【摘 要】目前猴痘病毒疫情傳播已打破地域流行的規(guī)律，呈現(xiàn)世界范圍內(nèi)流行的特點(diǎn)。因此猴痘疫情的防控成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題，而引入有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法則是疫情防控的關(guān)鍵。目前針對(duì)猴痘病毒的檢測(cè)已有一套完備的方法，包括病毒分離培養(yǎng)，抗原抗體檢測(cè)以及核酸檢測(cè)等，其中用于核酸檢測(cè)的技術(shù)手段又包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、等溫?cái)U(kuò)增以及新興的CRISPR/Cas技術(shù)等。本文主要針對(duì)當(dāng)前猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的原理、特點(diǎn)和缺陷進(jìn)行綜述分析，期望為猴痘病毒疫情防控提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】猴痘病毒；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；CRISPR/Cas

【中圖分類(lèi)號(hào)】R446 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-02

猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）屬于痘病毒科正痘病毒屬[1]，目前發(fā)現(xiàn)了5種可感染人類(lèi)的痘病毒，包括天花病毒（ariola virus）、牛痘病毒（cowpox virus）、痘苗病毒（vacciniaviruse）、猴痘病毒等[2]。1958年首次在丹麥從進(jìn)口的非洲綠猴體內(nèi)分離到猴痘病毒，研究表明其具有感染嚙齒類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)以及其他哺乳動(dòng)物的能力[2-3]，認(rèn)為MPXV是一種人畜共患病，但是其自然宿主依舊不清楚。1970年首次從1例9月齡罹患天花樣疾病的男嬰體內(nèi)分類(lèi)到猴痘病毒[4]，之后認(rèn)為猴痘病毒主要在非洲國(guó)家和地區(qū)流行，2022年5月英國(guó)報(bào)道了猴痘病例之后，世界其他各地也相繼報(bào)道猴痘病例，感染病例出現(xiàn)了爆發(fā)式增長(zhǎng)。2022年7月23日WHO將猴痘疫情確定為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[3]。截至目前約有猴痘感染病例8萬(wàn)多例，死亡病例149例。猴痘病毒疫情嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命，為了有效預(yù)防疫情的傳播，必須建立有效的檢測(cè)方法為疫情防控提供可靠的依據(jù)。本文重點(diǎn)回顧分析猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本采集保存，以及檢測(cè)技術(shù)的原理特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)，期望為MPXV疫情防控提供一定的參考依據(jù)。

1 猴痘病毒

MPXV病毒形態(tài)為類(lèi)似磚狀，大小200～250 nm[5]。病毒由1個(gè)長(zhǎng)約197 kb的線性雙鏈DNA構(gòu)成，見(jiàn)圖1A，包含 190多個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORFs），基因組由中央?yún)^(qū)、可變區(qū)和反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs）構(gòu)成，其中中央?yún)^(qū)的長(zhǎng)度約為101 476 bp，其在病毒的進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)比較保守，主要編碼病毒復(fù)制過(guò)程中的必須酶和結(jié)構(gòu)蛋白，如D1Ｒ～D13Ｒ。ITRs位于基因組的末端，長(zhǎng)約6 379 bp，可變區(qū)和ITRs主要編碼與宿主相互作用的蛋白，見(jiàn)圖1B[6]。MPXV的生活周期都在宿主胞漿內(nèi)完成，病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的酶和蛋白都由病毒自身基因編碼[5]。MPXV成熟過(guò)程中，形成2種不同的病毒顆粒：胞外囊膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV）和胞內(nèi)成熟病毒（intra?cellular mature virus，IMV）[6]， IMV和EEV都有感染宿主細(xì)胞的能力。MPXV自從報(bào)道以來(lái)，主要在中非（剛果盆地）和西非地區(qū)以人畜共患模式呈地方性流行[7]。

1.1 猴痘病毒的分類(lèi)

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)猴痘病毒主要來(lái)自于兩個(gè)分支，分別是Ⅰ進(jìn)化分支（剛果盆地或中非）和Ⅱ進(jìn)化分支（西非進(jìn)化支），其中Ⅰ分支具有較強(qiáng)傳染性和致病性，其致死率大約為11%左右[3]，分支Ⅱ是致病性和傳染性相對(duì)較低。目前研究認(rèn)為引起世界大流行主要是由Ⅱ分支引起[8]。

