摘要：為明確水稻對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因（OsHPPD）位點(diǎn)突變對(duì)OsHPPD活性及硝磺草酮抗性的影響，以日本晴水稻為材料，克隆獲得OsHPPD，并與玉米、擬南芥、熒光假單胞菌以及燕麥的HPPD進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析不同來(lái)源的HPPD蛋白序列，確定擬突變的氨基酸位點(diǎn)。再利用重疊PCR對(duì)OsHPPD上的12個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得14個(gè)OsHPPD突變體。對(duì)OsHPPD以及突變體蛋白進(jìn)行體外原核表達(dá)，利用比色法測(cè)定突變體蛋白酶的相對(duì)活性以及對(duì)硝磺草酮的相對(duì)抗性。結(jié)果表明，V224I位點(diǎn)突變后較OsHPPD相對(duì)抗性增強(qiáng)14百分點(diǎn)，V224I位點(diǎn)突變后OsHPPD催化位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致OsHPPD的相對(duì)活性和對(duì)硝磺草酮的抗性增強(qiáng)，這對(duì)研制耐HPPD除草劑的種質(zhì)資源、培育抗除草劑水稻新品種均具有重要作用。

關(guān)鍵詞：OsHPPD；位點(diǎn)突變；相對(duì)活性；硝磺草酮；相對(duì)抗性

中圖分類號(hào)：S451.21" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" 文章編號(hào)：1003-935X（2024）03-0042-09

Influention of p-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase from Oryza sativa （OsHPPD） Gene on Activity of OsHPPD and Resistance of Mesotrione

JIN Man^1，2，CHEN Lei2，LIU Zhihong1，CHEN Min1，TANG Xiaoyan2，YANG Xiaohuai1

（1.Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518040，China；2.Shenzhen Institute of Molecular Crop Design，Shenzhen 518110，China）

Abstract：This study aimed to clarify influence of p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from Oryza sativa （OsHPPD） gene on activity of OsHPPD and resistance of mesotrione. OsHPPD was cloned from O. sativa ‘Nipponbar’，and then OsHPPD was compared with HPPD of Zea mays，Arabidopsis thaliana，Pseudomonas fluorescein and Avena sativa by BLAST. We analyzed HPPD protein sequences from different species to determine the amino acid sites to be mutated. Using overlapping PCR，12 amino acids in OsHPPD were subjected to site directed mutagenesis，resulting in 14 OsHPPDmutants. OsHPPD and its mutants were expressed in prokaryotic cells in vitro. Then relative activity of HPPD enzyme and relative resistance to mesotrione were determined by colorimetry. The results showed that relative resistance was enhanced 14 percentage points after V224I site mutation. The site mutation changed the catalytic site of OsHPPD，which resulted in the enhanced relative activity of OsHPPD and relative resistance to mesotrione. This site mutation is of great significance for the development of HPPD-tolerant germplasm resources and new herbicide-resistant rice variety.

Key words：OsHPPD；site mutation；relative activity；mesotrione；relative resistance

收稿日期：2024-04-01

基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃（編號(hào)：JCYJ20230807145759008）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31901532）。

作者簡(jiǎn)介：金 曼（1989—），女，江蘇宜興人，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事除草劑抗性機(jī)制和農(nóng)作物種質(zhì)資源研究。E-mail：79342771@qq.com。

通信作者：唐曉艷，博士，教授，主要從事作物育種研究，E-mail：txy@frontier-ag.com；楊曉懷，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)作物種質(zhì)資源研究，E-mail：35398385@qq.com。

