摘要：油莎豆是一種草本油料作物，也是糧、油、飼、肥應(yīng)用型經(jīng)濟(jì)作物，綜合利用價值很高，而且油莎豆具有抗旱和耐鹽堿特性，明確其耐鹽堿分子調(diào)控機(jī)制可為其分子育種奠定基礎(chǔ)。本研究對油莎豆幼苗進(jìn)行100 mmol/L混合堿（NaHCO3+Na2Co3，摩爾比2：1）脅迫處理，并分別于處理0、3、6、9、12 d取樣，進(jìn)行丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性等生理指標(biāo)的測定和轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果表明，SOD和CAT活性在處理前6d迅速上升，之后平緩下降；POD活性先迅速上升，脅迫6d后迅速下降；MDA含量在堿脅迫下表現(xiàn)為先逐漸上升，6d后上升迅速；Pro和SP含量在堿脅迫時均表現(xiàn)出逐漸增大趨勢，前者上升迅速，后者上升相對平緩。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在堿脅迫6d時，共鑒定出5 842個差異表達(dá)基因（DEGs），其中上調(diào)3 136個，下調(diào)2 706個。CO和KECC聚類分析顯示，DECs在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等過程中顯著富集。此外，實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果大致相同，這證實(shí)了RIVA-seq數(shù)據(jù)的有效性。本研究結(jié)果為深入了解油莎豆幼苗對堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供了重要信息。

關(guān)鍵詞：油莎豆；堿脅迫；生理特性；轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號：S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）12-0001-09

土壤鹽堿化嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育，對全球農(nóng)業(yè)造成了一定的威脅。據(jù)統(tǒng)計，全球有上百個國家存在鹽堿地，我國鹽堿地面積約占全球總鹽堿地面積的10％，高達(dá)約1億hm2，其中有920.9萬hm2的鹽堿化耕地，占我國耕地面積的6.62％。東北地區(qū)是我國最大的鹽堿地分布區(qū)，僅松嫩平原鹽堿地面積就高達(dá)373.3萬hm2。全球氣候變暖等自然因素以及大面積開荒等人為因素導(dǎo)致土壤次生鹽堿化日益加重，嚴(yán)重影響了我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展，因此，利用基因工程等技術(shù)手段來篩選農(nóng)作物耐鹽堿基因，培育耐鹽堿品種，提高鹽堿地開發(fā)和利用率，對我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和糧食安全具有重要意義。

油莎豆（Cyperus esculentus L.）是莎草科的草本油料作物，脂肪含量約為30％，且油脂脂肪酸組成與橄欖油相近，不飽和脂肪酸約占80％（油酸65％-70％，亞油酸12％-15％），而且還富含淀粉、糖、維生素和礦物質(zhì)等，被廣泛用于食品加工、釀酒、榨油以及化妝品、藥品生產(chǎn)等。油莎豆原產(chǎn)地為沙漠干旱地區(qū)，具有耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，非常適宜荒漠化等邊際土地種植，可以實(shí)現(xiàn)在不與主糧爭地的同時為國家食用油及糧食安全做出貢獻(xiàn)，是一種可以用于鹽堿地改良和邊際土地利用的優(yōu)質(zhì)作物。

當(dāng)植物開始遭受堿脅迫時，會迅速產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS作為第二信使，參與植物生長過程中的多種反應(yīng)。但當(dāng)植物體內(nèi)ROS濃度過高時，會導(dǎo)致膜脂過氧化并產(chǎn)生大量丙二醛（malondialdehyde，MDA），使膜透性增加。為了抵御脅迫，植物會啟動體內(nèi)的酶促和非酶促清除系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的ROS，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶以及脯氨酸（proline，Pro）、可溶性蛋白（soluble protein，SP）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以減少脅迫帶來的傷害。

同時，植物在抵抗堿脅迫時發(fā)生的一系列生理生化反應(yīng)又會誘導(dǎo)堿脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原、滲透調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程，其存在與否及表達(dá)差異使植物呈現(xiàn)出對堿脅迫不同的耐受程度，因此，分析堿脅迫相關(guān)基因的表達(dá)差異和模式可為解析植物的耐堿機(jī)制奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）常被用來分析差異表達(dá)基因（DEGs），已被應(yīng)用于擬南芥、玉米、大豆等多種植物的堿脅迫相關(guān)基因表達(dá)檢測。