1.2 猴痘病毒的傳播途徑

研究表明猴痘病毒是一種人畜共患病，可通過(guò)動(dòng)物傳給人，也可人傳人。猴痘病毒侵入的主要途徑，皮膚、黏膜、呼吸道分泌物、血液等。其主要傳播方式直接或間接接觸感染者污染物、飛沫傳播[7，9]。此外，妊娠期間可通過(guò)胎盤(pán)發(fā)生垂直傳播，導(dǎo)致先天性猴痘感染。臨床常見(jiàn)的潛伏期一般為6～13 d。

2 標(biāo)本類(lèi)型和標(biāo)本保存

依據(jù)WHO指南猴痘病毒標(biāo)本分為以下幾種類(lèi)型：皮膚病變材料，病變滲出液、病變組織和病變結(jié)痂組織、口咽拭子、直腸或生殖器拭子、尿液、精液、全血、血清或血漿[9]。WHO推薦實(shí)驗(yàn)室確診采用口咽拭子。MPXV標(biāo)本采集后1 h內(nèi)冷藏（2～8 ℃）或冷凍（-20 ℃或以下）。如果運(yùn)輸時(shí)間超過(guò)7 d，樣品應(yīng)保存在-20 ℃或以下，如果長(zhǎng)期保存標(biāo)本建議置于-70 ℃。標(biāo)本的運(yùn)輸應(yīng)符合國(guó)家和/或國(guó)際法規(guī)，疑似或確診的MPXV病例標(biāo)本（包括臨床標(biāo)本、病毒分離物和培養(yǎng)物）應(yīng)作為A類(lèi)“可感染人類(lèi)的感染性物質(zhì)”（UN2814）運(yùn)輸包裝標(biāo)準(zhǔn)。

3 猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

3.1 猴痘培養(yǎng)分離

猴痘病毒可以接種在雞絨毛尿囊膜（chick chorioallan?toic membrane，cAM）上形成肉眼可見(jiàn)的病變（稱(chēng)為痘痘），痘的大可以區(qū)分不同的痘病毒感染，其形態(tài)學(xué)特征可以用顯微鏡觀察。猴痘病毒分離株可以在兔腎細(xì)胞系生長(zhǎng)，在感染細(xì)胞后的24～48 h觀察到細(xì)胞病變[10]。培養(yǎng)不適合大規(guī)模的檢測(cè)應(yīng)用，耗時(shí)長(zhǎng)，需要實(shí)驗(yàn)室的安全級(jí)別為3級(jí)（BSL3），存在一定獲得性感染風(fēng)險(xiǎn)[11]。

3.2 猴痘病毒免疫學(xué)診斷

免疫學(xué)診斷作為一種常見(jiàn)的病毒診斷方式。如血球凝集測(cè)試是一種簡(jiǎn)單而便宜的方法，其檢測(cè)的基本原理是基于紅細(xì)胞在病毒存在下凝集作用[12]。另外一種基于血球凝集原理的血球凝集抑制（hemagglutination，HI）測(cè)定方法，主要應(yīng)用病毒特異性抗體和抗原檢測(cè)[13]。目前已經(jīng)使用血球凝集和HI檢測(cè)MPXV[14]。此檢測(cè)方法不能區(qū)分MPXV與天花病毒和痘苗病毒，但可以區(qū)分牛痘和 MPXV，此方法可以用來(lái)評(píng)估毒株的進(jìn)化關(guān)系。目前基于側(cè)向流技術(shù)（lateral flowtechnology，LFE）建立一種抗原檢測(cè)商業(yè)化正痘病毒（orthopoxvirus，OPV）的檢測(cè)方法，其檢測(cè)病毒的載量為104 PFU/mL[15]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種廣泛蛋白檢測(cè)方法。以MPXV 病毒表面的A27蛋白為靶標(biāo)蛋白建立ELISA方法測(cè)定猴痘病毒，檢測(cè)限的范圍103 PFU/mL[16]。A27蛋白具有很強(qiáng)的抗原捕獲能力，基于此建立了抗體免疫分析柱（antibody immuno column foranalytical processes，ABICAP）快速檢測(cè)猴痘病的方法，其檢測(cè)的限為103 PFU/mL，檢測(cè)時(shí)間為45 min[17]。研究人員建立的蛋白質(zhì)陣列斑點(diǎn)印跡技術(shù)（dot immunoassay），在39 min內(nèi)檢測(cè)MPXV病毒，檢測(cè)范圍為103～104 PFU/mL[18]?；趥?cè)向流技術(shù)（lateral flow assay，LFA）建立的猴痘快速檢測(cè)方法，20 min 內(nèi)完成唾液中104～105 PFU/mL 的猴痘病毒檢測(cè) [19]。基于免疫法建立痘病毒檢測(cè)方法，是一種快速，簡(jiǎn)單猴痘病毒檢測(cè)方法，部分方法可實(shí)現(xiàn)30 min內(nèi)完成病毒的檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)自我檢測(cè)，但是免疫學(xué)檢測(cè)由于方法學(xué)本身缺陷，存在特異性差的問(wèn)題。