對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）廣泛存在于各種有機(jī)體內(nèi)，催化生物體內(nèi)對(duì)羥苯基丙酮酸（HPP）形成尿黑酸（HGA）的反應(yīng)^［1］，是植物體中質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑的關(guān)鍵酶。當(dāng)其活性受到抑制時(shí)，植物類胡蘿卜素生物合成途徑中最終電子受體以及光合鏈電子傳遞體質(zhì)體醌的生物合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致類胡蘿卜素合成減少，光合鏈電子傳遞受阻，使得植物體出現(xiàn)白化癥狀并導(dǎo)致植物死亡^［2-3］。HPPD抑制劑類除草劑主要用于玉米、甘蔗、高粱等作物田中闊葉雜草和禾本科雜草的防治^［4］，主要包括異唑酮類、三酮類、比唑酮類等除草劑，具有高效、低毒、安全性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)^［4］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年銷售額超1億美元的HPPD抑制劑類除草劑有4個(gè)，分別為硝磺草酮、異唑草酮、環(huán)磺酮、苯唑草酮^［4］。HPPD抑制劑類除草劑都是通過(guò)一個(gè)和底物HPP相似的1，3-二羰基模序與Fe²⁺活性區(qū)域發(fā)生螯合作用，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用。具體來(lái)說(shuō)，HPPD抑制劑類除草劑與植物HPPD的C端Fe²⁺相結(jié)合，其羰基氧與活性部位的Fe²⁺發(fā)生雙齒配位作用，其苯環(huán)與活性位點(diǎn)的苯丙氨酸發(fā)生堆積作用，從而與HPPD形成緊密的復(fù)合體^［5-6］，進(jìn)而抑制HPPD催化HPP向HGA的轉(zhuǎn)化，間接抑制類胡蘿卜素的生物合成，從而導(dǎo)致植物白化死亡。研究表明，不同種屬來(lái)源的HPPD活性區(qū)域氨基酸殘基存在一定的差異，這在一定程度上會(huì)影響抑制劑與HPPD結(jié)合的穩(wěn)定性，導(dǎo)致抑制劑分子對(duì)不同氨基酸序列的HPPD抑制活性有所不同^［3］，即在HPPD活性區(qū)域氨基酸殘基的差異造成催化活性區(qū)域蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其對(duì)HPPD抑制劑類除草劑的敏感性不同，從而對(duì)HPPD抑制劑類除草劑產(chǎn)生一定的抗性。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）HPPD基因的煙草、大豆對(duì)異唑草酮具有一定的抗性，但抗性較弱。為了增強(qiáng)這一抗性，對(duì)熒光假單胞菌的HPPD進(jìn)行突變，篩選出P336W位點(diǎn)的突變體，轉(zhuǎn)入煙草、大豆后大大提高其對(duì)異唑草酮的抗性^［7］。經(jīng)HPPD抑制劑類除草劑篩選獲得具有高度抗性并保持HPPD活性的銅綠假單胞菌，將其HPPD分別轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa），轉(zhuǎn)化后的擬南芥和水稻均表現(xiàn)出對(duì)異唑草酮（一種HPPD抑制劑類除草劑）的高度抗性^［8］。已報(bào)道的植物HPPD鮮有對(duì)HPPD抑制劑類除草劑表現(xiàn)出高度抗性。燕麥（Avena sativa）HPPD（AvHPPD-03）與硝磺草酮和異唑草酮等HPPD抑制劑類除草劑表現(xiàn)出低親和力，燕麥對(duì)HPPD抑制劑類除草劑不敏感^［9］。在煙草中過(guò)表達(dá)燕麥4個(gè)位點(diǎn)（V218I、A327R、I340E、L359M）突變后的AvHPPD可增強(qiáng)煙草對(duì)硝磺草酮的抗性^［9］。對(duì)黃連（Coptics japonica）的研究發(fā)現(xiàn)，黃連培養(yǎng)細(xì)胞在含有HPPD抑制劑類除草劑DTP的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，重組蛋白的體外生化分析表明，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于黃連的HPPD對(duì)DTP具有一定的抗性，黃連HPPD蛋白的米氏常數(shù)（Km值）遠(yuǎn)高于其他植物HPPD蛋白的Km值^［10］。此外，對(duì)黃連HPPD進(jìn)行定點(diǎn)突變，其突變后的蛋白抗性與活性均有不同程度的改變。

目前，在水稻中對(duì)抗HPPD抑制劑類除草劑靶標(biāo)基因HPPD的研究并不多，對(duì)已知的位點(diǎn)改變后可以產(chǎn)生抗性的報(bào)道也很少。因此，本研究通過(guò)對(duì)OsHPPD上12個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，從而改變OsHPPD蛋白構(gòu)象，進(jìn)而引發(fā)水稻對(duì)HPPD抑制劑類除草劑抗性的提高，為研發(fā)抗HPPD抑制劑類除草劑的水稻提供有效的氨基酸突變位點(diǎn)，并為解析水稻HPPD抗性機(jī)制以及開(kāi)發(fā)研制抗HPPD抑制劑類除草劑水稻提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2019年3月至2020年12月在深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水稻對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因（OsHPPD）

水稻對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因號(hào)為L(zhǎng)OC Os02g07160，本試驗(yàn)以日本晴野生型OsHPPD作為突變體相對(duì)活性和相對(duì)抗性檢測(cè)的對(duì)照。水稻品種為日本晴，由深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院保存。

