【摘 要】目的：探討G蛋白信號蛋白家族的調(diào)節(jié)因子17（regulator of G protein signaling 17，RGS17）在腎透明細(xì)胞癌患者中的臨床意義和功能機制。方法：獲得癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clearcell carcinoma，KIRC）的RNAseq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。利用R軟件研究RGS17在KIRC中的表達(dá)差異及其與臨床特征的關(guān)系。使用免疫組化及PCR進行驗證。采用Kaplan-Meier（K-M）分析、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線、單因素COX分析、多因素COX分析來評估患者的生存和預(yù)后，并構(gòu)建nomogram模型。使用STRING進行RGS17相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并進行 GO及KEGG富集分析。并采用 RT-qPCR、Western blot、CCK-8、Transwell 和 劃痕實驗等方法檢測RGS17對ACHN細(xì)胞增殖遷移及cAMP信號通路的影響。結(jié)果：RGS17在KIRC中高表達(dá)，且RGS17的高表達(dá)與更高的T分期、臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。K-M生存分析顯示，RGS17上調(diào)與KIRC患者總生存期、無疾病進展生存期下降密切相關(guān)。ROC曲線表明RGS17能較好的區(qū)分正常和KIRC患者，并在預(yù)測KIRC患者的預(yù)后方面具有一定的準(zhǔn)確性。RGS17是KIRC獨立預(yù)后因素。使用RGS17表達(dá)、臨床分期、病理分級構(gòu)建nomogram預(yù)后模型能較好預(yù)測1、3、5年生存率。RGS17敲低顯著抑制ACHN細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。另外，RGS17敲低能夠抑制cAMP信號通路的激活。結(jié)論：RGS17在腎透明細(xì)胞癌中具有促癌基因的作用，其可能通過激活cAMP信號通路促進腎透明細(xì)胞癌的進展。

【關(guān)鍵詞】腎透明細(xì)胞癌；G蛋白信號蛋白家族的調(diào)節(jié)因子17；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移和侵襲；PKA/CREB信號通路

【中圖分類號】R737.11 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-06-22

腎癌是第三大泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是最常見的亞型，占所有腎癌患者的70%[1]。腎癌早期癥狀不明顯，且缺乏有效的篩查指標(biāo)，當(dāng)出現(xiàn)血尿、腰痛、腹部腫塊（三聯(lián)癥）時已屬晚期[2]。研究發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期KIRC的5年生存率低于10%[3]。因此，尋找早期診斷指標(biāo)和新的治療靶點具有重要的臨床意義。

G 蛋白信號蛋白家族的調(diào)節(jié)因子（regulators ofG-protein signaling，RGS）可以加速G蛋白α亞基的GTP 酶活性，提高GTP 到GDP 的轉(zhuǎn)化率[4]。而GTP轉(zhuǎn)化為GDP有利于腫瘤增殖、遷移、侵襲及血管生成[5]。根據(jù)RGS結(jié)構(gòu)域和蛋白結(jié)構(gòu)的同源性將其分為8 個亞家族（RZ/A、R4/B、R7/C、R12/D、RA/E、RGEF/F、RGRK/G 和RSNX/H）[6]。RGS17 是最近發(fā)現(xiàn)的RZ/A 亞家族成員，被報道與肺癌[7]、前列腺癌[8]、肝癌[9]等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10]。James MA等[11]研究發(fā)現(xiàn)RGS17在人肺癌及前列腺癌中高表達(dá)，并通過cAMP/PKA/CREB 促進腫瘤細(xì)胞增殖。Zhang W 等[9]研究也證實miR-199通過靶向RGS17抑制肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。以上研究表明RGS17有成為腫瘤預(yù)后和治療相關(guān)生物標(biāo)志物的潛力，但RGS17在腎癌中的作用機制尚不十分明確。