3.3 基因組測(cè)序檢測(cè)

基因組測(cè)序是鑒定新毒株或發(fā)現(xiàn)變異毒株最有效方法，為傳染病防控提供更為有效和準(zhǔn)確的手段。目前已經(jīng)建立一系列商業(yè)化的猴痘病毒基因組測(cè)序平臺(tái)，截至目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄6 190 個(gè)MPXV 毒株基因的參考序列（NCBI Monkeypox genome sequences）。這些基因序列來(lái)自于流行國(guó)家和地區(qū)。全基因組測(cè)序是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，需要昂貴的儀器、訓(xùn)練有素的技術(shù)人員和熟練的生物信息人員進(jìn)行計(jì)算分析，不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用。

3.4 基于PCR的猴痘病毒檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)應(yīng)用到許多的領(lǐng)域，如病毒的核酸檢測(cè)，癌癥基因突變檢測(cè)等。隨著猴痘疫情不斷蔓延，WHO指南將PCR檢測(cè)確定為猴痘病毒核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[9]。傳統(tǒng)PCR方法，首先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，然后通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化目的片段，然后電泳分析目標(biāo)分子。研究人員構(gòu)建MPXV 毒株血凝素PCR（hemagglutinin PCR，HA-PCR）法[20]。HA-PCR可以區(qū)分不同的MPXV分離株，提高的PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性，此方法使用一系列的限制性?xún)?nèi)切酶，鑒定分離毒株，但是該方法實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程復(fù)雜，容易造成實(shí)驗(yàn)室的污染等?；趥鹘y(tǒng)的PCR存在的問(wèn)題，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。但MPXV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程中也存在一系列問(wèn)題，MPXV病毒基因組本身的特點(diǎn)，GC含量比較低，與其他病毒基因組的同源性比較高，導(dǎo)致了PCR 引物和檢測(cè)探針設(shè)計(jì)具有一定的挑戰(zhàn)性。研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于微溝結(jié)合蛋白（minor-groovebindingprotein-based，MGB）探針的PCR檢測(cè)技術(shù)，該方法極大的提高探針與模版之間的穩(wěn)定性，增加了檢測(cè)的靈敏度和特異性，此方法可以應(yīng)用于MPXV單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)[21]，檢測(cè)限10 ng。基于西非和剛果盆地2個(gè)流行毒株毒力的顯著差異，然而2個(gè)分支基因序列同源性接近99%，對(duì)PCR引物和探針設(shè)計(jì)提出了很大的挑戰(zhàn)[22]。為了克服探針設(shè)計(jì)的困難，通過(guò)對(duì)2個(gè)主要流行分支基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)G2R基因位于西非分支末端區(qū)域，因此在G2R區(qū)域設(shè)計(jì)探針和引物，命名為西非MPXV 特異性檢測(cè)探針（G2RWA），然而在剛果盆地分支分析發(fā)現(xiàn)C3L蛋白基因?yàn)槠涮禺愋?，是針?duì)剛果盆地MPXV進(jìn)行檢測(cè)[23]。另外一種基于多重PCR可以顯著減少共存病原體的識(shí)別序列的錯(cuò)誤，可以檢測(cè)天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒和MPXV多重檢測(cè)方法，特異性為100%，檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)20個(gè)拷貝[24]。基于熒光定量PCR的檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)被WHO推薦為猴痘病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，可有效實(shí)現(xiàn)猴痘病毒檢測(cè)，提高檢測(cè)效率，約需4～6 h但需要專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室和專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員?；趥鹘y(tǒng)PCR設(shè)備耗時(shí)長(zhǎng)，研究人員開(kāi)發(fā)硅基PCR 芯片技術(shù)，5 min 可完成40PCR擴(kuò)增，該設(shè)備攜帶方便，操作方便[25]，有望成為一種新的猴痘病毒核酸檢測(cè)設(shè)備。