1.1.2 載體及菌株

原核表達(dá)載體pMAL-c5x，由深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院保存；大腸桿菌感受態(tài)BL21菌株，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑

無(wú)縫克隆試劑盒In-Fusion HD Cloning Kit以及異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）；PCR酶KOD FX，購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；硝磺草酮（mesotrione，MST），購(gòu)自于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.4 試劑配制

LB培養(yǎng)液配制：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值調(diào)節(jié)至7.0。

10 mmol/L硝磺草酮（MST）母液配制：稱取 34 mg MST，用1 mL二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，無(wú)菌水充分混勻后定容至10 mL，以1 mL/份用移液槍分裝保存于-20 ℃。根據(jù)試驗(yàn)需要用LB培養(yǎng)液將10 mmol/L硝磺草酮母液稀釋至0.1、0.2、0.5、1 μmol/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 OsHPPD基因克隆

以水稻苗期葉片為材料，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。在水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋OsHPPD堿基序列（LOC Os02g07160），設(shè)計(jì)引物（表1），以水稻葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得OsHPPD基因。反應(yīng)體系（30 μL）：cDNA 1 μL（1 μg），上下游引物各1 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Master Mix 15 μL（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，500 μmol/L dNTP each，0.1 U/μL），Taq聚合酶ddH2O 12 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收用無(wú)縫克隆連接酶（In-fusion酶）連接至pMAL-c5x蛋白原核表達(dá)載體中。

1.2.2 OsHPPD位點(diǎn)突變

為了創(chuàng)制蛋白突變體，從而提高作物蛋白的活性和抗性，并根據(jù)前人研究結(jié)果^{［7，9］}對(duì)特定的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。將水稻、燕麥、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌的OsHPPD蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，擬定V224I、A333R、R346E、L365M、C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D突變位點(diǎn)，在OsHPPD基因擬突變的位點(diǎn)處設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物（表1），通過(guò)重疊PCR技術(shù)對(duì)OsHPPD進(jìn)行定點(diǎn)突變，將野生型和突變后的序列用In-fusion酶連接至pMAL-c5x蛋白原核表達(dá)載體中，并通過(guò)測(cè)序?qū)ν蛔兾稽c(diǎn)的堿基加以驗(yàn)證。引物合成和測(cè)序均由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2.3 OsHPPD蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將含有OsHPPD以及OsHPPD突變體序列的pMAL-c5x載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21中，挑取陽(yáng)性克隆，在含 50 μg/mL 氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體。當(dāng)吸光度D600 nm值為0.6～0.8時(shí)，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，從而誘導(dǎo)OsHPPD以及突變體蛋白的表達(dá)。

1.2.4 OsHPPD突變體相對(duì)活性測(cè)定

HPPD能催化對(duì)羥苯基丙酮酸（HPP）轉(zhuǎn)化為尿黑酸（HGA），尿黑酸暴露在氧氣中時(shí)發(fā)生氧化聚合形成一種褐色素——膿黑素，可用比色法測(cè)定膿黑素的含量。酪氨酸（Tyr）代謝生成HPP，因此在誘導(dǎo)表達(dá)后的液體培養(yǎng)基中添加底物酪氨酸，在OsHPPD蛋白酶的催化下發(fā)酵產(chǎn)生膿黑素，呈褐色。用膿黑素產(chǎn)生的量表征OsHPPD以及OsHPPD突變體的相對(duì)活性。將OsHPPD以及V224I、A333R、R346E、L365M、C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D 等14個(gè)突變體菌液離心，取上清液，以pMAL-c5x空載體菌液上清作為空白對(duì)照，在 400 nm 處測(cè)定上清液吸光度D400 nm，若所測(cè)上清液的吸光度超過(guò)分光光度計(jì)的量程1，則將上清液稀釋2倍后重新測(cè)定，直至所測(cè)上清液的吸光度小于分光光度計(jì)的量程1，上清液實(shí)際D400 nm=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。將野生型OsHPPD菌液上清的吸光度D400 nm值設(shè)為100%，以膿黑素產(chǎn)生的相對(duì)量對(duì)各個(gè)突變的OsHPPD酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化^［11］。相對(duì)活性=突變體 OsHPPD 的D400 nm/野生型OsHPPD的 D400 nm×100%。