本研究初步探討了RGS17的表達(dá)與KIRC的臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。并進一步敲低RGS17，明確RGS17對腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN 細(xì)胞增殖遷移的影響。初步探究了RGS17對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用，本研究發(fā)現(xiàn)，RGS17有潛力成為腎癌預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞ACHN細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清、DMEM 完全培養(yǎng)基、胰酶細(xì)胞消化液（0.25% 胰酶，含EDTA，不含酚紅）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）、CCK-8 試劑（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；GAPDH、RGS17、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白、蛋白提取試劑盒（ImmunoWay公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液、快速封閉液、快速轉(zhuǎn)膜液（蘇州新賽美生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物有限公司）；SDS—PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（中國碧云天公司）；FuturePAG?ETM蛋白預(yù)制膠（艾思易生物科技有限公司）；ECL發(fā)光液（Advansta 公司）；細(xì)胞、組織RNA 柱式提取試劑盒、HiS?cript? Ⅲ All-in-one RT SuperMix、Perfect for qPCRTaq ProUniversal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；通用型組織固定液（賽維爾生物科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），熒光倒置顯微鏡（ 德國蔡司公司），T100 THERMAL CYCLER PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同臨床分組樣本RGS17 表達(dá)量差異分析 使用Timer數(shù)據(jù)庫進行泛癌表達(dá)分析。從癌癥基因組圖譜（TheCancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲得KIRC的RNAseq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。利用R 軟件研究RGS17在KIRC中的表達(dá)差異及其與臨床特征的關(guān)系，繪制箱線圖，計算RGS17的差異表達(dá)。本研究所用數(shù)據(jù)均為標(biāo)準(zhǔn)化后TPM數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)分布接近正態(tài)分布。

1.2.2 生存預(yù)后分析 采用Kaplan-Meier（K-M）生存分析，分析KIRC患者RGS17生存天數(shù)、無疾病生存時間與表達(dá)之間的關(guān)系。根據(jù)RGS17 mRNA表達(dá)水平中值分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。Log-rank用于檢驗K-M生存分析、比較上述兩組的生存差異，進行了診斷ROC、timeROC 分析以比較RGS17基因的診斷與預(yù)后預(yù)測準(zhǔn)確性。采用單因素和多因素logistic回歸分析確定KIRC的獨立預(yù)后因素。

1.2.3 RGS17 的相關(guān)基因分析及GO、KEGG 分析 使用STRING 網(wǎng)站評估蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininteraction，PPI）的生物學(xué)工具，獲取50個RGS17相關(guān)基因，并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。并對相關(guān)基因集進行GO 和KEGG 富集分析。

1.2.4 免疫組化 石蠟切片烘箱60 ℃烤1 h后置于二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇 5 min、70%乙醇5 min、蒸餾水5 min脫蠟水化，自來水沖洗1 min。按照免疫組化試劑盒說明書進行免疫組化染色后，加入DAB顯色液5～10 min復(fù)染，再進行分化反藍(lán)透明處理再經(jīng)蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)2～5 s，最后添加中性樹膠進行封片。

1.2.5 細(xì)胞獲得與培養(yǎng) 細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：DMEM+10%胎牛血清+1%青/鏈霉素雙抗，于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長密度到70%～80% 時，用0.25%胰酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.6 RT-qPCR實驗 使用Lipo8000?試劑轉(zhuǎn)染shRNA NC（陰性對照）及shRNA RGS17 質(zhì)粒48 h后，使用試劑盒提取細(xì)胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，溶解曲線反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為40個。最后，采用2?ΔΔCt分析計算RGS17的表達(dá)。所用引物如下，見表1。

1.2.7 Western blot實驗 提取總蛋白，蛋白定量使用BCA法，加上樣緩沖液后100 ℃變性5 min。電泳后恒流電轉(zhuǎn)于PVDF 膜上，封閉10 min，TBST 浸洗3 遍后一抗4 ℃過夜孵育。TBST再次浸洗3次，二抗孵育1 h，TBST浸洗3次后曝光。以GADPH為內(nèi)參，計算相對蛋白表達(dá)量。

1.2.8 CCK-8實驗 取對數(shù)生長細(xì)胞，以初始密度4×103/孔接種于96孔板上。細(xì)胞貼壁后，按照完全培養(yǎng)基：CCK-8=10∶1 的比例配制CCK-8 懸液；吸除細(xì)胞培養(yǎng)基后，PBS 潤洗；去掉PBS，每孔加入等量的CCK-8懸液，放回培養(yǎng)箱避光孵育2 h。收集不同時間段所測得的OD值作圖。

