摘要 目的：觀察溫陽逐瘀湯對腎陽虛證大鼠急性腦缺血損傷后缺血腦組織無翅型MMTV整合位點家族成員3A（Wnt3a）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)的影響，并探討溫陽逐瘀湯防治腎陽虛證大鼠腦缺血損傷的作用機制。方法：將176只雄性SD大鼠分為空白組（Blank組，44只）和腎陽虛組（SYX組，132只）；成功建立腎陽虛證大鼠模型后隨機分為假手術(shù)組（Sham組，44只）、腦缺血模型組（MCAO組，44只）、溫陽逐瘀湯組（WYZY組，44只）。WYZY組大鼠灌胃溫陽逐瘀湯，MCAO組與Sham組灌胃等體積蒸餾水。各組在術(shù)后1 d，運用Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分，于術(shù)后3、7、14、21 d取材，每個時間選11只大鼠。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；運用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組大鼠血漿環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量；免疫蛋白印跡法（Western Blot）檢測缺血側(cè)腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)。結(jié)果：與Blank組比較，SYX組cAMP含量下降（P＜0.05）、cGMP含量升高（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，MCAO組細(xì)胞排列紊亂、大量細(xì)胞壞死、細(xì)胞膜消失、細(xì)胞核固縮，呈明顯的腦缺血損傷表現(xiàn)；WYZY組前期細(xì)胞排列紊亂、部分細(xì)胞壞死，隨著時間的延長，細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞排列逐漸密集，壞死細(xì)胞減少，腦缺血損傷顯著改善。與MCAO組、Sham組比較，WYZY組cAMP含量升高，cGMP含量降低（P＜0.05）。與MCAO組比較，WYZY組1、3、7、14、21 d神經(jīng)行為學(xué)評分均降低（P＜0.05）。與Blank組、Sham組比較，MCAO組、WYZY組缺血腦組織3、7、14、21 d Wnt3a、β-catenin表達(dá)均有增加（P＜0.05）；與MCAO組比較，WYZY組Wnt3a、β-catenin表達(dá)均增加（P＜0.05），7 d Wnt3a達(dá)到峰值，14 d" β-catenin達(dá)到峰值。與Blank組、Sham組比較，MCAO組、WYZY組3、7、14、21 d Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)均有增加（P＜0.05）；與MCAO組比較，WYZY組Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)增加（P＜0.05），7 d Wnt3a mRNA達(dá)到峰值，14 d β-catenin mRNA達(dá)到峰值。結(jié)論：溫陽逐瘀湯可改善腎陽虛證大鼠cAMP、cGMP水平及腎陽虛病理狀態(tài)，可能通過上調(diào)Wnt3a、β-catenin表達(dá)減輕急性腦缺血損傷，減少神經(jīng)功能缺損。

關(guān)鍵詞 急性腦缺血；溫陽逐瘀湯；腎陽虛證；無翅型MMTV整合位點家族成員3A；β-連環(huán)蛋白；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.14.012

Effect of Wenyang Zhuyu Decoction on Expressions of Wnt3a and β-catenin after Acute Cerebral Ischemic Injury in Rats with Kidney-Yang Deficiency Syndrome