3.5 基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)猴痘病毒

伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，極大推進(jìn)了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展。目前已經(jīng)報(bào)道或應(yīng)用于臨床的等溫?cái)U(kuò)增方法有多種。環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermalamplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase poly?merase amplification，RPA）是基于等溫核酸擴(kuò)增的病毒檢測(cè)方法見(jiàn)圖1C和D[26]。LAMP技術(shù)一般需要3對(duì)引物，在60～65 ℃完成體外擴(kuò)增[27]。目前已經(jīng)建立了西非猴痘病毒等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（West African LAMP，W-LAMP）和剛果猴痘病毒（Congo Basin MPXV C-LAMP）測(cè)定平臺(tái)，采用核酸電泳和限制性?xún)?nèi)切酶分析擴(kuò)增產(chǎn)物[28]。目前建立的另一種LAMP快速檢測(cè)猴痘病毒方法，該檢測(cè)平臺(tái)采用硅基芯片技術(shù)，可在5 min內(nèi)完成40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，設(shè)備攜帶方便，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[25]，其是一種很有希望的核酸等溫檢測(cè)技術(shù)，反應(yīng)時(shí)間～6 min。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplifi?cation，RPA）[29]檢測(cè)過(guò)程需要一對(duì)反應(yīng)引物，檢測(cè)溫度大約在37～42 ℃完成體外擴(kuò)增的過(guò)程。目前基于RPA 建立的MPXV-RPA檢測(cè)方法，42 ℃體外擴(kuò)增，3～10 min完成檢測(cè)，檢測(cè)限為16 copies/μL，經(jīng)過(guò)臨床標(biāo)本的驗(yàn)證，特異性為100%，靈敏度為95%[29]。目前針對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)建立等溫?cái)U(kuò)增如LAMP和RPA，可有效檢測(cè)MPXV。

3.6 基于CRISPR/Cas技術(shù)的猴痘核酸檢測(cè)

隨著對(duì)CRISPR/Cas12研究的深入，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas12不僅僅可以用于基因編輯還可以用于基因的檢測(cè)。目前已有基于CRISPR/Cas12建立的MPXV核酸檢測(cè)系統(tǒng)，即利用CRISPR/Cas12聯(lián)合RPA等溫?cái)U(kuò)增建立的MPXV核酸檢測(cè)技術(shù)（CRISPR/Cas12a-mediated recombinase polymerase amplifi?cation，CRISPR-RPA），見(jiàn)圖1E。CRISPR-RPA 是一種可視化的MPXV檢測(cè)方法：首先采用重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)靶標(biāo)區(qū)域核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后CRISPR/Cas12a 在引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）的引導(dǎo)下識(shí)別靶向DNA 序列并激活Cas12a的靶向和非靶向切割DNA作用，非靶向切割熒光標(biāo)記的單鏈DNA（signal strand DNA，ssDNA）序列產(chǎn)生熒光信號(hào)。該技術(shù)的檢測(cè)限為10 copies/反應(yīng)，45 min內(nèi)完成D14L和ATI基因的檢測(cè)[30]。CRISPR-RPA系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)可視化檢測(cè)讀取檢測(cè)信號(hào)的能力?；贑RISPR/Cas12在痘病毒核酸檢測(cè)的能力，Chen Q等[31]建立了CRISPR/Cas12聯(lián)合RPA快速檢測(cè)猴痘病毒的方法（CRISPR/Cas12a-mediated recombinasepolymerase amplification monkeypox virus，CRISPR/Cas12a-MPXV），針對(duì)猴痘病毒的B7R基因區(qū)設(shè)計(jì)RPA引物和gRNA。gRNA引導(dǎo)下CRISPR/Cas12a識(shí)別靶向序列，激活Cas12a 靶向切割雙鏈DNA（double strand DNA）和非靶向切割雙熒光標(biāo)記ssDNA的能力產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀或紫外燈光下肉眼讀取熒光信號(hào)。CRISPR/Cas12a-MPXV檢測(cè)猴痘病毒系統(tǒng)，微孔法的檢測(cè)限為22.4 amol/L（13.5 copies/μL），肉眼可視化讀取信號(hào)，兩步法檢測(cè)限為75 amol/L（45 copies/μL），一步法檢測(cè)限為25 amol/L（15 copies/μL）。其為一種敏感而精確的視覺(jué)檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間約35 min[31]。CRISPR/Cas12a-MPXV是一種可靠、便宜的MPXV核酸檢測(cè)方法[31-32]?；贑RISPR/Cas12a 的猴痘病毒核酸檢測(cè)方法，具有檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

