摘要：隨著人參種植年限的增加，土壤中自毒物質(zhì)的積累會導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生，極大地影響人參種植業(yè)的健康發(fā)展。生物降解土壤中自毒物質(zhì)是緩解連作障礙的有效途徑。以酚酸類自毒物質(zhì)為篩選指標(biāo)，從人參根際土壤中分離、篩選酚酸類自毒物質(zhì)降解細(xì)菌，結(jié)合16S rRNA基因測序及生理生化試驗對降解菌株進(jìn)行分類鑒定，采用紫外分光光度法測定其降解能力，并進(jìn)一步采用單因素試驗對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用降解菌對酚酸脅迫下的人參種子進(jìn)行生防研究。結(jié)果表明，從人參根際土壤中分離出10株自毒物質(zhì)降解菌，以假單胞菌屬（Pseudomonas）為主。初步降解試驗顯示菌株S1對水楊酸的降解率最高，達(dá)65.32%，經(jīng)鑒定該菌株為伯克霍爾德屬（Burkholderia）細(xì)菌。單因素試驗結(jié)果表明，以硝酸鈣作為氮源，培養(yǎng)溫度30 ℃，500 mg·L?1自毒物質(zhì)下，菌株S1的降解率達(dá)88.58%，較優(yōu)化前明顯提升。生防試驗結(jié)果表明，菌株S1可緩解水楊酸對人參種子生長的抑制作用，促生效率達(dá)12.56%。綜上所述，從土壤中分離出可降解水楊酸的伯克霍爾德屬菌株S1具有較好的生防效果，對于解決連作障礙問題具有潛在生防應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：酚酸降解菌；自毒物質(zhì)；人參；連作障礙；條件優(yōu)化

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0651

中圖分類號：S47 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008?0864（2024）07?0147?09

五加科多年生植物人參（Panax ginseng C. A.Meyer）屬名貴中藥材，具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價值[1?2]。人參在種植過程中存在嚴(yán)重的連作障礙現(xiàn)象，采收后10～20年內(nèi)不能再次栽種，否則會出現(xiàn)燒須、爛根、病害多發(fā)、產(chǎn)量降低等，嚴(yán)重制約人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。導(dǎo)致連作障礙的原因主要是土壤理化性質(zhì)的改變、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡和自毒物質(zhì)的積累，其中自毒物質(zhì)被視為連作障礙的主要誘因[3]。人參在生長過程中，枯枝殘葉和根系分泌產(chǎn)生的自毒物質(zhì)極易在土壤中積累，并產(chǎn)生化感作用，從而抑制種子萌發(fā)、破壞根系或其他分生組織，影響植物、土壤和微生物之間的相互作用，導(dǎo)致植物產(chǎn)生連作障礙[4?5]。李自博[6]從人參根際土壤中共收集鑒定出水楊酸、沒食子酸、苯甲酸、3-苯基丙酸和肉桂酸5種酚酸物質(zhì)，被證明是人參連作障礙中根系分泌的主要化感物質(zhì)，其中水楊酸含量最高，為0.519 mmol·L?1。He等[7]從西洋參土壤中分離出9種酚酸類化合物，土壤中約含1 200 mg·kg?1酚酸物質(zhì)。本課題組前期在林下連作種植參根際土壤中檢測出苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸共8種酚酸類自毒物質(zhì)[8]。

目前，解決連作障礙的主要防治手段是化學(xué)防治，依靠農(nóng)藥進(jìn)行土壤消毒。該方法存在化學(xué)藥劑毒性高、殘留超標(biāo)等問題，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境安全[9]。因此，生物防治成了解決連作障礙的突破點。國內(nèi)對于藥用植物自毒物質(zhì)降解的研究主要集中在三七上，向維等[10]從三七根際土壤中成功分離出8株自毒物質(zhì)降解細(xì)菌，其中編號SC3 的寡養(yǎng)單胞菌屬菌株具有消除連作土壤中皂苷類自毒物質(zhì)的潛力；王羅濤等[11]發(fā)現(xiàn)，蒙氏假單胞菌PM-41 既能有效降解三七皂苷類自毒物質(zhì)，又能有效拮抗三七銹腐病菌毀滅柱孢菌。在其他作物如花生（Arachis hypogaea L.）[12]、番茄（Solanum lycopersicum L.）[12]等中也發(fā)現(xiàn)有降解菌。毛寧等[14]發(fā)現(xiàn)了4 株對對羥基苯甲酸有明顯降解作用的放線菌，可有效降低草莓的死亡率和發(fā)病率。肖蓉等[15]發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）能有效緩解羥基苯甲酸對黃瓜生長的抑制作用。但目前篩選得到的具有降解人參自毒物質(zhì)功能菌的數(shù)量有限，且對于降解水楊酸等在土壤中積累含量較多的酚酸類自毒物質(zhì)的降解菌研究還不夠透徹，其菌種資源有待進(jìn)一步開發(fā)。

