[摘要]目的：研究三七提取物在化妝品中的抗衰老功效應(yīng)用。方法：通過體外人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，使用H2O2和UVA刺激建立氧化應(yīng)激和光老化模型，驗(yàn)證三七提取物的抗氧化、抗衰老功效，并進(jìn)一步在人體中驗(yàn)證三七提取物的抗皺功效。結(jié)果：三七提取物能通過顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量、促進(jìn)CAT酶活性，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷；同時(shí)能通過顯著提高細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白和透明質(zhì)酸的含量，保護(hù)細(xì)胞免受UVA引起的光老化。并且面部皺紋明顯的人群在使用三七提取物制備的護(hù)膚品4周后皮膚皺紋數(shù)量、皺紋深度、皺紋面積、皺紋長(zhǎng)度得到顯著改善。結(jié)論：三七提取物具有較好的抗衰老功效，在護(hù)膚品中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]三七提取物；抗衰老；抗氧化；抗皺；化妝品

[中圖分類號(hào)]TQ658" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2024）11-0017-05

Application of Radix Notoginseng Root Extract in Anti-aging Skin Care Products

SHI Xiuqin1，2，3， WU Di1，2，3， LI Guoqing1，2， ZHAI Wenli1，2，3， AN Quan1，2，3， HUO Tong1，2，3

（ 1.Yunnan Baiyao Group Health Products Co. LTD， Kunming 650000， Yunnan， China; 2.East Asian Skin Health Research Center， Beijing 100048， China; 3.Beijing Ruier Testing Technology Co.， LTD， Beijing 100048， China ）

Abstract： Objective" To study the anti-aging effect of Radix Notoginseng root extract in cosmetics. Methods" In vitro human skin fibroblast culture， oxidative stress and photoaging model was established using H2O2 and UVA stimulation to verify the antioxidant and anti-aging effects of Panax Notoginseng root extract. The anti-wrinkle effect of Radix Notoginseng extract was further verified in human body. Results" Panax Notoginseng root extract can significantly reduce the contents of ROS and MDA in cells， promote the activity of CAT enzyme， and protect cells from oxidative stress induced by H2O2. It also protects cells from UVA-induced photoaging by significantly increasing the content of type I collagen and hyaluronic acid in cells. In addition， the number， depth， area and length of wrinkles of the skin of people with obvious facial wrinkles were significantly improved after 4 weeks using the skin care products prepared by Radix Notoginseng root extract. Conclusion" Panax Notoginseng root extract has good anti-aging effect and has high application value in skin care products.

Key words： radix notoginseng root; anti-aging; antioxidant; anti-wrinkle; cosmetics

三七（Panax Notoginseng）是我國著名的中藥材，其主要藥用部位為根，主要活性成分是皂苷[1]。已有大量研究表明，三七在臨床中能治療高血壓、高血脂方面有較高的應(yīng)用價(jià)值[2]。此外，隨著消費(fèi)者越來越追求化妝品成分的功效性、天然性以及可持續(xù)性。很多研究者將三七引入到化妝品天然功效原料的研究中來。有研究通過建立了衰老動(dòng)物模型，對(duì)三七提取物的抗衰老功效進(jìn)行研究，結(jié)果表明三七提取物可提高D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠皮膚中的膠原蛋白，并且能顯著提高皮膚組織中的氧化酶活性[3]。

然而，人體皮膚的衰老最直觀的表現(xiàn)是皺紋的產(chǎn)生[4]，紫外線輻射是最常見的一種能引發(fā)皮膚光老化的外界因素[5]，UVA的過度暴露會(huì)導(dǎo)致皮膚氧化應(yīng)激和損傷，包括皮膚過早老化、DNA損傷、基因突變甚至皮膚癌[6]。此外，活性氧和自由基在機(jī)體內(nèi)堆積也會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，造成氧化應(yīng)激并引起衰老和不正常的細(xì)胞死亡[7]。由此可見，開發(fā)具有抗衰老功效的天然植物功效原料勢(shì)在必得，消費(fèi)者首選抗衰老護(hù)膚品已經(jīng)成為必然趨勢(shì)。

