區(qū)域，位于黃瓜1號(hào)染色體上，總長(zhǎng)度18 484 bp。該候選區(qū)域共有118個(gè)與黃綠葉色突變相關(guān)的SNP位點(diǎn)；候選區(qū)域共注釋到3個(gè)基因，其中CsaV3_1G032820基因?yàn)辄S瓜黃綠葉色突變最可能相關(guān)基因。本研究結(jié)果可為黃瓜黃綠葉色突變基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 黃瓜；黃綠葉色突變體；BSA-seq；基因定位

中圖分類號(hào)： S642.2"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 000-4440（2024）09-1711-08

Mapping of cucumber virescent yellow leaf mutant gene based on BSA-seq technology

LOU Lina， YANG Xingping， ZHU Lingli， YAO Xiefeng， XU Jian， ZHANG Man， LIU Guang， HOU Qian， LIU Jinqiu， XU Jinhua

（Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China）

Abstract： In order to clarify the virescent yellow leaf mutant gene in cucumber virescent yellow leaf mutant collected by the research group from the local area， this study used green leaf （wild type） and virescent yellow leaf （mutant） cucumber materials as parents to prepare a reciprocal hybrid generation and a second generation separation population. On the basis of analyzing the genetic law of virescent yellow leaf mutant genes， BSA-seq technology was used to sequence the extreme mixing pools of parents and F2 generations， and to screen the associated markers and candidate genes of cucumber virescent yellow leaf mutant traits. The results showed that the green leaf color was completely dominant to virescent yellow leaf color， and the virescent yellow leaf color mutant gene was a recessive gene. A candidate region associated with virescent yellow leaf color mutation was obtained by SNP-index detection， which was located on chromosome "of cucumber， with a total length of 8 484 bp. A total of 18 SNP loci associated with virescent yellow leaf color mutation were found in this candidate region. Three genes were annotated in the candidate region， among which CsaV3_1G032820 gene was the most likely related gene of cucumber virescent yellow leaf color mutation. The results of this study can provide a basis for cucumber virescent yellow leaf color mutant gene cloning and molecular marker-assisted breeding.

Key words： cucumber;virescent yellow leaf mutant;BSA-seq;gene mapping

植物表型性狀受基因型和生長(zhǎng)環(huán)境共同制約[1]。植物生長(zhǎng)過(guò)程中，外部環(huán)境因素和人工誘變措施均可導(dǎo)致植物基因的突變。其中，葉色突變體是研究植物葉綠素合成與代謝等過(guò)程的優(yōu)良材料[2]， 同時(shí)由于葉色容易識(shí)別，因此可以將其作為標(biāo)記性狀用于鑒定轉(zhuǎn)育雜交種的純度，提高良種繁育效率[3]。黃瓜是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜。近年來(lái)，中國(guó)的黃瓜種植面積約為1.0×10 5 hm 2，年產(chǎn)量約在6.0×10 6 t。隨著生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品提出了更高的需求。因此，加強(qiáng)黃瓜葉色突變體的研究有助于提高黃瓜良種繁育水平，更好地滿足人民不斷提高的優(yōu)質(zhì)生活需求。

在擬南芥[4-5]、水稻[6]、番茄[7]、煙草[8]、甘藍(lán)型油菜[9]等作物葉色突變體的突變基因定位、克隆和利用等方面已有較多研究。在黃瓜葉色突變體的研究方面亦有初步開展，目前已有18個(gè)黃瓜葉色突變基因得到報(bào)道，包括 2個(gè)黃葉類型基因（yp、yl）、4個(gè)致死型基因（al、cd、gc、p）及12個(gè)轉(zhuǎn)綠型基因（g、yc-1、yc-2、ygl、lg-1、lg-2、v、v-1、v-2、vvi、vyl， yyl-1）[10-12]?；趫D位克隆技術(shù)，目前有7個(gè)葉色突變體的突變基因得到了克隆。Miao等[13]利用黃瓜葉色突變體9110gt 鑒定出黃轉(zhuǎn)綠表型突變體v-1的突變基因定位于6號(hào)染色體，并預(yù)測(cè)CsaCNGCs 為候選基因，其編碼1種環(huán)核苷酸通道蛋白；Gao等[10]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致黃綠葉色突變體C528葉綠素a含量降低的基因是染色體6上的鎂離子螯合酶基因CsChlI，其第3個(gè)外顯子發(fā)生單核苷酸突變，堿基由G突變?yōu)锳，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)編碼位置的甘氨酸變?yōu)榫彼帷ong等[14]鑒定了1個(gè)葉片黃轉(zhuǎn)綠表型vyl突變體，突變基因定位于染色體4，最可能的候選基因?yàn)镃sa4G637110；Ding 等[15] 報(bào)道轉(zhuǎn)綠型ygl突變體是串聯(lián)13脂氧合酶（13-LOX）基因在一個(gè)簇中的突變導(dǎo)致的；Hu等[16]研究結(jié)果表示yyl-1突變體的形成是由于CsHD基因中編碼組氨酸和天冬氨酸結(jié)構(gòu)域的堿基突變導(dǎo)致的；Zhang等[11]鑒定了1個(gè)葉片黃轉(zhuǎn)綠表型突變體v-2，突變基因定位于染色體3上36.0～39.7 Mb區(qū)間內(nèi)，候選基因?yàn)镃sa3G890020，編碼的蛋白質(zhì)為生長(zhǎng)素F-box蛋白；Zha等[12] 通過(guò)EMS誘變鑒定到1個(gè)黃色葉片突變體（yl），通過(guò)BSA-seq及圖位克隆技術(shù)，明確突變基因定位于3號(hào)染色體7 474～7 573 kb的區(qū)間內(nèi)，連鎖分析及等位基因檢測(cè)與驗(yàn)證了突變體CsaV3_3G009150中的候選SNP（cpFtsY）與編碼擬南芥葉綠體信號(hào)識(shí)別粒子基因（cpSRP）受體同源，為黃葉表型突變體yl的候選基因。