本研究根據(jù)前期試驗結(jié)果[8]，以土壤中檢測到的苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸8種酚酸類自毒物質(zhì)作為研究目標(biāo)，以人參連作土壤為材料，篩選具有降解能力的微生物菌株，確定降解菌的系統(tǒng)分類學(xué)地位，并優(yōu)化高效降解菌的培養(yǎng)條件，考察自毒物質(zhì)對人參種子的抑制作用及其高效降解菌的解毒能力，為綠色菌肥的研發(fā)應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤

供試土壤采自吉林省臨江市螞蟻河鄉(xiāng)三棚湖村（41°51′02.80\"N，127°6′21.81\"E，海拔833 m），采用五點采樣法，所選區(qū)域去表層10 cm土后，采集人參根際土并混勻。

1.1.2 供試種子

供試的人參種子購買于遼寧省沈陽市長白山參鄉(xiāng)產(chǎn)地，品種為長白山人參。選取顆粒飽滿、大小一致、無機械損傷的種粒備用。

1.1.3 主要試劑和儀器

水楊酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、沒食子酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、瓊脂粉購自上海麥克林生化科技有限公司。CaCl2、K2HPO4、（NH4）2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O購自廣東光華科技股份有限公司。生理生化試劑盒及草酸銨結(jié)晶紫染液、草酸銨、盧戈氏碘液、沙黃復(fù)染液、對二甲基氨基苯甲醛、體積分?jǐn)?shù)為95%酒精、濃鹽酸、甲基紅、質(zhì)量濃度為40%的KOH 溶液、體積分?jǐn)?shù)為6%的α?奈酚酒精溶液、對氨基苯磺酸、α?萘胺、乙酸購自杭州微生物試劑有限公司。試驗所需培養(yǎng)基及其配方如表1所示。

主要儀器包括ZHJH-C1106B 型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）、G154DP型全自動立式高壓滅菌鍋[致微（廈門）儀器有限公司]、SP-1920紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解菌分離篩選及分子鑒定

分別稱取3個采樣點各10 g土壤樣品混合，加入90 mL無菌水，置于恒溫?fù)u床（220 r·min?1，28 ℃）振蕩過夜。分別在100、500和1 000 mg·L?1 酚酸作為單一碳源的篩選培養(yǎng)基中加入5 mL 土壤懸液，28 ℃、220 r·min?1 搖床培養(yǎng)3 d，連續(xù)培養(yǎng)3 個周期共9 d，接種量為2%。富集培養(yǎng)的菌液進(jìn)行梯度稀釋（10?3、10?4、10?5），涂布于篩選培養(yǎng)基（酚酸物質(zhì)1 000 mg·L?1）固體平板上，在分離篩選過程中設(shè)置空白組對照。挑選在以酚酸作為單一碳源的培養(yǎng)基上生長，而在其他培養(yǎng)條件相同卻無酚酸的培養(yǎng)基上不生長的菌株，初步確定為具有降解能力的降解菌株。反復(fù)劃線以得到菌株純培養(yǎng)物，純化后的單菌落收集于30%甘油中，置于?20 ℃冰箱保存。

形態(tài)學(xué)觀察：將降解菌株在LB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色及透明度等特征。降解菌株的生理生化反應(yīng)測定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[17]。

基因測序：超凈臺收集單菌落于1.5 mL離心管中，然后加入100 μL 10% 的Chelex-100 溶液，提取DNA。以基因組DNA 為模板，使用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因片段。使用通用引物Eu-27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和Eu-1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）分別擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列。PCR體系50 μL，包含 DNA模板2 μL、2×Taq Mastr Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR程序： 95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)；72 ℃充分延伸2 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行序列比對。用MEGA 6.0中的neighbor-joining算法（自展數(shù)為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 降解菌降解能力測定