1.2.5 MST對(duì)OsHPPD抑制效果的測(cè)定

在誘導(dǎo)表達(dá)后的液體培養(yǎng)基中添加底物酪氨酸（Tyr）以及終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1 μmol/L的硝磺草酮（MST）；繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，觀察菌液的顏色變化，離心取上清液，在400nm處測(cè)定未添加MST菌液上清液的吸光度D400 nm，iD400 nm為加入MST抑制劑后在400 nm處的吸光度，以pMAL-c5x空載體作為空白對(duì)照。通過(guò)D400 nm值以及iD400 nm值計(jì)算結(jié)合率和抑制率，結(jié)合率=iD400 nm/D400 nm×100%，抑制率=（1-結(jié)合率）×100%。結(jié)合率指酪氨酸和OsHPPD蛋白的結(jié)合能力，抑制率指添加硝磺草酮后對(duì)酪氨酸與OsHPPD蛋白結(jié)合的抑制能力。通過(guò)SPSS計(jì)算獲得硝磺草酮半抑制濃度（IC50）值，半抑制濃度即抑制Tyr與OsHPPD結(jié)合50%時(shí)MST的濃度。

1.2.6 OsHPPD突變體相對(duì)抗性測(cè)定

在液體培養(yǎng)基中添加底物酪氨酸（Tyr），以及終濃度為IC50值的MST，抑制OsHPPD蛋白酶的活性；以空載作為空白對(duì)照，以吸光度表征色素產(chǎn)生的相對(duì)量，代表突變體蛋白對(duì)MST的抗性強(qiáng)弱^［11］。相對(duì)抗性性=突變體OsHPPD的 iD400 nm/野生型OsHPPD的iD400 nm×100%。

1.2.7 OsHPPD及其突變體蛋白理化性質(zhì)分析

通過(guò)Protparam預(yù)測(cè)OsHPPD以及定點(diǎn)突變后的蛋白理化性質(zhì)，這些蛋白理化性質(zhì)主要包括：相對(duì)分子質(zhì)量，是指各原子的相對(duì)原子質(zhì)量總和，表示蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的大小，反映氨基酸位點(diǎn)突變后分子量的變化。理論等電點(diǎn)（pI），是指蛋白呈電中性狀態(tài)的pH值，表征蛋白所帶電荷性質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)（instability index，II），表征蛋白的穩(wěn)定性，不穩(wěn)定系數(shù)越小，表明該蛋白越穩(wěn)定，反之，不穩(wěn)定系數(shù)越大，則表示該蛋白越不穩(wěn)定?？偲骄H水性（grand average of hydropathicity，GRAVY），表征蛋白的親疏水性，通過(guò)序列中每個(gè)氨基酸殘基的親水性來(lái)計(jì)算：GRAVY值=∑GRAVYn，式中：∑GRAVY值代表蛋白序列中每個(gè)氨基酸GRAVY值的總和；n代表蛋白質(zhì)序列的長(zhǎng)度（即氨基酸個(gè)數(shù)）；如果GRAVY值＜0，表示該蛋白為親水蛋白，如果GRAVY值＞0，表示該蛋白為疏水蛋白^［12-13］。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Clustal X2序列比對(duì)軟件對(duì)水稻、燕麥、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌的HPPD蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)。通過(guò)SPSS中Probit模型計(jì)算獲得硝磺草酮半抑制濃度（IC50）值。通過(guò)Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)OsHPPD以及定點(diǎn)突變后的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsHPPD及突變序列原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)水稻對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因序列（LOC Os02g07160）以及pMAL-c5x載體序列，選擇限制性內(nèi)切酶NdeⅠ以及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)In-fusion無(wú)縫克隆引物（表1），通過(guò)PCR擴(kuò)增和In-fusion連接，構(gòu)建獲得OsHPPD原核表達(dá)載體OsHPPD-pMAL-c5x以及OsHPPD突變體表達(dá)載體。

2.2 MST對(duì)OsHPPD具有抑制作用

于0 ℃搖培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)含有OsHPPD-pMAL-c5x的BL21大腸桿菌菌株，不添加硝磺草酮的液體培養(yǎng)液呈現(xiàn)出棕褐色（圖1），說(shuō)明Tyr在OsHPPD蛋白酶的催化下生成了膿黑素，可見(jiàn)OsHPPD具有催化能力。添加不同濃度硝磺草酮后，培養(yǎng)液顏色隨硝磺草酮濃度的增加而變淺，說(shuō)明隨著硝磺草酮濃度的增加，對(duì)OsHPPD競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用增強(qiáng)，抑制了膿黑素的生成，導(dǎo)致培養(yǎng)液顏色變淺、吸光度下降，數(shù)值由2.80下降為0.04（圖1、表2）。