1.2.9 平板克隆實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以初始密度500個細(xì)胞每孔接種于6孔板上，使細(xì)胞分散均勻。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，培養(yǎng)終止。棄去培養(yǎng)液，用PBS潤洗后，4%多聚甲醛進行細(xì)胞固定，結(jié)晶紫染色液進行染色，用流水洗去染色液并待其干燥。用顯微鏡計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.10 劃痕實驗 培養(yǎng)皿中細(xì)胞滿到90%時，用無菌移液管尖端垂直均勻劃痕；用PBS輕輕潤洗3次，更換無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中；每隔6 h顯微鏡下查看細(xì)胞遷移情況，分別于0 h、12 h 拍照記錄，計算各組閉合率。

1.2.11 Transwell實驗 按照細(xì)胞傳代步驟消化離心，用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計數(shù)，使得每個上室中細(xì)胞濃度為1×104個/300 μL；下室為含胎牛血清20%的500 μL培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；取出小室，移液槍吸棄小室內(nèi)殘余溶液，固定使用4%多聚甲醛；取出小室，棉簽拭去小室上層細(xì)胞，倒扣風(fēng)干，結(jié)晶紫染色液避光染色30 min后將小室置于 PBS中漂洗干凈，顯微鏡下觀察拍照、計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

生信分析方法和R軟件包均使用v4.3.2版R軟件執(zhí)行。其余數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 26.0軟件（IBM Corp，Armonk，NY，USA）進行數(shù)據(jù)處理。服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析或成組t 檢驗進行組間比較。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 RGS17在KIRC及其他腫瘤中的表達(dá)水平

本課題組使用Timer數(shù)據(jù)庫中獲取33種腫瘤及癌旁樣本RGS17的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌、膽管癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、前列腺癌、胃癌中，RGS17較癌旁樣本高表達(dá)，皮膚黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤RGS17表達(dá)較皮膚黑色素瘤增高，但在腎顯色細(xì)胞癌中，RGS17 表達(dá)較癌旁樣本下降（圖1A）。由于Timer數(shù)據(jù)庫時效性，本課題組從TCGA官方數(shù)據(jù)庫中下載最新KIRC mRNA表達(dá)隊列，其中有542個腫瘤樣本及72個癌旁樣本，對其RGS17表達(dá)進行差異分析，并對其中72組成對樣本進行配對樣本差異分析，使用箱線圖進行展示。結(jié)果與之前一致，即RGS17在KIRC中表達(dá)較癌旁樣本升高（均Plt;0.001，圖1B、C）。

2.2 RGS17表達(dá)驗證

收集腎透明細(xì)胞癌及其配對癌旁組織進行mRNA及免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果證實KIRC組織中RGS17的蛋白表達(dá)水平高于正常組織（圖2A～C）。

2.3 RGS17與臨床變量的相關(guān)性分析

為了揭示RGS17與KIRC臨床性狀之間的相關(guān)性，本研究比較了不同年齡、性別、病理分級、臨床分期、T分期、N分期、M分期RGS17的表達(dá)差異，結(jié)果提示：不同年齡及性別之間也未見明顯差異（圖3A、B）。發(fā)現(xiàn)RGS17上調(diào)與更高的T分期、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（均Plt;0.01，圖3D、F、G）；而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更高病理分期的患者RGS17表達(dá)升高不明顯（P=0.13、0.085，圖3C、E）；此外，本課題組還創(chuàng)建了1個熱圖來比較展示高低表達(dá)組在年齡、性別、病理分級、臨床分期、T分期、N分期、M分期等臨床數(shù)據(jù)方面的差異（圖3H）。