采用紫外分光光度計測定降解率，設(shè)置0～640 mg·L?1 酚酸等梯度含量，以酚酸含量為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。種子液在搖床（28 ℃，220 r·min?1）培養(yǎng)3 d后，放入50 mL離心管10 000 r·min?1離心10 min，棄上清收集菌體，用無菌水重懸至OD600=1.0。按重懸液2%的體積接種到篩選培養(yǎng)基（酚酸含量為1 000 mg·L?1）中搖床（28 ℃， 220 r·min?1）培養(yǎng)3 d。將發(fā)酵液裝入分液漏斗中，用二氯甲烷按照1∶2比例萃取3次，收集有機液相于旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（30 ℃，80 r·min?1）上進(jìn)行旋蒸濃縮后，將濃縮物轉(zhuǎn)移至樣品瓶內(nèi)，用75%無水乙醇定容于5 mL。采用紫外分光光度儀測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出剩余酚酸物質(zhì)的量，按公式（1）計算降解率（degradation rate，DR）。

DR =（ D - M／D） ×100% （1）

式中，D 為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出對照組剩余酚酸物質(zhì)的質(zhì)量；M 為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出試驗組剩余酚酸物質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗

選取溫度、酚酸含量、氮源3種因素進(jìn)行單因素試驗，其他培養(yǎng)條件不變。溫度單因素試驗中將溫度分別設(shè)置為25、30、35、40 ℃；酚酸含量單因素試驗中將化感物質(zhì)初始含量分別設(shè)置為100、500、1 000、1 500、2 000 mg·L?1；氮源單因素試驗中將氮源分別設(shè)置為磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、硝酸鉀（KNO3）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、氯化銨（NH4Cl）、硝酸鈣[（Ca（NO3）2]。降解率的測定方法同1.2.2。

1.2.4 種子萌發(fā)試驗

分別選用無菌水（CK）、250 mg·L?1 水楊酸溶液（SA250）、2.5 mg·L?1 水楊酸溶液（SA2.5）、0.025 mg·L?1 水楊酸溶液（SA0.025）、降解菌液（SA250+S1）處理人參種子，處理液用量均為4 mL，共計5種處理。其中降解菌液處理為降解菌和250 mg·L?1 水楊酸（1∶3）的混合液4 mL?；旌弦褐械慕到饩鸀榍捌诤Y選得到，經(jīng)液體搖床發(fā)酵（1.2.3優(yōu)化后的發(fā)酵條件）培養(yǎng)3 d后，去除上清液，采用去離子水稀釋至OD600=1，即成降解菌液。

培養(yǎng)皿法： 在9 cm 玻璃培養(yǎng)皿的底部鋪2層濾紙，將濾紙片用無菌水浸透固定，高壓蒸汽滅菌（121 ℃、10 min）。選取顆粒飽滿、大小均一的裂口人參種子，用4%的次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水反復(fù)沖洗數(shù)次后移至超凈工作臺，每個培養(yǎng)皿放入10粒人參種子和4 mL處理液，每組設(shè)置2組重復(fù)。

種子萌發(fā)形態(tài)指標(biāo)測定： 放入種子記作第1天，之后每天觀察生長情況。于第7天統(tǒng)計并測量記錄各處理種子的生長情況。種子平鋪于透明硬塑料膜上，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量胚根長度和胚軸長度，并計算化感作用效應(yīng)指數(shù)（responseindex，RI）[18]。當(dāng)Tgt;C 時，采用公式（3）計算RI；當(dāng)T

胚根（胚軸）生長值=7 d后的胚根（胚軸）長-剛種植的胚根長（胚軸）長（2）

RI = 1 - C／T（3）

RI = T／C- 1 （4）

式中，C 為空白組生長值，T 為處理組生長值；當(dāng)RIgt;0時，表現(xiàn)為促進(jìn)作用；當(dāng)RIlt;0時，表現(xiàn)為抑制作用；絕對值的大小表示自毒作用強度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2018軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的整理；采用SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及最小顯著差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌分離篩選結(jié)果