HE Hongdun， WEI Liang， SUN Shijie， LI Tian， HU Jiajing， ZHU Meizhen

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， Guangxi， China

Corresponding Author ZHU Meizhen， E-mail： beauty0822@126.com

Abstract Objective：To observe the effect of Wenyang Zhuyu decoction on the expression of wingless MMTV integration site family member 3A（Wnt3a） and β-catenin in the ischemic brain tissue of rats with kidney-Yang deficiency syndrome after acute cerebral ischemia injury，and to explore the mechanism of Wenyang Zhuyu decoction in preventing and treating cerebral ischemic injury in rats with kidney-Yang deficiency syndrome.Methods：One hundred and seventy-six male SD rats were divided into Blank group（44 rats） and kidney-Yang deficiency group（132 rats）.After the successful establishment of kidney-Yang deficiency syndrome model，the rats were randomly divided into Sham operation group（Sham group，44 rats），cerebral ischemia model group（MCAO group，44 rats） and Wenyang Zhuyu decoction group（WYZY group，44 rats）.WYZY group was gavaged with Wenyang Zhuyu decoction，MCAO group and Sham group were gavaged with equal volume of distilled water.One day after operation，neurobehavioral scores of rats in each group were collected by Zea Longa score criteria.Materials were collected on 3 day，7 day，14 day and 21 day after operation，and 11 rats were selected at each time.The morphological changes of nerve cells were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.The contents of cyclic adenosine monophosphate（cAMP） and cyclic guanosine monophosphate（cGMP） in the plasma were detected by enzyme-linked immunoadsorbent assay（ELISA），and the expressions of Wnt3a and β-catenin in ischemic cerebral tissue were detected by Western Blot.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to detect the mRNA expressions of Wnt3a and β-catenin mRNA.Results：Compared with the Blank group，cAMP content in the WSYX group decreased（P＜0.05），and cGMP content increased（P＜0.05）.The results of HE staining showed that the MCAO group showed disordered cell arrangement，necrosis，disappearance of cell membrane and contraction of nuclei，and showed obvious ischemic injury.The WYZY group showed disordered cell arrangement and partial cell necrosis in the early stage.With the extension of time，the cell damage was alleviated，the cell arrangement was gradually dense，the necrotic cells reduced，and the ischemic state" improved significantly.Compared with MCAO group and Sham group，cAMP content increased and cGMP content decreased in the WYZY group（P＜0.05）.Compared with MCAO group，the neuroethological scores of WYZY group on 1 day，3 day，7 day，14 day and 21 day were decreased（P＜0.05）.Compared with Blank group and Sham group，the expressions of Wnt3a and β-catenin in ischemic brain tissue of MCAO group and WYZY group increased on 3 day，7 day，14 day and 21 day（P＜0.05）.Compared with MCAO group，the expressions of Wnt3a and β-catenin in the WYZY group" significantly increased（P＜0.05），and Wnt3a and β-catenin in the WYZY group reached their peak value on 3 day，7 day， respectively.Compared with Blank group and Sham group，the mRNA expressions of Wnt3a and β-catenin in MCAO group and WYZY group were increased on 1 day，3 day，7 day，14 day and 21 day（P＜0.05）.Compared with MCAO group，the mRNA expressions of Wnt3a and β-catenin in the WYZY group were increased（P＜0.05），and the mRNA expression of Wnt3a reached its peak value on 7 day and the mRNA expression of β-catenin reached its peak value on 14 day.Conclusion：Wenyang Zhuyu decoction could improve the levels of cAMP，cGMP and the pathological state in rats with kidney-Yang deficiency.Wenyang Zhuyu decoction might relieve acute cerebral ischemia and reduce neurological function injury in rats with kidney-Yang deficiency by up-regulating the expressions of Wnt3a and β-catenin.

Keywords acute cerebral ischemia; Wenyang Zhuyu decoction; kidney-Yang deficiency syndrome; wingless MMTV integration site family member 3A; β-catenin; rats; experimental study

中醫(yī)稱缺血性腦卒中為中風(fēng)，是一類因腦部血液供應(yīng)障礙腦組織缺血缺氧，從而發(fā)生神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)的疾病。相關(guān)研究表明，無翅型MMTV整合位點家族成員（Wnt）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路與腦缺血損傷關(guān)系密切，是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要信號通路之一［1-2］，其中Wnt3a、β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵指標(biāo)，腦缺血發(fā)生后Wnt3a作為Wnt信號通路中重要的信號傳遞激活劑，可激活下游關(guān)鍵因子β-catenin，激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生［3-4］。中風(fēng)多見于中老年人，因年高腎虛、陽氣虧損，無力運血而致血瘀，痹阻腦脈而引發(fā)。本課題組深入中醫(yī)學(xué)理論并綜合前期臨床實踐，認(rèn)為“陽虛血瘀”是缺血性腦卒中的病機根源，治以“溫陽逐瘀、化痰通絡(luò)”為法，在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)溫陽逐瘀湯對腎陽虛缺血性腦卒中的防治有一定的效果，相關(guān)作用機制尚未明確。本研究基于Wnt信號通路，觀察溫陽逐瘀湯對腎陽虛證大鼠急性腦缺血損傷后Wnt3a、β-catenin表達(dá)的影響，探討溫陽逐瘀湯防治缺血性腦卒中的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠［購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，SCXK（湘）2014-0010］，無特定病原體（SPF）級，176只，體質(zhì)量（250±50）g。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。實驗開始前予以適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料，術(shù)前24 h禁食不禁水。本研究已通過實驗動物研究倫理委員會審核。