課題組從地方收集的材料中得到1株黃綠葉色突變體，經(jīng)過(guò)多代自交純化后，發(fā)現(xiàn)突變體葉色可穩(wěn)定遺傳。本研究利用該突變體與其野生型作為親本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F1及F2代群體，在F2群體中，選擇葉色極端綠色及黃綠色單株構(gòu)建兩個(gè)不同葉色的基因池，通過(guò)對(duì)雙親及兩個(gè)基因池的BSA-seq全基因組重測(cè)序分析，初步篩選調(diào)控黃瓜葉片黃綠突變基因的候選區(qū)域，并對(duì)候選區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，明確調(diào)控黃瓜黃綠葉色突變的候選基因。本研究結(jié)果將對(duì)挖掘黃瓜葉色突變基因功能，探索葉色突變調(diào)控機(jī)制，加快分子標(biāo)記輔助育種有重要意義和價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料及表型觀測(cè)

黃瓜材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集的地方品種，經(jīng)多代自交純化后得到的高代自交系 GR-89及其葉色突變體GR-89-1。為確保葉色突變體性狀的穩(wěn)定性，對(duì)突變體材料又進(jìn)行了4代的自交純化，發(fā)現(xiàn)其葉色可穩(wěn)定遺傳，因此于2022年春季配置突變體與野生型株系的正反雜交一代（F1），2022年秋季，雜交一代自交得雜交二代（F2），2023年春季，雙親、正反F1以及F2群體，種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)基地。其中，F(xiàn)2群體共種植154株。采用目視觀察的方法記載各世代群體單株的葉色表型情況，通過(guò)卡方（χ 2）檢驗(yàn)法驗(yàn)證葉色突變體是否符合隱性基因的遺傳規(guī)律。

1.2 試驗(yàn)方法

在F2群體中選取幼苗期葉片黃化突變株和綠色正常株各20株，采集突變株和正常株頂端幼嫩葉片，使用DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行DNA提取，并使用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)（美國(guó) Thermo Scientific公司產(chǎn)品）測(cè)定DNA濃度。將黃化株20份DNA和綠色株20份DNA分別等量混合，構(gòu)建黃化葉和綠色葉后代極端混池，親本樣品提取DNA后，送北京組學(xué)生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后，用超聲波將DNA片段化，然后對(duì)片段化的DNA進(jìn)行純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭，接著用濃度3%～4%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA片段進(jìn)行大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，質(zhì)量檢驗(yàn)合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)分析的主要流程如下：（1）將下機(jī)得到的原始數(shù)據(jù)（Raw data）通過(guò)質(zhì)量控制過(guò)濾得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Clean data）；（2）再利用BWA軟件[17]將Clean data 比對(duì)到黃瓜（Chinese long）參考基因組Genome V3（http：//cucurbit genomics.org/organism/20）上；（3）根據(jù)比對(duì)結(jié)果，使用GATK[18]和ANNOVAR[19]等軟件進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）、短插入缺失標(biāo)記（Small InDel）的檢測(cè)及注釋， 利用綠葉混池與黃綠葉混池的基因型頻率差異（SNP-index）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[20-21]，以99%的置信區(qū)間確定基因突變位點(diǎn)的候選區(qū)域;（4）利用Blast軟件[22]篩選候選基因，利用NR（NCBI non-redundant protein sequences）、Swiss-Prot（a manually annotated and reviewed protein sequence database）、COG（Clusters of orthologous groups of proteins）、GO（Gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）等數(shù)據(jù)庫(kù)[23-26]對(duì)候選區(qū)域進(jìn)行候選區(qū)域的編碼基因深度注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜葉色黃綠突變體基因的遺傳分析