以水楊酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、沒食子酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸為單一碳源，從土壤樣品中共分離得到10株細(xì)菌，包含1株放線菌。各菌株的外觀形態(tài)如圖1所示。MSZ為放線菌，呈白纖毛球狀；其余均為細(xì)菌，顏色大都為黃白色，表面光滑，粘稠狀。14XC、BH2XC在香草酸篩選培養(yǎng)基上生長；19AW、BH1AW在阿魏酸篩選培養(yǎng)基上生長；D2在對羥基苯甲酸篩選培養(yǎng)基上生長；DXH1在丁香酸篩選培養(yǎng)基上生長；L1在鄰苯二甲酸篩選培養(yǎng)基上生長；RG1在肉桂酸篩選培養(yǎng)基上生長；S1在水楊酸篩選培養(yǎng)基上生長；放線菌MSZ 在沒食子酸篩選培養(yǎng)基上生長?；?6SrRNA序列比對結(jié)果如表2所示。S1與伯克霍爾德菌（Burkholderia FNTGs）的相似度達(dá)100%。

降解能力測定結(jié)果（表3）表明，S1為高效降解水楊酸菌株。對S1 進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，其在篩選培養(yǎng)基上的生長狀況良好，具有粘度、外觀呈圓形有閃光；革蘭氏染色結(jié)果為陰性；甲基紅試驗、V-P 試驗、氧化?發(fā)酵試驗、尿素酶試驗反應(yīng)呈陽性；革蘭氏染色、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗反應(yīng)呈陰性。

以降解菌株S1的DNA為模板，利用細(xì)菌16SrRNA 基因通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物為1 120 bp 的基因片段。將其通過EzBioCloud 和NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果（圖2）顯示，降解菌株S1與伯克霍爾德菌（Burkholderia FNTGs）處于同一分支，最大相似度為99%，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和生理生化檢測，將菌株S1鑒定為伯克霍爾德菌屬。

2.2 降解能力測定結(jié)果

經(jīng)搖床發(fā)酵，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算菌株S1對酚酸類物質(zhì)的降解能力，結(jié)果（表4）表明，有6株表現(xiàn)出較好的降解能力，其中菌株S1對水楊酸的降解效果最強，平均降解率達(dá)65.32%。由于人參連作土壤中水楊酸的含量較高[3]，而S1對水楊酸的降解能力最優(yōu)，因此選取菌株S1進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用研究。

2.3 菌株S1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

考察在以水楊酸為單一碳源的篩選培養(yǎng)基中，不同氮源。培養(yǎng)溫度和自毒物質(zhì)含量對菌株S1降解水楊酸的影響。結(jié)果表明，不同因素對降解率影響存在顯著差異。不同氮源培養(yǎng)條件下，硝酸鈣[Ca（NO3）2]的效果最好，菌株S1對水楊酸的降解率達(dá)到81.4%（圖3），顯著高于其他氮源。菌株S1對培養(yǎng)溫度具有良好的耐受性，在25～30 ℃之間，對水楊酸的降解率均大于60%，降解效果顯著優(yōu)于其他溫度，最高達(dá)78.7%（圖4）;當(dāng)溫度高于30 ℃時，降解效果逐漸降低。在化感物質(zhì)含量為500 mg·L?1時，菌株S1的降解率達(dá)88.58%，顯著高于其他處理（圖5）。各因素降解率峰值均在設(shè)置的培養(yǎng)條件范圍內(nèi)，說明單因素試驗條件設(shè)置合理。

2.4 菌株S1 對人參種子萌發(fā)的影響

由圖4和表5可知，對照組種子的胚根長度平均為53.42 mm。0.025和2.500 mg·L?1水楊酸處理對人參種子胚根的抑制作用較弱，而250.000 mg·L?1水楊酸處理的胚根長度顯著低于對照組。RI代表自毒物質(zhì)對種子的化感作用程度。在水楊酸處理下，胚根長度的RI均為負(fù)值，表明水楊酸對人參種子胚根的生長具有一定的抑制作用，且在高水平處理下抑制作用最強。經(jīng)菌株S1處理后，人參種子的胚根長度平均為60.13 mm，較對照組增加6.71 mm，促生效果達(dá)12.56%，且RI為正值（0.154），說明菌株S1不僅緩解了水楊酸對胚根生長的抑制作用，同時對人參種子的胚根發(fā)育具有一定促生作用。