MPXV病毒現(xiàn)已全球傳播，及時(shí)有效的檢測(cè)方法是控制疫情的關(guān)鍵，因此需要建立有效的病毒檢測(cè)手段。目前在傳染性病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面，已經(jīng)有一系列的傳統(tǒng)方法（表1），但均因各種問(wèn)題制約了其實(shí)際應(yīng)用，例如：①病毒分離培養(yǎng)方法，需要在3級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，因此限制了其應(yīng)用，不作為猴痘病毒診斷的常規(guī)方法；②電子顯微鏡病毒形態(tài)分析法，多用于科學(xué)研究，尚不能作為病毒檢測(cè)的常規(guī)手段；③抗體檢測(cè)法，雖然診斷病毒感染具有一定的靈敏度，但對(duì)MPXV的特異性較差；④抗原檢測(cè)方法，雖然快速、經(jīng)濟(jì)，但檢測(cè)靈敏度較低，因此限制了其臨床大規(guī)模應(yīng)用。

分子生物學(xué)的快速發(fā)展極大推動(dòng)了病毒檢測(cè)技術(shù)的革新，近年來(lái)涌現(xiàn)出一系列新技術(shù)新方法（表1），但也都各有優(yōu)劣，例如：①PCR方法，作為核酸檢測(cè)的傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)，其在病毒核酸的檢測(cè)過(guò)程中也存在一系列缺陷，而且難以實(shí)現(xiàn)床旁快速檢測(cè)（POCT）；②等溫?cái)U(kuò)增核酸檢測(cè)技術(shù)[33]，理論上講可以應(yīng)用于MPXV的診斷，但LAMP檢測(cè)技術(shù)需要用到3對(duì)引物，生物信息學(xué)設(shè)計(jì)復(fù)雜，對(duì)技術(shù)要求很高；③RPA技術(shù)，雖然可以裝備智能手機(jī)用于POCT檢測(cè)且反應(yīng)條件溫和，但是和PCR技術(shù)一樣，其反應(yīng)過(guò)程可被高濃度的基因組DNA所抑制，且多重檢測(cè)過(guò)程中不同基因或目標(biāo)的RPA引物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)RPA蛋白質(zhì)，從而抑制擴(kuò)增效率。④CRISPR/Cas12a技術(shù)，其檢測(cè)過(guò)程需要CRISPR-Cas12a聯(lián)合RPA技術(shù)共同開(kāi)發(fā)猴痘病毒檢測(cè)平臺(tái)，極大提高了檢測(cè)速度和效率，然而應(yīng)用CRISPR/Cas12a的核酸檢測(cè)過(guò)程中，Cas12a和DNA聚合酶因競(jìng)爭(zhēng)靶向DNA 鏈而抑制RPA 的擴(kuò)增效率，因此需要對(duì)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行不斷優(yōu)化。

隨著傳染性疾病的反復(fù)出現(xiàn)，研究人員開(kāi)發(fā)出了一些可穿戴設(shè)備，應(yīng)用到傳染性疾病檢測(cè)過(guò)程中并實(shí)現(xiàn)了居家檢測(cè)。在未來(lái)研究過(guò)程中應(yīng)該將傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)與AI技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)操作簡(jiǎn)單、便攜的猴痘病毒快速檢測(cè)。

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（責(zé)任編輯：周一青）