由表2可知，隨著MST濃度增加，MST對(duì)OsHPPD蛋白酶催化能力的抑制先快后慢，最終達(dá)到飽和。當(dāng)MST濃度為0.1 μmol/L時(shí)，OsHPPD與底物HPP的結(jié)合率為49%；當(dāng)MST濃度為 1.0 μmol/L 時(shí)，OsHPPD與底物的結(jié)合率僅1%。OsHPPD與底物HPP的結(jié)合受到MST的抑制。用SPSS處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，OsHPPD對(duì)硝磺草酮的IC50值約為0.075 μmol/L，濃度區(qū)間范圍為0.016～0.134 μmol/L。

2.3 OsHPPD擬突變位點(diǎn)突變分析

將水稻、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌HPPD蛋白H11結(jié)構(gòu)域的氨基酸進(jìn)行同源比對(duì)，對(duì)水稻H11結(jié)構(gòu)上的C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變（圖2）。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，將燕麥的4個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)至水稻OsHPPD蛋白序列中，對(duì)水稻V224I、A333R、R346E、L365M進(jìn)行定點(diǎn)突變（圖3）。

對(duì)OsHPPD以及定點(diǎn)突變后蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果（表3）表明，單一位點(diǎn)氨基酸的突變對(duì)OsHPPD的理化性質(zhì)并沒(méi)有引起很大的改變。OsHPPD蛋白等電點(diǎn)為5.32，單一位點(diǎn)突變后，等電點(diǎn)變化范圍在5.19～5.39之內(nèi)。V224I、K426E和Y431D單一位點(diǎn)突變后，不穩(wěn)定系數(shù)大于42，較OsHPPD蛋白穩(wěn)定性減弱；R346E、G415K和S422K單一位點(diǎn)突變后，不穩(wěn)定系數(shù)小于41，較OsHPPD蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)。在總平均親水性方面，各單一位點(diǎn)突變后略有變化，但整體上均小于0，均為親水蛋白，表明位點(diǎn)突變后蛋白整體的親水性并沒(méi)有發(fā)生改變。

2.4 OsHPPD位點(diǎn)突變后對(duì)相對(duì)活性與相對(duì)抗性的影響

各單一位點(diǎn)突變后，對(duì)OsHPPD突變體蛋白酶的相對(duì)活性以及對(duì)硝磺草酮的相對(duì)抗性進(jìn)行測(cè)定（表4），發(fā)現(xiàn)V224I、A333R、K418E位點(diǎn)突變后，突變體蛋白酶相對(duì)活性略有降低，分別降低10、8、

4百分點(diǎn)；其余位點(diǎn)突變后相對(duì)活性大大降低，其中G414D、S422K、E423A、Y431D位點(diǎn)突變后，其突變體蛋白酶的相對(duì)活性僅為野生型的10%、15%、7%、5%。在液體培養(yǎng)基中加入0.1 μmol/L硝磺草酮抑制劑后，V224I位點(diǎn)突變后，對(duì)硝磺草酮的相對(duì)抗性較野生型增強(qiáng)14百分點(diǎn)；A333R位點(diǎn)突變后，其相對(duì)抗性無(wú)明顯變化，為野生型的97%；其余位點(diǎn)突變后相對(duì)抗性都發(fā)生不同程度的降低，表現(xiàn)出對(duì)硝磺草酮抑制劑的敏感特性。說(shuō)明單一位點(diǎn)突變后，改變了蛋白的催化活性區(qū)域構(gòu)象，導(dǎo)致其突變體蛋白酶的相對(duì)活性以及對(duì)硝磺草酮相對(duì)抗性發(fā)生不同程度的變化。