田間表型調(diào)查結(jié)果顯示，黃瓜黃綠突變體與野生型的葉色存在顯著差異。從苗期到成株期，突變體呈現(xiàn)出新葉黃色，下部葉片逐漸恢復(fù)為黃綠色的變化特征（圖1A）， 而野生型的葉片顏色始終為正常綠色（圖1B），正交F1 植株（突變體×野生型） 與反交F1植株 （野生型×突變體） 的新葉始終表現(xiàn)為綠色（圖1C、圖1D）。而154株F2群體中，有119株綠葉單株（圖1E）和35株新葉黃色、下部葉片綠色的突變植株（圖1F～圖1J）。突變植株中，有10株幼苗期出現(xiàn)葉色黃化、植株矮小、瘦弱并最終死亡。成活144株F2植株定植于大棚后，有少量突變體的新葉呈現(xiàn)出比黃綠葉色突變親本更黃的顏色。定植后的植株在生長(zhǎng)過(guò)程中，有部分F2綠葉植株和黃綠葉色突變植株呈現(xiàn)出生長(zhǎng)較慢，植株高度矮于其他植株的現(xiàn)象。通過(guò)雙親和正反F1的葉色表型可以判定，葉色黃綠突變基因?yàn)殡[性基因。對(duì)F2群體綠葉植株119株，黃綠葉植株35株進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，χ 2 為0.42，低于χ 20.05（3.841），說(shuō)明本研究得到的葉色黃綠突變性狀受隱性基因控制，F(xiàn)2群體葉色性狀分離比滿足3∶1的規(guī)律。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

雙親及極端混池樣本測(cè)序結(jié)果過(guò)濾后共獲得堿基對(duì)23.24 Gbp，G+C堿基含量在35.47%～37.03%，Q20均在96%以上，Q30均在90%以上（表1），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到黃瓜參考基因組V3上的比對(duì)效率為96.49%～97.61%；基因組覆蓋深度為8～15 X，平均覆蓋深度為11 X，1 X覆蓋率均超過(guò)98%。插入片段大小符合正態(tài)分布（表1、圖2）。 上述結(jié)果說(shuō)明樣品測(cè)序正常，隨機(jī)性較好，構(gòu)建的文庫(kù)可進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析。

2.3 SNP和Small InDel檢測(cè)和注釋

雙親及極端混池的SNP 和Small InDel注釋結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，雙親共獲得405 934個(gè)SNP位點(diǎn)和118 473個(gè)Small InDel位點(diǎn)；混池共獲得453 248個(gè)SNP位點(diǎn)和131 665個(gè)Small InDel位點(diǎn)；非同義突變的SNP位點(diǎn)共17 908個(gè)（表2）。SNP位點(diǎn)分布在基因上游、基因下游、基因間區(qū)、內(nèi)含子等12個(gè)已知區(qū)域；Small InDel 位點(diǎn)分布在14個(gè)區(qū)域，其中基因間區(qū)、內(nèi)含子、基因上游和基因下游分布較多。

2.4 黃瓜黃綠葉色突變性狀關(guān)聯(lián)分析及候選基因注釋

本試驗(yàn)得到1個(gè)連鎖區(qū)域，位于黃瓜1號(hào)染色體19 878 470～19 896 953 bp區(qū)間，全長(zhǎng)18 484 bp（圖3）。在該區(qū)域共鑒定到118個(gè)SNP突變位點(diǎn)，主要發(fā)生在基因間區(qū)、內(nèi)含子、基因上游和基因下游。此外，外顯子區(qū)和3′非編碼區(qū)（UTR3）各有1個(gè)SNP突變位點(diǎn)，其中，外顯子區(qū)的突變類型為同義突變（表3）。

基于多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的編碼基因進(jìn)行深度功能注釋后，經(jīng)過(guò)比對(duì)得到3個(gè)與變異相關(guān)的候選基因，CsaV3_1G032810、CsaV3_1G032820及CsaV3_1G032830。CsaV3_1G032810屬于未知蛋白，CsaV3_1G032820為含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，CsaV3_1G032830注釋為真核細(xì)胞翻譯起始因子4E。其中，CsaV3_1G032820基因在整個(gè)區(qū)域均被注釋到，為黃瓜黃綠葉色突變最可能相關(guān)基因（表3）。