2.4 RGS17與KIRC預(yù)后相關(guān)

K-M生存分析結(jié)果表明，RGS17高表達(dá)組的總生存時間（overall survival，OS）及無進展生存期（progression-freesurvival，PFS）較RGS17低表達(dá)組短（均Plt;0.001，圖4A、B）。本研究進一步構(gòu)建了受試者工作特征（receiver operatingcharacteristic，ROC）曲線以明確RGS17對KIRC的診斷價值（圖4C），發(fā)現(xiàn)RGS17表達(dá)水平能較好區(qū)分腫瘤組織和正常組織，AUC值為0.746（95%CI=0.697～0.794），而時間依賴性的ROC曲線分析顯示，基于RGS17表達(dá)水平預(yù)測KIRC患者1、3、5年生存率的AUC值均在0.6以上（圖4D）。除此之外，本課題組還進行單變量和多變量Cox 回歸分析，以探討RGS17表達(dá)水平的預(yù)后價值。單變量Cox回歸分析結(jié)果表明RGS17、年齡、臨床分期、病理分級與OS相關(guān)（均Plt;0.001，圖4E）。多變量Cox獨立預(yù)后分析結(jié)果表明，RGS17、年齡、臨床分期、病理分級為KIRC的獨立預(yù)后因素（均Plt;0.05，圖4F）。

2.5 Nomogram模型構(gòu)建及校準(zhǔn)曲線

根據(jù)單因素、多因素Cox獨立預(yù)后分析結(jié)果，選取為獨立預(yù)后因素且HR值較高的臨床分期、病理分級及RGS17表達(dá)構(gòu)建Nomogram模型，RGS17高表達(dá)組得分約為46分（圖5A），校準(zhǔn)曲線顯示出觀測值與預(yù)測值具有較好的一致性，提示nomogram 模型在預(yù)測KIRC患者1、3、5年生存率方面具有較高的臨床價值（圖5B）。

2.6 RGS17相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)和功能富集分析

使用STRING在線工具構(gòu)建RGS17相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)，以預(yù)測RGS17生物學(xué)功能（圖6A）。并對RGS17及其相關(guān)基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)、GTP酶激活等相關(guān)通路（圖6B）。此外，還對RGS17及其相關(guān)基因KEGG中代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程通路進行富集分析，發(fā)現(xiàn)RGS17相關(guān)基因在cAMP信號通路，cGMP?PKG信號通路、PI3K?Akt信號通路等信號通路上明顯富集（圖6C）。

2.7 RGS17 敲低效率驗證

通過RT-qPCR 和Western blot 方法檢測RGS17 mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示：RGS17轉(zhuǎn)染shRGS17質(zhì)粒后，ACHN細(xì)胞中RGS17mRNA 及蛋白表達(dá)明顯下降（Plt;0.001，圖7A～C）。

2.8 RGS17 敲低對ACHN增殖的影響

通過CCK-8 及平板克隆實驗檢測shNC 及shRGS17 組ACHN細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果證明：RGS17敲低抑制ACHN細(xì)胞增殖活性（Plt;0.001，圖8A），轉(zhuǎn)染RGS17細(xì)胞生長10 d后增殖克隆數(shù)為對照組的2.59倍（Plt;0.001，圖8B）。

2.9 RGS17敲低對ACHN遷移和侵襲的影響

通過劃痕實驗及transwell實驗檢測shNC及shRGS17組ACHN 細(xì)胞的遷移侵襲情況。結(jié)果提示，與對照組相比，shRGS17組12 h劃痕愈合面積明顯減少（Plt;0.001，圖9A、B）。Transwell 遷移及侵襲實驗也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，即抑制RGS17 的表達(dá)將明顯降低ACHN 細(xì)胞的遷移和侵襲能力（Plt;0.001，圖9C、D）。

2.10 RGS17敲低對PKA/CREB通路的影響

通過Western blot 實驗檢查PKA/CREB 通路中PKA、CREB蛋白及其磷酸化表達(dá)的變化，結(jié)果提示，敲低RGS17后，PKA、CREB蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05，圖10A、B），其磷酸化水平也下降（Plt;0.001，圖10A、C），提示RGS17 下調(diào)會抑制PKA/CREB通路的激活。