3 討論與結(jié)論

硝磺草酮是一種HPPD抑制劑類除草劑，可以有效防除多種闊葉雜草和禾本科雜草，具有作物（玉米、高粱、甘蔗等）安全性高以及環(huán)境相容性好等優(yōu)勢(shì)，并且與乙酰乳酸合成酶抑制劑類等除草劑無(wú)交互抗性^［14-16］。常規(guī)栽培稻對(duì)硝磺草酮極為敏感，噴施硝磺草酮會(huì)導(dǎo)致水稻苗白化死亡。如果在水稻種植時(shí)，將硝磺草酮與抗性水稻配套使用，可有效殺滅稻田中的惡性雜草，尤其是雜草稻，同時(shí)解決現(xiàn)有抗性水稻（如抗咪唑啉酮類水稻）的農(nóng)藥殘留對(duì)后茬作物的影響以及抗性雜草（如抗咪唑啉酮、ACCase抑制劑類雜草）的問(wèn)題。目前由于水稻OsHPPD基因位點(diǎn)突變而對(duì)HPPD抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的報(bào)道并不多見(jiàn)。因此，解析水稻對(duì)硝磺草酮產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，從而開(kāi)發(fā)獲得抗性水稻，具有重要意義。

熒光假單胞菌的HPPD蛋白晶體結(jié)構(gòu)是第1個(gè)被報(bào)道的、通過(guò)X射線晶體衍射法得到的HPPD類蛋白晶體^［17］，隨后擬南芥和玉米的HPPD蛋白晶體相繼被報(bào)道^［18-19］。通過(guò)對(duì)熒光假單胞菌、擬南芥以及玉米的HPPD蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在蛋白C端作為活性位點(diǎn)的門控區(qū)域的α螺旋H11并非保持開(kāi)放狀態(tài)，可作為屏障將活性位點(diǎn)與溶劑隔離。α螺旋H11可以繞著作為軸點(diǎn)的Asn-416的α碳原子旋轉(zhuǎn)，形成開(kāi)閉構(gòu)象^［18］。當(dāng)處于開(kāi)放構(gòu)象時(shí)，則有利于底物HPP進(jìn)入到催化位點(diǎn)以及產(chǎn)物的釋放；而處于閉合構(gòu)象時(shí)，則有利于保護(hù)催化反應(yīng)免受溶劑的影響^［20］。在HPPD蛋白構(gòu)象閉合時(shí)，α螺旋 H11上Phe-421、Leu-420、Ile-424以及Tyr-427等氨基酸殘基起重要作用。在活性位點(diǎn)區(qū)域的一側(cè)，α螺旋 H8與之前的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的邊界，確保α螺旋 H11可以往復(fù)形成開(kāi)放與閉合的構(gòu)象；在活性位點(diǎn)區(qū)域的另一側(cè)，則由結(jié)構(gòu)更為靈活的部分組成旋轉(zhuǎn)區(qū)域連接B3和C3的β折疊^［18］。這些區(qū)域以及氨基酸位點(diǎn)對(duì)活性區(qū)域構(gòu)象的開(kāi)放和閉合至關(guān)重要，而活性區(qū)域構(gòu)象的開(kāi)放和閉合影響底物如HPP（或抑制劑如MST）與酶的親和能力。

本研究通過(guò)對(duì)水稻HPPD蛋白C端門控區(qū)域的α螺旋H11序列上的12個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)OsHPPD的14個(gè)位點(diǎn)突變體中除了V224I位點(diǎn)，其余位點(diǎn)突變體活性和抗性與野生型相比均降低，說(shuō)明H11序列上氨基酸對(duì)OsHPPD蛋白酶相對(duì)活性很重要性。當(dāng)位點(diǎn)突變后，OsHPPD構(gòu)象發(fā)生改變，底物HPP進(jìn)入活性區(qū)域與Fe²⁺結(jié)合能力變?nèi)?，?dǎo)致突變體OsHPPD蛋白酶相對(duì)活性下降。V224I位點(diǎn)突變后，其蛋白酶對(duì)硝磺草酮的相對(duì)抗性較野生型OsHPPD增強(qiáng)14百分點(diǎn)，可能是由于V224I位點(diǎn)突變后，空間位組發(fā)生改變，阻礙了硝磺草酮與Fe²⁺結(jié)合，這在一定程度上提高了OsHPPD對(duì)硝磺草酮的抗性能力。后續(xù)仍需繼續(xù)發(fā)掘新的抗性位點(diǎn)，將多個(gè)單一突變變位點(diǎn)相互結(jié)合起來(lái)，研發(fā)HPPD活性強(qiáng)、對(duì)硝磺草酮抗性強(qiáng)的突變體。本研究為開(kāi)發(fā)抗除草劑水稻新品種提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐，解決了現(xiàn)有抗除草劑水稻帶來(lái)的交互抗性、對(duì)后茬作物生長(zhǎng)影響等問(wèn)題。

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