對照組種子的胚軸長度平均為27.95 mm。水楊酸處理下人參種子的胚軸長度顯著小于對照，且水楊酸對人參種子胚軸生長的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強。菌株S1降解液能在一定程度上緩解水楊酸對人參種子胚軸生長的抑制作用，但其胚軸長度仍顯著小于對照，而胚根長度與對照組無差異顯著，說明胚根對水楊酸的耐受性較胚軸強；胚軸長度的RI為負(fù)值，說明在S1降解液處理中還有一定的水楊酸殘留，或是某些代謝產(chǎn)物仍具有自毒性，致使胚軸生長受到抑制。

3 討論

篩選及應(yīng)用自毒物質(zhì)降解菌是有效解決連作障礙的措施之一，對抗重茬病害的防治技術(shù)和人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展都具有一定的推動作用。本研究在人參連作土壤中發(fā)現(xiàn)了10株可降解不同酚酸物質(zhì)的降解菌，主要以假單胞菌屬為主。研究表明，假單胞菌屬對植物根際自毒物質(zhì)的降解能力較強，具有促生、固氮和生物防治等功能特性[19]。為了減少試驗因素的影響，明確降解菌對于特定酚酸的降解效率，本研究選取具有高效降解水楊酸能力的菌株S1 進(jìn)行生防研究，根據(jù)形態(tài)、生理生化特征、系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株S1鑒定為伯克霍爾德菌屬。研究表明，該菌屬最早在腐爛的洋蔥表面中分離，該屬多種菌株都具有生物修復(fù)和植物促生功能[20]。許玉[21]和Han等[22]研究發(fā)現(xiàn)，該菌屬的菌株可誘導(dǎo)植物的生長、細(xì)胞壁修復(fù)酶、植物防御和抗逆、營養(yǎng)物質(zhì)攝取與積累等代謝途徑。但對于伯克霍爾德菌屬降解自毒物質(zhì)的研究還鮮有報道。

本研究對菌株S1的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在培養(yǎng)溫度為30 ℃、氮源為硝酸鈣、初始水楊酸含量為500 mg·L?1時降解率達(dá)到88.58%，較優(yōu)化前提高23.26%。田間連作土壤中自毒物質(zhì)具有積累效應(yīng)，隨著栽培時間的增長根際土中自毒物質(zhì)的種類和含量均呈現(xiàn)增多趨勢[23]。因此，提升菌種的降解能力尤為重要。本研究單因素試驗的酚酸含量設(shè)置高于土壤，后續(xù)還會進(jìn)一步考察該菌株對酚酸混合物的降解以及與其他微生物的協(xié)同作用。

水楊酸即鄰羥基苯甲酸，其芳香環(huán)上帶有活性羧基，是抑制種子萌發(fā)、降低根系活力的主要原因[24]。本研究表明，菌株S1能緩解水楊酸對人參種子的生長脅迫，對胚根促生效率達(dá)12.56%。推測S1降解水楊酸的代謝過程與李敏等[25]研究的微生物降解苯甲酸類酚酸的過程可能一致，既微生物生理代謝過程中首先將苯酚羥基化形成鄰苯二酚，再經(jīng)過鄰位裂解或間位裂解將苯環(huán)開環(huán)，降解為低碳化合物或者通過三羧酸循環(huán)降解為二氧化碳和水。在自然界中，植物根際分泌的酚酸自毒物質(zhì)會迅速吸附到礦物質(zhì)和有機質(zhì)的表面，降低其有效性，使植物不能充分利用土壤中的營養(yǎng)元素，從而限制植物生長[26]。微生物能降解自毒物質(zhì)，促進(jìn)土壤中有機碳礦化，進(jìn)而為植物及土壤微生物的生長提供養(yǎng)分[27]。因此，利用降解菌株S1作為微生物菌劑進(jìn)行連作障礙防治，對于解決連作障礙問題具有潛在生防應(yīng)用價值，為緩解連作障礙的生物有機菌劑研制及完善人參土壤管理技術(shù)體系提供了理論依據(jù)。

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基金項目：廣西壯族自治區(qū)科技重大專項（桂科AA18242026）；廣西壯族自治區(qū)科技計劃項目（桂科AB21196019）。