1.2 實驗藥物

氫化可的松注射液（購自天津天藥藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020199）。溫陽逐瘀湯，組方：制附子10 g，肉桂5 g，杜仲15 g，巴戟天15 g，當(dāng)歸10 g，熟地20 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭8 g，姜半夏9 g，南山楂15 g，紅參10 g。來源：廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。煎煮前浸泡1 h，制附子提前煎煮30 min，浸泡后煎煮2次，第1次30 min，第2次20 min，與煎煮后的藥液混合，紅參單煎1 h后過濾混合至藥液中，肉桂焗3 min；完成后將其加熱至生藥含量2 g/mL的混合藥液，冷卻后封裝保存，置入4 ℃冰箱備用。

1.3 實驗試劑與儀器

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，貨號：JYM1299Ra，JYM1136Ra）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（anti-GAPDH）抗體（Biosharp，貨號：BL006B）；anti-Wnt3a/β-catenin抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-1700R；貨號：bs-1165R）；cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增試劑盒（莫納生物科技有限公司，貨號：MR05101M，MQ10301S）；大腦中動脈栓塞（MCAO）模型線栓（平頂山豫順科技有限公司）。

生物光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；實時熒光定量PCR儀（美國羅氏公司LightCycler96 型）；全波長掃描式讀數(shù)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）；垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模與給藥

1.4.1.1 實驗動物分組

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分為空白組（Blank組，44只）和腎陽虛組（SYX組，132只）。成功建立腎陽虛證大鼠模型后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組，44只）、腦缺血模型組（MCAO組，44只）、溫陽逐瘀湯組（WYZY組，44只）。

1.4.1.2 腎陽虛證模型的建立及評價標(biāo)準(zhǔn)

腎陽虛組將氫化可的松注射入大鼠后腿肌肉，每日1次，劑量25 mg/kg［5］，持續(xù)3周，期間自由飲水、給予標(biāo)準(zhǔn)飼料。每次注射前后觀察記錄各組大鼠體質(zhì)量、一般狀態(tài)及二便情況。當(dāng)出現(xiàn)大便稀溏、精神萎靡、喜臥嗜睡、消瘦等符合腎陽虛證的臨床表現(xiàn)及血漿cAMP、cGMP改變提示腎陽虛證大鼠模型建立成功。

1.4.1.3 腦缺血損傷模型的建立及評價標(biāo)準(zhǔn)

參照相關(guān)文獻(xiàn)［6］，將水合氯醛注射入大鼠腹腔，完成麻醉后，在大鼠頸部正中偏右2～3 mm處縱形切口，鈍性分離頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），剝離迷走神經(jīng)，結(jié)扎近心端CCA和ECA，CCA遠(yuǎn)心端和ICA打一松動活結(jié)，夾住CCA剪一楔形切口，線栓插入ICA，有輕微阻力時停止，之后結(jié)扎并固定CCA和ICA上的活結(jié)，縫合。腹腔注射青霉素防止感染、保溫毯保溫提高大鼠生存率。Sham組與上述步驟一致，但線栓深度不足以阻塞大腦中動脈血流。

術(shù)后24 h進(jìn)行Zea longa評分：0分，正常無神經(jīng)缺損癥狀；1分，手術(shù)對側(cè)前爪伸展不完全；2分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走向?qū)?cè)傾倒；4分，自發(fā)行走能力喪失，意識喪失。Zea longa評分1～3分為實驗大鼠造模成功，0、4分剔除，補充相應(yīng)數(shù)量的大鼠 。