因此，本研究通過體外H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激模型和UVA誘導(dǎo)的光老化模型研究三七提取物的抗衰老功效，并將三七提取物制備成護(hù)膚品在面部皺紋明顯的人群中驗(yàn)證其功效，為其在抗衰老護(hù)膚品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1" 材料和方法

1.1 主要材料、試劑與儀器：三七提取物（產(chǎn)品批號(hào)：20220618JKF31；云南白藥集團(tuán)文山七花有限責(zé)任公司）；DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胰酶（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）；75瓶/6孔板/96孔板（Corning）；CCK-8、PBS、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒（北京百瑞極生物科技有限公司）；抗壞血酸（aladdin）；COL-1檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司）；HA檢測(cè)試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；電子分析天平[梅特勒～托利多儀器（上海）有限公司]；智能恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；冷凍高速離心機(jī)，Beckman Coulter，Allegra X-30R；倒置顯微鏡（Olympus CKX53）；UV紫外燈箱（spectroline XX-15A/FC）；干燥箱/培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；皮膚皺紋分析系統(tǒng)Primos（LMI Technologies Gmbh Canfield，加拿大）；皮膚水分測(cè)試儀Corneometer CM825（德國CK）；酶標(biāo)儀，HBS-1096A（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK8法測(cè)定三七提取物對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期良好的細(xì)胞以5×103個(gè)/100μl的密度接種于96孔板中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜。分別加入不同濃度（0%、0.31%、0.62%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%）三七提取物處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。每孔加入10μl CCK-8試劑，于37℃繼續(xù)孵育1 h，測(cè)定OD450 nm值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.2 三七提取物抗氧化損傷活性測(cè)定：將1×106個(gè)成纖維細(xì)胞/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理。三七提取物組：用1%的三七提取物處理細(xì)胞24 h；VC組：用50μg/ml的VC處理細(xì)胞24 h；模型組：不用任何樣品處理，培養(yǎng)24 h；隨后三組均用2 000μmol/L的H2O2處理1 h，加入DMEM繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，最后加入200μl的裂解液裂解，收集上清做后續(xù)檢測(cè)?？瞻捉M為正常培養(yǎng)未經(jīng)處理的細(xì)胞，用同樣的裂解方式獲得上清液。

將收集到的上清液進(jìn)行抗氧化損傷能力測(cè)試，根據(jù)碧云天過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性；根據(jù)碧云天脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒測(cè)定丙二醛（MDA）含量；根據(jù)碧云天活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)定活性氧（ROS）的含量；具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書操作。

1.2.3 三七提取物抗光老化活性測(cè)定：將1×106個(gè)成纖維細(xì)胞/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理。三七提取物組：用1%的三七提取物處理細(xì)胞6 h；VC組：用50μg/ml的VC處理細(xì)胞6 h；模型組：不用任何樣品處理，培養(yǎng)6 h；隨后用輻射量為10 J/cm2的UVA刺激細(xì)胞，最后加入200μl的裂解液裂解，收集上清做后續(xù)檢測(cè)。空白組為正常培養(yǎng)未經(jīng)處理的細(xì)胞，用同樣的裂解方式獲得上清液。

將收集到的上清液進(jìn)行抗光老化能力測(cè)試，參考ELISA試劑盒檢測(cè)步驟測(cè)定上清液中Ⅰ型膠原蛋白（CoL-Ⅰ）的含量和透明質(zhì)酸（HA）含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書操作。

1.2.4 人體功效測(cè)試：根據(jù)赫爾辛基宣言，志愿者的選擇遵循人體測(cè)試的醫(yī)學(xué)和倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（倫理批號(hào)：SECCR2023-149-01），所有志愿者的測(cè)試都必須出于志愿者本人自愿，并在測(cè)試前簽署知情同意書。志愿者在簽署知情同意書之前，測(cè)試人員需要告知志愿者本次測(cè)試的目的、可能的利益、潛在的風(fēng)險(xiǎn)和問題以及相關(guān)的權(quán)利和義務(wù)。