國內(nèi)對油莎豆的研究起步較晚，對其抵御堿脅迫的研究相對較少，尚缺乏對其堿脅迫機(jī)制的全面深入了解。本研究以NaHCO3和Na2CO3混合堿溶液模擬堿脅迫環(huán)境，通過測定油莎豆苗期葉片與堿脅迫有關(guān)的生理指標(biāo)解析堿脅迫下其生理代謝的規(guī)律，并用RNA-seq挖掘差異基因，了解油莎豆的分子響應(yīng)機(jī)制，以期為油莎豆在鹽堿地的種植及耐堿品種的培育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

油莎豆品種選用吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所選育的‘吉莎2號’。100 mmol/L堿脅迫溶液用分析純NaHCO3和Na2CO3按摩爾比2：1混合配制。試驗于2022年5月10日至12月30日進(jìn)行。

1.2試驗設(shè)計

選取籽粒飽滿的油莎豆種子，在35℃恒溫培養(yǎng)箱中用清水浸種24 h，然后取出用濕毛巾包裹住放人鐵盤中，再繼續(xù)放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽：待芽發(fā)齊后移栽至裝有蛭石與細(xì)沙（1：1混合）的育苗缽（9 cmx9 cmx8 cm）中，每缽一株；將育苗缽放在育苗盤中培育，期間每3d澆一次水，7d后待幼苗三片葉時進(jìn)行混合堿脅迫處理（A），以未進(jìn)行脅迫處理的幼苗為對照（CK）。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)10株。分別在處理0、3、6、9、12 d取葉樣，用于生理指標(biāo)測定以及轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.3生理指標(biāo)測定

SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性測定采用紫外吸收法，SP含量測定采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）染色法，Pro含量測定采用磺基水楊酸法，淀粉酶含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序分析

1.4.1提取RNA、構(gòu)建文庫以及轉(zhuǎn)錄組測序 根據(jù)生理指標(biāo)測定結(jié)果，選取處理6d的油莎豆葉片，委托北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。先構(gòu)建cDNA文庫，然后使用IlluminaNovaSeq6000測序平臺進(jìn)行測序，過濾篩選后得到高質(zhì)量的Clean Data；利用Triruty軟件進(jìn)行序列組裝，篩去表達(dá)量低的轉(zhuǎn)錄本，統(tǒng)計Unigene的長度。

1.4.2Unigene功能注釋 通過比較堿脅迫處理與對照的基因表達(dá)量，得到差異表達(dá)基因（DEGs）。利用FPKM值表示對應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度。差異倍數(shù)（Fold Change）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。錯誤發(fā)現(xiàn)率（1 discover rate，F(xiàn)DR）是通過對差異顯著性P值（P-val-ue）進(jìn)行校正得到的，表示差異的顯著性。本試驗中將Fold Change≥2且FDRlt;0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

用DIAMOND軟件將Urugene序列與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，用KOBAS得到KEGGOnhology結(jié)果；用InterProScan基于InterPro整合的數(shù)據(jù)庫分析新基因的GO Orthology結(jié)果；預(yù)測完Unigene的氨基酸序列后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得Urugene的注釋信息。

1.4.3熒光定量PCR驗證候選基因 為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，從富集通路中篩選出11個DEGs進(jìn)行熒光定量PCR檢測。使用RNA提取試劑盒（天根）提取堿脅迫6d的油莎豆苗葉片的總RNA。使用Mi曲tyScript第一鏈cDNA合成Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（生工）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用IDT's PrimerQuestTool（https：//www.idtdna.com）設(shè)計特異性引物，以CeUCE2作為內(nèi)參基因，然后采用2-△△Ct法計算基因相對表達(dá)量，并與轉(zhuǎn)錄組測序分析得到的FPKM值進(jìn)行對比。