3 討論

葉色突變是植物中普遍存在且易于被鑒別的突變，葉色突變體已成為研究葉綠素合成和代謝等生理過(guò)程的優(yōu)良材料[27]。葉色突變體在植物種子純化方面有著廣泛的用途，利用隱性葉色突變性狀進(jìn)行篩選，不但高效，而且可有效避免其他基因的干擾。例如在辣椒育種中，利用葉色突變體作為特定標(biāo)記，插入到雜交親本中，在制種過(guò)程中可利用該標(biāo)記，排除親本的自交后代，從而簡(jiǎn)化制種程序，降低制種成本[28]。本試驗(yàn)利用BSA-seq方法挖掘黃瓜黃綠葉色突變相關(guān)候選基因，通過(guò)對(duì)野生型和突變體及F2群體中極端單株進(jìn)行混池測(cè)序，最終將候選基因定位到黃瓜1號(hào)染色體19 878 470～19 896 953 bp處，總長(zhǎng)度為18 484 bp。候選區(qū)域內(nèi)共檢測(cè)到118個(gè)SNP突變位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)NR、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋后，共得到3個(gè)基因，其中CsaV3_1G032820基因?yàn)辄S瓜黃綠葉色突變體最可能相關(guān)基因，其注釋信息為含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。

目前發(fā)現(xiàn)的葉色突變體遺傳機(jī)制大多為單基因隱性細(xì)胞核遺傳，但也存在少數(shù)葉色突變體受到顯性基因的控制，突變性狀相對(duì)于正常性狀表現(xiàn)為完全顯性或不完全顯性。張澤民等[29]篩選出1個(gè)T-DNA插入的由1對(duì)顯性基因控制的水稻白化苗突變體；房賢濤等[30]發(fā)現(xiàn)1個(gè)顯性基因調(diào)控的水稻葉色突變體，屬于白化轉(zhuǎn)綠的突變類型；Smith[31]篩選出一個(gè)由顯性基因控制的小麥葉綠素缺乏突變體。

曹莉[32]發(fā)現(xiàn)的小麥高代自發(fā)黃化突變體屬于不完全顯性基因細(xì)胞核遺傳，安旭堯[33]研究發(fā)現(xiàn)，小麥黃綠葉色突變體F2代分離比約為1∶2∶1，也屬于不完全顯性遺傳。目前對(duì)黃瓜葉色突變體的研究發(fā)現(xiàn)控制黃瓜葉色突變的基因大多為隱性單基因[10-16]。通過(guò)雙親和F1代的表型性狀，能確定本研究發(fā)現(xiàn)的黃瓜黃綠葉色突變基因?yàn)殡[性基因。通過(guò)F2代表型分離比，按照單性狀分離比（3∶1）進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，起初發(fā)現(xiàn)其不符合一對(duì)隱性基因控制的孟德爾遺傳規(guī)律，原因是在幼苗期有10株黃綠色突變株出現(xiàn)了植株矮小、瘦弱且死亡的現(xiàn)象，當(dāng)排除這10株進(jìn)行卡方檢驗(yàn)時(shí)，其不符合卡方檢驗(yàn)，但當(dāng)將這些死亡的黃綠突變株考慮進(jìn)去，則符合卡方檢驗(yàn)，符合一對(duì)隱性基因控制的孟德爾遺傳規(guī)律。

前人已經(jīng)克隆的黃瓜葉色突變基因定位于染色體3號(hào)[11-12]、染色體4號(hào)[14]和染色體6號(hào)[10，13]，而本研究得到的黃瓜黃綠葉色突變基因定位于染色體1號(hào)，這與前人的報(bào)道結(jié)果不同。以往研究中發(fā)現(xiàn)不同的基因突變均能引起葉片顏色變化，說(shuō)明引起黃瓜葉片顏色變化的機(jī)制可能是多方面的。本研究篩選的與黃瓜黃綠葉色突變相關(guān)的候選基因編碼的蛋白質(zhì)為含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。擬南芥SH3蛋白家族包含SH3P1、SH3P2、SH3P3等3個(gè)同源蛋白，3者均含有1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，其中SH3P1和SH3P3可以在細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程中發(fā)揮作用，而SH3P2在細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[34-36]。本研究發(fā)現(xiàn)的黃瓜黃綠葉色突變候選基因，如何調(diào)控葉色變化還有待進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。后續(xù)將繼續(xù)開展候選基因克隆及功能分析，并開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，深入揭示黃瓜黃綠葉色突變的分子機(jī)制，促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種。

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（責(zé)任編輯：石春林）