1.2.4.1 產(chǎn)品配方及制備工藝：制備產(chǎn)品配方見表1。分別稱取A、B相物料，攪拌條件下緩慢將B相加入A相液體中，充分?jǐn)嚢璺稚⒕鶆颍玫紸/B混合溶液；稱取C相物料，加入A/B相中，浸泡分散均勻，得到A/B/C混合溶液；稱取F相物料，加入攪拌鍋中；將E相物料緩慢撒在F相表面，待E相物料自行浸潤、無明顯白點(diǎn)后，稱取D相物料，加入攪拌鍋中；將混合均勻的A/B/C相加入攪拌鍋中，抽真空至-0.07 MPa左右，開啟攪拌，轉(zhuǎn)速35 rpm，開啟蒸汽加熱至75℃～80℃；稱取G相物料，加熱至75℃～80℃，真空抽入攪拌鍋中，攪拌轉(zhuǎn)速35 rpm，均質(zhì)轉(zhuǎn)速3 000 rpm，均質(zhì)10 min；降溫至45℃以下，稱取H相，溶解均勻后，真空抽入攪拌鍋中，攪拌轉(zhuǎn)速35 rpm，攪拌10 min；關(guān)閉攪拌，破真空，雙層濾網(wǎng)過濾（200目）出料，所得產(chǎn)品用于后續(xù)人體功效測(cè)試。

1.2.4.2 產(chǎn)品安全性測(cè)試：參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）[8]第七章人體皮膚斑貼試驗(yàn)，選擇18～60歲受試者作為受試對(duì)象，胰島素依賴性糖尿病患者，正在接受治療的哮喘或其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病患者，體質(zhì)高度敏感者，哺乳期或妊娠婦女除外。檢測(cè)產(chǎn)品引起人體皮膚不良反應(yīng)的潛在可能性。將樣品放入斑試器小室內(nèi)，用量約為0.02 ml。對(duì)照孔為蒸餾水做空白對(duì)照，將加有樣品的斑試器貼敷于受試者前臂曲側(cè)，用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上，持續(xù)24 h。分別于去除受試物斑試器后30 min、24 h、48 h按照表2標(biāo)準(zhǔn)觀察皮膚反應(yīng)，并記錄結(jié)果。

1.2.4.3 產(chǎn)品抗皺功效測(cè)試：測(cè)試方法及受試者招募參考《化妝品抗皺功效測(cè)試方法》（T/ZHCA006-2019）[9]，選取32名魚尾紋等級(jí)≥2分的中國女性，年齡35～65歲，測(cè)試區(qū)域無明顯影響測(cè)試結(jié)果的干擾因素：胎記、痘、抓痕、痣等，哺乳期、妊娠期或計(jì)劃生育期婦女；過敏體質(zhì)、過敏性皮膚炎，正在接受皮膚科治療等人群除外。測(cè)試環(huán)境溫度為（21.0±1.0）℃，測(cè)試環(huán)境濕度為（50±10）%。受試者連續(xù)使用產(chǎn)品4周，分別于第0周，2周，4周時(shí)使用Primos拍照并分析魚尾紋程度參數(shù)（數(shù)量、深度、面積、長(zhǎng)度）。測(cè)試之前使用清水清潔面部肌膚，清潔完成后進(jìn)入恒溫恒濕間內(nèi)靜坐30 min。30 min后對(duì)參加試驗(yàn)的受試者進(jìn)行拍照。并在第4周回返時(shí)進(jìn)行受試者問卷調(diào)查自評(píng)產(chǎn)品使用感受，問卷設(shè)置5分制（1：不滿意，2：較不滿意，3：一般，4：滿意，5：完全滿意）。滿意度=（4分人數(shù)+5分人數(shù)）/總?cè)藬?shù)×100%