3 討 論

在非小細(xì)胞肺癌[7]、前列腺癌[8]、卵巢癌[10]、乳腺癌[6]、肝癌[9]、結(jié)直腸癌[12]等多種類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)RGS17高表達(dá)，并在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮潛在作用。通過泛癌分析，本研究驗證了相似結(jié)論，發(fā)現(xiàn)RGS17在浸潤性乳腺癌、膽管癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、前列腺癌、胃癌、皮膚黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤中高表達(dá)。

本研究從TCGA 獲取KIRC 患者數(shù)據(jù)評估RGS17預(yù)后價值。本課題組發(fā)現(xiàn)KIRC樣本RGS17表達(dá)較正常樣本明顯上調(diào)，免疫組化實驗及PCR也得到相同結(jié)果。且RGS17表達(dá)升高與不良的臨床病理特征如T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更高病理分期患者表達(dá)升高不明顯。K-M曲線顯示，RGS17表達(dá)水平較高的KIRC患者擁有較短的OS和PFS。ROC曲線結(jié)果提示RGS17能較好區(qū)分正常與KIRC患者，并能較好預(yù)測1、3、5年生存率，有作為KIRC診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛能。腎癌男性發(fā)病率高于女性，且男性腎癌患者往往腫瘤體積更大，分期更高，預(yù)后更差[13]。研究發(fā)現(xiàn)年齡、性別、病理分級、TNM 分期是腎癌患者獨立預(yù)后因素[14-15]。選取RGS17、年齡、性別、臨床分期、病理分級進行單因素及多因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、臨床分期、病理分級、RGS17是KIRC的獨立預(yù)后因子。選取其中HR值較高的RGS17表達(dá)、臨床分期、病理分級構(gòu)建nomogram預(yù)后模型，校準(zhǔn)曲線顯示出觀測值與預(yù)測值具有較好的一致性，提示該nomogram模型在預(yù)測KIRC患者1、3、5年生存率方面具有較高的臨床價值。

為了進一步明確RGS17影響腎癌的機制，本研究在體外對RGS17進行敲減，發(fā)現(xiàn)RGS17的下調(diào)會抑制腎癌細(xì)胞ACHN的增殖、遷移和侵襲。這與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的KIRC 患者擁有高RGS17 表達(dá)的結(jié)果一致。以上結(jié)果證明RGS17在KIRC發(fā)生發(fā)展過程中起促癌作用。

G蛋白耦聯(lián)受體（G-Protein Coupled Receptors，GPCRs）參與大部分細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)，目前市面上約34%的藥物都直接或間接以G蛋白耦聯(lián)受體作為靶點[16]。RGS蛋白可以作為GTP酶激活蛋白作用于G蛋白α亞基，加速與Gα亞基結(jié)合的GTP水解速度，使Gα亞基更快地恢復(fù)到非活性的 GDP結(jié)合狀態(tài)，負(fù)調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體信號通路，參與細(xì)胞的生長、增殖、分化和遷移[17-18]。目前研究發(fā)現(xiàn)RGS17的功能主要集中在加速GTP的水解及誘導(dǎo)G蛋白的失活[19]。本課題組對RGS17進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并將其相關(guān)基因集進行GO富集分析，也發(fā)現(xiàn)生物過程 、細(xì)胞組分、分子功能中，RGS17相關(guān)基因集富集結(jié)果均包含GTP酶激活及G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)控相關(guān)通路。