2結(jié)果與分析

2.1堿脅迫對油莎豆生理代謝的影響

如圖1所示，堿脅迫后油莎豆葉片中的SOD、POD、CAT活性及MDA、SP、Pro含量均明顯升高。隨著堿脅迫時間的延長，MDA、SP、Pro含量均持續(xù)上升，而SOD、POD、CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均在處理6d時最高，說明處理第6天是研究堿脅迫響應(yīng)機(jī)制的最佳采樣時間。

2.2堿脅迫后的差異表達(dá)基因分析

根據(jù)生理指標(biāo)分析結(jié)果，選取堿脅迫6d的油莎豆幼苗葉片，利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，比較組名稱為CK vs A。使用Unigene數(shù)據(jù)集作為進(jìn)一步分析的參考，DEGs則通過DESeq2進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，共鑒定到5 842個DEGs，其中上調(diào)3 136個，下調(diào)2 706個（圖2）。

2.3GO富集分析

對鑒定到的DEGs進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果見圖3。在生物學(xué)過程方面，細(xì)胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、生物調(diào)節(jié)（biologcal regulation）、應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus）等在堿脅迫下被顯著富集。在細(xì)胞組分方面，細(xì)胞解剖實(shí)體（cellular anatomical entity）、細(xì)胞內(nèi)（intracellular）、蛋白質(zhì)復(fù)合物（proteincontaining complex）等在堿脅迫下被顯著富集。在分子功能方面，結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity）、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性（transponer activity）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（transcription regulator activity）等在堿脅迫下被顯著富集。

2.4KEGG通路分析

根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)共有1 832個DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，富集到127個代謝通路中。其中，大多DEGs注釋到代謝通路，占被注釋基因總數(shù)的70.42％；注釋到環(huán)境信息處理、基因信息處理、生物有機(jī)體系統(tǒng)通路的DEGs分別占18.94％、14.41％、14.13％：注釋到細(xì)胞過程的DEGs最少，僅占5.19％（圖41）。在分類通路中，富集DEGs最多的通路為植物一病原互作（plant-pathogen interaction），有221個DEGs，占12.06qo；其次為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plam hormonesignal transduction），有174個DEGs，占9.49％；MAPK信號通路－植物（MAPK signaling pathway-plant）、碳代謝（carbon metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）通路分別注釋有110、98、86、83個DEGs，占比分別為6.00％、5.35％、4.69％、4.53％。

進(jìn)一步分析與堿脅迫相關(guān)的主要通路，結(jié)果（圖4Ⅱ）表明，q值gt;0.05的通路為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及淀粉和蔗糖代謝。推測堿脅迫下油莎豆通過高富集表達(dá)與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的基因來提高植株的堿脅迫耐性。

2.5qRT-PCR對DEGs高富集通路的驗證分析

2.5.1植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 上述分析結(jié)果顯示植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（k004075）在GO和KEGG中均有DEGs富集，因此對該通路中DEGs表達(dá)明顯發(fā)生改變的赤霉素（圖5 Ⅰ、Ⅱ）和脫落酸（ABA）（圖5Ⅲ、Ⅳ）兩個通路進(jìn)行進(jìn)一步分析，并從中選取9個DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗證分析，結(jié)果（圖6）顯示，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果在表達(dá)量上存在差異，但在CK和堿脅迫下的變化趨勢相似，證明了本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的合理性和可靠性。

2.5.2淀粉和蔗糖代謝通路 KEGG分析顯示在淀粉和蔗糖代謝途徑（ko00500）（圖7Ⅰ）富集的DEGs表達(dá)也明顯改變（圖7Ⅲ）；而且堿脅迫6d的油莎豆葉片中，a-淀粉酶活性顯著降低，B-淀粉酶和總淀粉酶活性顯著升高（Plt;0.05）（圖7Ⅱ）。因此推測淀粉和蔗糖代謝途徑也參與了油莎豆對堿脅迫的響應(yīng)。對該通路富集的兩個表達(dá)明顯改變的DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果（圖8）顯示，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果在CK和堿脅迫下的表達(dá)趨勢相似且表達(dá)量相近，再次證明了本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的合理性和可靠性。