1.4.1.4 給藥

造模后24 h，參照相關(guān)文獻(xiàn)［7］，按1.4 mL/100 g灌胃，根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整藥量，WYZY組灌胃7 d溫陽逐瘀湯；Blank組、Sham組、MCAO組灌胃等體積蒸餾水。

1.4.2 觀察指標(biāo)

1.4.2.1 cAMP、cGMP

注射氫化可的松琥珀酸鈉21 d，MCAO術(shù)后3、7、14、21 d，大鼠尾靜脈采血，樣本靜置數(shù)小時后離心，分離血漿，提取上清液，置于－4 ℃條件保存。

1.4.2.2 大鼠腦組織標(biāo)本處理

造模成功后，從各組大鼠中隨機抽取11只大鼠于3、7、14、21 d進(jìn)行麻醉取材。HE染色：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠心臟使用生理鹽水、4%多聚甲醛依次灌注，灌注后斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛水溶液中。免疫蛋白印跡法（Western Blot）、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：麻醉方式同上，使用生理鹽水灌注大鼠心臟后取腦，將腦組織放于冰塊中的收集管內(nèi)，置于冰箱中保存?zhèn)溆?。

1.4.2.3 HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，采用不同濃度的乙醇逐級脫蠟至水；蘇木精染色25 min后流水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s；流水沖洗；伊紅染色1 min，流水沖洗；經(jīng)乙醇、石炭酸二甲苯及二甲苯脫水后，滴上中性樹膠，封片，鏡下觀察。

1.4.2.4 Western Blot檢測Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平

取凍存的腦組織30 mg，冰上裂解30 min，提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）蛋白試劑盒測定蛋白濃度。100 ℃加熱10 min，蛋白變性，制備蛋白上樣液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜分別與Wnt3a、β-catenin、GAPDH一抗4 ℃封閉過夜，洗膜，加入二抗，常溫?fù)u床孵育2 h，加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）溶液，曝光。采用Image J軟件分析圖像，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4.2.5 RT-PCR檢測Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)水平

取凍存腦組織30 mg，Trizol提取總RNA，檢測樣品RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，cDNA 1.0 μL，正向引物、反向引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（Taq DNA）0.3 μL，脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）2.0 μL，不含RNase的高純度純水（RNase-free-water）20 μL；反應(yīng)條件：加熱至95 ℃，5 s；退火至60 ℃，30 s，持續(xù)循環(huán)40次。采用公式2－△△Ct法進(jìn)行計算。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較符合正態(tài)分布且滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD檢驗；多因素比較采用重復(fù)測量方差分析；不符合正態(tài)分布或方差齊性采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組各時間點體質(zhì)量比較

2.1.1 Blank組與SYX組各時間點體質(zhì)量

14 d時，與Blank組比較，SYX組體質(zhì)量逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；21 d時SXY組體質(zhì)量較Blank組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)重復(fù)測量方差分析，兩組各時間體質(zhì)量變化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.1.2 術(shù)后各組各時間點體質(zhì)量比較

與Blank組比較，Sham組、MCAO組、WYZY組體質(zhì)量減輕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MCAO組比較，WYZY組體質(zhì)量呈上升趨勢（P＜0.05）。詳見表3。

2.2.2 術(shù)后各組各時間點cAMP、cGMP含量比較

與Blank組比較，MCAO組、Sham組、WYZY組cAMP含量降低，cGMP含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。WYZY組與MCAO組cAMP、cGMP含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且WYZY組cAMP含量呈上升趨勢，cGMP含量呈下降趨勢。詳見表5。

2.3 各組各時間點神經(jīng)功能缺損評分比較

與Sham組比較，MCAO組、WYZY組各時間神經(jīng)功能缺損評分均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與MCAO組比較，WYZY組神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05），且神經(jīng)功能缺損評分呈下降趨勢。詳見表6。