細(xì)胞外信號與GPCRs結(jié)合后通過介導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶的活性，調(diào)控ATP向cAMP轉(zhuǎn)化[20]。cAMP是首個發(fā)現(xiàn)的第二信使，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色，主要通過PKA及其下游效應(yīng)因子調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞生物學(xué)行為[21]。cAMP 表達(dá)增高能促進PKA 激活cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-responsive element binding protein，CREB），使CREB靶基因（如血管內(nèi)皮生長因子[22]或細(xì)胞周期蛋白D1[23]）過度轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)RGS17 蛋白表達(dá)水平的改變具有級聯(lián)效應(yīng)，RGS17過表達(dá)可通過降低Gαi/o/z活性，操控cAMP反應(yīng)元件調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[24]。在肺癌中，RGS17上調(diào)導(dǎo)致cAMP過度表達(dá)[11]，減少cAMP依賴的PKA抑制劑介導(dǎo)的生長停滯效應(yīng)[11]。Tie P 等[25]研究證實cAMP/PKA/CREB通路的激活促進腎癌細(xì)胞增殖和侵襲。Zhang B等[26]提出腎癌細(xì)胞株（ACHN、GRC-1和786-O）中Gα亞基的表達(dá)顯著較正常腎上皮細(xì)胞HK-2明顯增加，并依賴PKA相關(guān)通路發(fā)揮作用。而RGS17基因敲除會導(dǎo)致Gα亞單位信號的長時間抑制，抑制PKA/CREB通路的激活[24]。但RGS17在KIRC患者中對cAMP通路的影響及機制尚未探明。本研究在KIRC患者中對RGS17相關(guān)基因集中進行GO富集時發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)型G蛋白偶聯(lián)受體信號通路富集，KEGG富集分析時發(fā)現(xiàn)其在cAMP通路上顯著富集。推測RGS17通過影響GPCRs，活化腺苷酸環(huán)化酶，介導(dǎo)cAMP經(jīng)典通路激活進而參與腎癌進展。為此，本研究進一步進行體外實驗，探索cAMP通路關(guān)鍵蛋白PKA、CREB表達(dá)變化，結(jié)果提示RGS17的敲低下調(diào)了PKA、CREB蛋白表達(dá)，并使得PKA 磷酸化水平及CREB 蛋白磷酸化水平降低下調(diào)，減弱了PKA 及CREB 的活性。因此，本課題組認(rèn)為RGS17可能通過介導(dǎo)cAMP經(jīng)典通路，參與腎癌發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)了RGS17在KIRC患者中高表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移、更高T分期等不良預(yù)后相關(guān)，且擁有較低的OS 和PFS。RGS17 是KIRC 的獨立預(yù)后因素。使用RGS17 表達(dá)、臨床分期、病理分級構(gòu)建nomogram預(yù)后模型能較好預(yù)測1、3、5年生存率。RGS17的敲低可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這可能與其下調(diào)抑制cAMP通路的激活有關(guān)。本研究結(jié)果初步證明了RGS17在KIRC患者腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中起關(guān)鍵作用，有望成為腎癌診療新分子靶點，為后續(xù)RGS17的深入研究提供了重要的生物信息學(xué)基礎(chǔ)和相關(guān)理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Gansler T，F(xiàn)edewa S，Amin MB，et al. Trends in reporting histologi?

cal subtyping of renal cell carcinoma：association with cancer center type

[J]. Hum Pathol，2018，74：99-108．

[2] Lu T，Xu HR，Dong W，et al. Expression and prognosis analysis of

PAQR5 in kidney cancer[J]. Front Oncol，2022，12：955510．

[3] Chow WH，Dong LM，Devesa SS. Epidemiology and risk factors for

kidney cancer[J]. Nat Rev Urol，2010，7（5）：245-257．

[4] Sethakorn N，Dulin NO. RGS expression in cancer：oncomining the

cancer microarray data[J]. J Recept Signal Transduct Res，2013，33（3）：

166-171．

[5] Yamauchi Y，Miura Y，Kanaho Y. Machineries regulating the activ?

ity of the small GTPase Arf6 in cancer cells are potential targets for de?

veloping innovative anti-cancer drugs[J]. Adv Biol Regul，2017，63：

115-121．

[6] Li YH，Li LL，Lin JY，et al. Deregulation of RGS17 expression pro?

motes breast cancer progression[J]. J Cancer，2015，6（8）：767-775．

[7] Wang SC，Zhang CC，Chen RL. Circ_0006220 promotes non-small

cell lung cancer progression via sponging miR-203-3p and regulating

RGS17 expression[J]. Hum Exp Toxicol，2022，41：9603271211062854．

[8] Ma JH，Wei HB，Li XL，et al. Hsa-miR-149-5p suppresses pros?

tate carcinoma malignancy by suppressing RGS17[J]. Cancer Manag

Res，2021，13：2773-2783．

[9] Zhang W，Qian S，Yang GW，et al. MicroRNA-199 suppresses cell

proliferation，migration and invasion by downregulating RGS17 in hepa?