2" 結(jié)果

2.1 三七提取物對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響：通過選取不同濃度梯度的三七提取物探究其對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率均在88%以上，說明三七提取物對(duì)細(xì)胞無毒性，且當(dāng)三七提取物濃度在5%及以上時(shí)細(xì)胞存活率超高了100%，當(dāng)濃度為20%時(shí)，成纖維細(xì)胞存活率高達(dá)126.09%，說明三七提取物對(duì)成纖維細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。見圖1。

2.2 三七提取物的抗氧化損傷作用：結(jié)果顯示，模型組相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于空白組，說明細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增高，模型建立成功。1%三七提取物組、VC組與模型組相比，相對(duì)熒光強(qiáng)度均顯著降低，說明1%三七提取物能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量（見圖2A）；與空白組相比，模型組CAT活力顯著降低，1%三七提取物組、VC組與模型組相比，CAT活力均顯著提高，且1%三七提取物組高于VC組，說明1%三七提取物能顯著提升CAT活力，且效果優(yōu)于陽性對(duì)照VC（見圖2B）；模型組中MDA含量顯著高于空白組，而經(jīng)1%三七提取物和VC處理后，MDA含量均顯著降低，說明1%三七提取物能降低MDA含量從而阻斷細(xì)胞被H2O2氧化損傷（見圖2C）。

2.3 三七提取物的抗光老化作用：結(jié)果顯示，經(jīng)UVA輻射的模型組中，Ⅰ型膠原蛋白（CoL-Ⅰ）的含量顯著下降，經(jīng)VC和1%三七提取物處理的細(xì)胞，能夠顯著增加細(xì)胞中的Ⅰ型膠原蛋白含量，且1%三七提取物刺激Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的能力優(yōu)于陽性對(duì)照組VC，見圖3A。UVA誘導(dǎo)的光老化模型中，HA含量顯著降低，經(jīng)VC和三七提取物處理后細(xì)胞中HA含量顯著增加。見圖3B。

2.4 含三七提取物護(hù)膚品的安全性：最終完成24 h皮膚封閉型斑貼測(cè)試的受試者共45例，在去除斑試器30 min、24 h、48 h后，含三七提取物的護(hù)膚品均未對(duì)皮膚產(chǎn)生不良反應(yīng)。

2.5 含三七提取物護(hù)膚品的抗皺功效：皮膚在內(nèi)源性衰老的過程中，通常表現(xiàn)為細(xì)小皺紋產(chǎn)生，本研究通過32名眼角有明顯皺紋的受試者連續(xù)使用含三七提取物的護(hù)膚品后使用皮膚快速光學(xué)成像系統(tǒng)primos評(píng)價(jià)產(chǎn)品的抗皺功效，結(jié)果顯示，在使用產(chǎn)品4周后，眼角皺紋數(shù)量、皺紋深度、皺紋面積、皺紋長(zhǎng)度都得到了顯著改善，而這種顯著性變化甚至在使用14 d后就有體現(xiàn)。其中皺紋數(shù)量由使用前68.13減少到使用28 d后44.64，見圖4A；皺紋深度使用前為79.63μm，使用28 d后為67.19μm，見圖4B；皺紋面積使用前為50.13 mm2，使用28 d后為45.27 mm2，見圖4C；皺紋長(zhǎng)度使用前為71.16μm，使用28 d后為64.59μm，見圖4D；使用該產(chǎn)品后可以觀察到肉眼可見的皺紋變化，效果圖見圖5。

在評(píng)估皺紋參數(shù)變化的同時(shí)，本研究也通過都受試者的自我評(píng)估進(jìn)一步明確產(chǎn)品的功效，結(jié)果顯示，32名受試者使用產(chǎn)品4周后，受試者對(duì)產(chǎn)品的滿意度為100%。對(duì)皺紋深度改善效果滿意度為81.3%，對(duì)皺紋長(zhǎng)度改善效果的滿意度為84.4%，對(duì)皺紋面積改善效果的滿意度為75%。84.4%認(rèn)為細(xì)紋問題得到改善，87.5%的受試者認(rèn)為使用產(chǎn)品后皺紋、紋路等整體效果得到改善，受試者自我評(píng)估的結(jié)果和儀器測(cè)試的皺紋參數(shù)結(jié)果保持一致。