2.4 各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Blank組、Sham組細(xì)胞未受缺血缺氧影響，細(xì)胞核、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未破壞，可見完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間排列整齊緊密。MCAO組存在嚴(yán)重的腦缺血損傷破壞，可見大量壞死細(xì)胞，壞死細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘缺，且散亂分布于缺血腦組織中。WYZY組術(shù)后3 d，細(xì)胞散亂分布、排列稀疏，可見一定數(shù)量的空泡樣壞死；術(shù)后7 d，細(xì)胞損傷狀態(tài)較MCAO組稍改善，細(xì)胞逐步呈現(xiàn)致密排列，破壞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞核逐漸清晰，可見少量的空泡樣壞死；術(shù)后14 d，MCAO組可見正常細(xì)胞增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞間排列整齊緊密，空泡樣壞死進(jìn)一步減少；術(shù)后21 d，細(xì)胞損傷狀態(tài)較前進(jìn)一步改善。詳見圖1。

2.5 術(shù)后各組各時間點Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較

與Blank組、Sham組比較，MCAO組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，WYZY組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。詳見表7、表8及圖2、圖3。

2.6 術(shù)后各組各時間點Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)比較

與Blank組、Sham組比較，MCAO組Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，WYZY組Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。詳見表9、表10。

3 討 論

大腦是人體重要的器官之一，對缺血、缺氧極為敏感。腦缺血損傷引發(fā)腦組織嚴(yán)重缺血缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量死亡，嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜聯(lián)系，引發(fā)各種神經(jīng)功能缺失癥狀［2］。腦缺血損傷發(fā)生后，通過溶栓或重建腦血管側(cè)支循環(huán)，以期恢復(fù)缺血區(qū)及半暗帶的血液供應(yīng)是治療腦缺血損傷的有效方法。然而，臨床溶栓治療有嚴(yán)格的時間窗限制，存在顱內(nèi)出血或腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI）風(fēng)險［8-9］。

有研究表明，腦組織發(fā)生損傷后，神經(jīng)再生修復(fù)被激活［10］。多項研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在調(diào)控成體神經(jīng)干細(xì)胞及祖細(xì)胞增殖、分化及神經(jīng)元存活過程中發(fā)揮著重要的作用［11-14］。Wnt3a蛋白作為Wnt/β-catenin信號通路的起始蛋白，其表達(dá)增加可激活Wnt信號通路，Wnt3a作為細(xì)胞生長、增殖的關(guān)鍵信號分子，參與了促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及新生細(xì)胞的分化。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt蛋白表達(dá)上調(diào)可刺激腦缺血后神經(jīng)發(fā)生［15］。Wnt信號啟動的關(guān)鍵是細(xì)胞質(zhì)中是否存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的、可溶的β-catenin。因此，β-catenin認(rèn)為是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，即β-catenin表達(dá)水平較低時，Wnt信號通路關(guān)閉，β-catenin表達(dá)水平升高時，Wnt信號通路激活。β-catenin主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，是細(xì)胞黏連和細(xì)胞骨架形成的主要參與者之一，具有促進(jìn)組織器官生長發(fā)育及受損組織細(xì)胞修復(fù)的功能［16］。β-catenin作為控制神經(jīng)干細(xì)胞分化命運的信號分子，參與腦缺血神經(jīng)發(fā)生，抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及壞死，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用［17］。