tocellular carcinoma[J]. Gene，2018，659：22-28．

[10] Hooks SB，Callihan P，Altman MK，et al. Regulators of G-Protein

signaling RGS10 and RGS17 regulate chemoresistance in ovarian can?

cer cells[J]. Mol Cancer，2010，9：289．

[11] James MA，Lu Y，Liu Y，et al. RGS17，an overexpressed gene in

human lung and prostate cancer，induces tumor cell proliferation

through the cyclic AMP-PKA-CREB pathway[J]. Cancer Res，2009，69

（5）：2108-2116．

[12] Li L，Luo HS. G-protein signaling protein-17 （RGS17） is up?

regulated and promotes tumor growth and migration in human colorectal

carcinoma[J]. Oncol Res，2018，26（1）：27-35．

[13] Mancini M，Righetto M，Baggio G. Gender-related approach to

kidney cancer management：moving forward[J]. Int J Mol Sci，2020，21

（9）：3378．

[14] Schulz S，Woerl AC，Jungmann F，et al. Multimodal deep learn?

ing for prognosis prediction in renal cancer[J]. Front Oncol，2021，11：

788740．

[15] Zheng BS，Wang SD，Zhang JY，et al. Incidence，prognostic fac?

tors，and survival of patients with renal cancer：a population-based study

[J]. J Investig Surg，2023，36（1）：2197506．

[16] Hertz E，Saarinen M，Svenningsson P. GM1 is cytoprotective in

GPR37-expressing cells and downregulates signaling[J]. Int J Mol Sci，

2021，22（23）：12859．

[17] Yin ZY，Zhang XF，Wang JZ，et al. MoMip11，a MoRgs7-interact?

ing protein，functions as a scaffolding protein to regulate cAMP signal?

ing and pathogenicity in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae[J]. En?

viron Microbiol，2018，20（9）：3168-3185．

[18] Cabrera IE，Oza Y，Carrillo AJ，et al. Regulator of G protein sig?

naling proteins control growth，development and cellulase production in

Neurospora crassa[J]. J Fungi，2022，8（10）：1076．

[19] Zhang LS，Ma HG，Sun FH，et al. MiR-203 inhibits the malig?

nant behavior of prostate cancer cells by targeting RGS17[J]. Eur Rev

Med Pharmacol Sci，2019，23（13）：5667-5674．

[20] Shikata Y，Yoshimaru T，Komatsu M，et al. Protein kinase A inhi?

bition facilitates the antitumor activity of xanthohumol，a valosincontaining

protein inhibitor[J]. Cancer Sci，2017，108（4）：785-794.

[21] Zhang HY，Kong QB，Wang J，et al. Complex roles of cAMPPKA-

CREB signaling in cancer[J]. Exp Hematol Oncol，2020，9（1）：32.

[22] Bitar MS，Al-Mulla F. Upregulation of CREM/ICER suppresses

wound endothelial CRE-HIF-1α-VEGF-dependent signaling and im?

pairs angiogenesis in type 2 diabetes[J]. Dis Model Mech，2015，8（1）：

65-80．

[23] Jones C，Bisserier M，Bueno-Beti C，et al. A novel secretedcAMP

pathway inhibits pulmonary hypertension via a feed-forward

mechanism[J]. Cardiovasc Res，2020，116（8）：1500-1513.

[24] Hayes MP，O’Brien JB，Crawford RA，et al. Fragment-based

nuclear magnetic resonance screen against a regulator of G protein sig?

naling identifies a binding“ hot spot”[J]. Chembiochem，2021，22（9）：

1609-1620．

[25] Tie P，Cheng J，Xue MX，et al. SLC18A3 promoted renal cancer

development through acetylcholine/cAMP signaling[J]. Am J Cancer

Res，2022，12（9）：4279-4289．

[26] Zhang B，Sun N，Mu X，et al. G protein alpha S subunit promotes

cell proliferation of renal cell carcinoma with involvement of protein ki?

nase A signaling[J]. DNA Cell Biol，2017，36（3）：237-242．

（責(zé)任編輯：周一青）