3" 討論

UVA的輻射是導(dǎo)致皮膚光老化的主要原因，紫外線UVA可以達(dá)到肌膚的真皮層，導(dǎo)致彈性纖維和膠原蛋白纖維被破壞，對(duì)真皮層的成纖維細(xì)胞損傷作用尤其明顯，是皮膚衰老的原因。因此本研究使用了UVA和H2O2刺激成纖維細(xì)胞建立兩種氧化應(yīng)激和光損傷模型，評(píng)估三七提取物的抗衰作用。

ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用，ROS的急劇增加會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p傷，也叫氧化應(yīng)激，過量的ROS會(huì)引起細(xì)胞凋亡[10]。有大量研究表明ROS與衰老密切相關(guān)，過量的ROS通過對(duì)DNA造成損傷，引起細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致衰老[11]。然而生物體在衰老過程中機(jī)體氧化應(yīng)激水平降低，代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）增多，抗氧化酶活力減弱，機(jī)體產(chǎn)生和清除自由基的平衡被破壞，使自由基堆積，加速衰老[12]。本研究通過H2O2刺激成纖維細(xì)胞來建立細(xì)胞氧化損傷模型進(jìn)而研究三七提取物的抗氧化損傷作用。H2O2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷是目前研究應(yīng)用比較廣泛的一種氧化損傷模型體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，H2O2極易透過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)生成高活性自由基，是用來研究各類細(xì)胞氧化損傷的一種重要工具[13-14]。

有研究證明，皮膚衰老與真皮膠原蛋白的含量和性質(zhì)有關(guān)。隨著年齡增長(zhǎng)控制DNA合成的抑制物增多，致使rRNA、tRNA、mRNA含量逐漸下降，膠原蛋白合成進(jìn)一步減少導(dǎo)致皮膚老化[15]。此外，透明質(zhì)酸是皮膚組織的重要成分之一，額外給皮膚補(bǔ)充透明質(zhì)酸能起到獨(dú)特的保護(hù)皮膚作用，可保持皮膚滋潤光滑、細(xì)膩柔嫩、富有彈性，具有防皺、抗皺、美容保健和恢復(fù)皮膚生理功能的作用[16]。因此透明質(zhì)酸也是應(yīng)用在護(hù)膚品中應(yīng)用比較廣泛的一種成分。

本研究證實(shí)了三七提取物能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，并且在H2O2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷模型中，三七提取物能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量，同時(shí)能夠促進(jìn)CAT酶活性，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷；在UVA誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞光老化模型中，三七提取物能顯著提高Ⅰ型膠原蛋白和透明質(zhì)酸的含量，保護(hù)細(xì)胞免受UVA引起的光老化，由此可見，三七根提取可以通過促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成來保護(hù)皮膚免受紫外線引起的衰老。與此同時(shí)，一款產(chǎn)品除了具備功效性外還需要具備超高安全性，在臨床應(yīng)用中不會(huì)給肌膚帶來風(fēng)險(xiǎn)。本研究還將三七提取物制備成了護(hù)膚品，并通過人體試驗(yàn)表明，該產(chǎn)品應(yīng)用在人體中具有安全性，說明該產(chǎn)品安全無刺激，可以應(yīng)用在后續(xù)的抗皺功效測(cè)試中。并且在臨床抗衰老功效方面，使得由于皮膚衰老造成面部皺紋增加的人群在使用產(chǎn)品28 d后，皮膚皺紋數(shù)量、皺紋深度、皺紋面積、皺紋長(zhǎng)度得到顯著改善，見圖6。整體來看該產(chǎn)品在改善皺紋方面有很顯著的效果，說明三七提取物在抗衰老、抗皺產(chǎn)品方向具有很好的應(yīng)用前景。

因此，三七提取物是一種抗衰老功效顯著的活性原料，在抗衰老護(hù)膚品中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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[收稿日期]2023-04-13

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