腎者，先天之本也，在人的不同階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用。40歲以上的中老年人是中風(fēng)的好發(fā)人群。有學(xué)者分析了68例中風(fēng)病人，發(fā)現(xiàn)59例（86.18%）病人年齡超過50歲［18］。人體腎中之精氣隨著年齡增長漸衰，腎陰精虧則陽無以化，腎陽虧虛氣化無力，百病始生。缺血性腦卒中發(fā)病之因與痰瘀痹阻腦絡(luò)密切相關(guān)，痰瘀濁邪所生非朝夕也，蓋因人之年歲漸長，腎中陽氣漸衰，津血漸緩，痰瘀漸生。腎陽司氣化之職，陽氣虧虛，氣化推動無力，痰濁難化，瘀血難除。腎中陽氣漸衰，津血失溫，血失溫運久則成瘀，津失溫化久則成痰，痰瘀膠結(jié)、腦脈痹阻，形成腎陽虛衰-痰瘀膠結(jié)-腦脈痹阻的病機傳導(dǎo)鏈條，久之導(dǎo)致中風(fēng)發(fā)病。因此，腎陽虧虛、痰瘀互結(jié)是中風(fēng)發(fā)病的病機關(guān)鍵，針對關(guān)鍵病機采用溫復(fù)腎陽、化痰逐瘀的治法，以期鼓動腎中之陽、溫化痰濁瘀血，腦脈復(fù)通，恢復(fù)大腦血供，修復(fù)神機。溫陽逐瘀之法，意在激濁揚清、陽長陰消，扶正祛邪，標(biāo)本兼顧，腎腦同治。根據(jù)“陽虛血瘀、腎腦相關(guān)”理論，以溫復(fù)腎陽、逐瘀通脈為法，一是腎陽復(fù)則痰瘀除，二是痰瘀除則腦脈通，三是腦脈暢則氣血運，最終實現(xiàn)氣血運則腦元生的臨床療效。

本研究結(jié)果顯示，相較于MCAO組，WYZY組大鼠表現(xiàn)出的畏寒、便溏、體質(zhì)量下降等顯著改善，腎陽虛證相關(guān)指標(biāo)cAMP水平上升，cGMP水平下降，cAMP/cGMP比值升高，各指標(biāo)變化隨著時間延長呈逐漸上升或下降趨勢，表明溫陽逐瘀湯可改善腎陽虛證相關(guān)指標(biāo)。本研究觀察到溫陽逐瘀湯在改善腎陽虛證大鼠腦缺血損傷神經(jīng)功能方面有一定的效果；HE染色結(jié)果可見，腦缺血組織細(xì)胞損傷改善。究其機制可能是溫陽逐瘀湯中附子、肉桂、人參、杜仲、巴戟天等峻補腎陽之劑，調(diào)控了cAMP、cGMP表達(dá)，改善了腎陽虛證，陽氣復(fù)充、祛痰化瘀，復(fù)加桃紅、當(dāng)歸、水蛭、姜半夏等藥取其祛瘀化痰之功，諸藥合用，腦脈復(fù)通、血流恢復(fù)，既改善了腎陽虛之證，又減輕了神經(jīng)功能缺損癥狀。

同時本研究結(jié)果還顯示，WYZY組腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)水平升高，7 d Wnt3a達(dá)到峰值，14 d β-catenin達(dá)到峰值，之后開始回落，在21 d趨于穩(wěn)定，提示溫陽逐瘀湯促進(jìn)機體內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)的作用需要一定的時間且具有時限性，溫陽逐瘀湯干預(yù)腎陽虛證，使Wnt3a表達(dá)在7 d內(nèi)達(dá)到峰值，通過Wnt/β-catenin的正性調(diào)節(jié)因子蓬亂蛋白（Dishevelled蛋白）傳遞信號，促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵信號分子β-catenin在缺血腦組織中的表達(dá)達(dá)到峰值，進(jìn)而啟動Wnt途徑，調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)缺血梗死灶周圍皮層新生細(xì)胞增殖，促進(jìn)梗死灶周圍皮層新生細(xì)胞向神經(jīng)元分化，抑制新生細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)一步介導(dǎo)成體神經(jīng)干細(xì)胞及祖細(xì)胞增殖、分化及神經(jīng)元存活的過程，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，發(fā)揮內(nèi)源性修復(fù)作用，改善腎陽虛證急性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮防治急性腦缺血損傷的重要作用。

綜上所述，溫陽逐瘀湯可改善腎陽虛證大鼠cAMP、cGMP水平及腎陽虛病理狀態(tài)，可能通過上調(diào)Wnt3a、β-catenin表達(dá)減輕急性腦缺血損傷，減少神經(jīng)功能缺損。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 李廣大，李笑笑，董健健，等.電針對腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元及Wnt/β-catenin信號通路的影響［J］.針刺研究，2021，46（2）：87-94.

［2］ 張琪，李慢中，馮雪楓，等.補陽還五湯對腦缺血大鼠梗死灶周圍腦區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化及Wnt/β-catenin信號通路的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2021，44（11）：1002-1010.

［3］ 楊筱倩，丁煌，劉曉丹，等.冰片配伍黃芪甲苷和三七總皂苷促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)修復(fù)作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（12）：5854-5859.

［4］ 張利美，周小青，劉旺華，等.丹龍醒腦方促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖與β-catenin、Wnt-3a表達(dá)及其機制的研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，35（1）：7-10.

［5］ 茍小軍，韓寶俠，王朝廷，等.腎陽虛證造模方法考察［J］.吉林中醫(yī)藥，2009，29（9）：814-815.

［6］ LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［7］ 賀石林.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)［M］.長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2001：1-5.

［8］ POWERS W J，RABINSTEIN A A.Response by powers and rabinstein to letter regarding article，\"2018 guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke：a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association\"［J］.Stroke，2019，50（9）：e277-e278.

［9］ ZHAO Q Y，LI X B，DONG W L，et al.Factors associated with thrombolysis outcome in ischemic stroke patients with atrial fibrillation［J］.Neuroscience Bulletin，2016，32（2）：145-152.

［10］ GHERGHE C M，DUAN J Z，GONG J C，et al.Wnt1 is a proangiogenic molecule，enhances human endothelial progenitor function，and increases blood flow to ischemic limbs in a HGF-dependent manner［J］.FASEB Journal，2011，25（6）：1836-1843.

［11］ XU D，LI F Y，XUE G，et al.Effect of Wnt signaling pathway on neurogenesis after cerebral ischemia and its therapeutic potential［J］.Brain Research Bulletin，2020，164：1-13.

［12］ QIU C W，LIU Z Y，ZHANG F L，et al.Post-stroke gastrodin treatment ameliorates ischemic injury and increases neurogenesis and restores the Wnt/β-Catenin signaling in focal cerebral ischemia in mice［J］.Brain Research，2019，1712：7-15.

［13］ SUN L，ZHANG H M，WANG W，et al.Astragaloside Ⅳ exerts cognitive benefits and promotes hippocampal neurogenesis in stroke mice by downregulating interleukin-17 expression via Wnt pathway［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：421.

［14］ VALLE A，LECARPENTIER Y，GUILLEVIN R，et al.Effects of cannabidiol interactions with Wnt/β-catenin pathway and PPARγ on oxidative stress and neuroinflammation in Alzheimer′s disease［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2017，49（10）：853-866.

［15］ XU D，HOU K，LI F Y，et al.XQ-1H alleviates cerebral ischemia in mice through inhibition of apoptosis and promotion of neurogenesis in a Wnt/β-catenin signaling dependent way［J］.Life Sciences，2019，235：116844.

［16］ 蘇尚，吳畏.Wnt/β-catenin信號通路對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控［J］.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2014，44（10）：1029-1042.

［17］ ARVIDSSON A，COLLIN T，KIRIK D，et al.Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［J］.Nature Medicine，2002，8（9）：963-970.

［18］ ARVIDSSON A，COLLIN T，KIRIK D，et al.Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［J］.Nature Medicine，2002，8（9）：963-970.

［19］ 秦瑜玲，舒楊，盧巖，等.中風(fēng)病因病機新說［J］.河南中醫(yī)，2019，39（9）：1309-1313.

（收稿日期：2022-07-01）

（本文編輯薛妮）

基金項目 廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點實驗室項目（No.19-050-45-06，20-065-53-04）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目（No.YCSW2021222）

作者單位 廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧" 530001）

通訊作者 祝美珍，E-mail：beauty0822@126.com

引用信息 何宏盾，韋亮，孫詩杰，等.溫陽逐瘀湯對腎陽虛證大鼠急性腦缺血損傷后Wnt3a、β-catenin表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（14）：2568-2574.