3討論

苗期是植物對外界環(huán)境十分敏感的時期，也是進(jìn)行脅迫處理的關(guān)鍵時期。堿脅迫對植物組織和器官的發(fā)育影響顯著，因此明確油莎豆苗期對堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制對提高其耐堿性具有重要意義。前人研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫后植物地上部生物量的降低程度顯著高于地下部生物量，說明地上部對堿脅迫更敏感。因此，本研究選用堿脅迫下的油莎豆苗期葉片進(jìn)行生理指標(biāo)測定和轉(zhuǎn)錄組測序分析。

堿脅迫通常會對植物造成滲透脅迫、次生傷害以及離子毒害等，為了維持正常生長，植物會啟動體內(nèi)的酶促清除系統(tǒng)（SOD、POD、CAT等抗氧化酶）來緩解ROS帶來的傷害，同時通過積累SP、Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低滲透脅迫傷害。本研究結(jié)果顯示，混合堿脅迫下，油莎豆葉片中的SOD、POD、CAT活性均呈先上升后下降趨勢，且均在處理第6天達(dá)到峰值，之后均顯著下降；MDA含量在脅迫過程中持續(xù)增加，尤其脅迫處理6d后快速升高。這可能是因為堿脅迫初期，油莎豆能夠通過提升體內(nèi)相關(guān)抗氧化酶活性快速清除ROS，維持植株正常生長：但隨著脅迫時間的延長，活性氧積累-清除平衡被打破，ROS過量積累，對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成脂質(zhì)過氧化傷害，從而導(dǎo)致MDA大量積累，抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，酶活性下降?？椎抡娴妊芯勘砻?，當(dāng)用200 mmol/LNa2CO3處理高丹草時，在0-12 h抗氧化酶活性顯著上升，超過12 h則逐漸下降。這與本研究結(jié)果一致，說明抗氧化酶活性在植物抗逆過程中發(fā)揮作用時受到細(xì)胞自主活性的限制。另外，本研究結(jié)果顯示Pro、SP含量也均隨著堿脅迫時間的延長呈顯著上升趨勢，這與麻瑩等在鹽地堿蓬、劉佳等在山桃中的研究結(jié)果一致。綜上，處理第6天是研究油莎豆苗期對堿脅迫響應(yīng)機(jī)制的合適采樣時間，因此本研究選用堿脅迫處理第6天的油莎豆葉片樣品進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序分析。

耐堿相關(guān)基因會在植物受到堿脅迫時迅速響應(yīng)，但因為差異基因的存在，不同植物的耐堿性不同。本研究利用RNA-seq技術(shù)檢測了100mmol/L混合堿處理第6天的油莎豆苗期葉片的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，堿脅迫下有5 842個基因差異表達(dá)，其中3 136個上調(diào)表達(dá)，2 706個下調(diào)表達(dá)。

由于物種不同以及脅迫處理的溶液、濃度、時間的不同，DEGs富集的GO條目和KEGG通路會有所差別，但也會存在很大的相似性。魏嘉等研究發(fā)現(xiàn)，在100 mmol/L Na2CO3脅迫6d的野生大豆中，DEGs顯著富集在細(xì)胞、細(xì)胞部分、結(jié)合、催化活性等GO條目。本研究結(jié)果顯示，DEGs顯著富集在細(xì)胞過程、代謝過程、結(jié)合等GO條目中，有與上述野生大豆相似的條目，說明這些條目可能與堿脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

植物中大部分耐堿基因與其脅迫下的生理代謝過程相對應(yīng)，比如與滲透調(diào)節(jié)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因等。本研究在KEGG分析中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)DEGs被注釋到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝等通路上。這與李慧姬用堿脅迫辣椒13 h得到的DEGs主要富集在類黃酮生物合成、淀粉和蔗糖代謝、類胡蘿卜素的生物合成等通路大致相同，說明堿脅迫對植物生理過程產(chǎn)生的影響非常復(fù)雜。

植物對非生物脅迫尤其是堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制有很多，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是其核心途徑，其中，堿脅迫可以誘導(dǎo)ABA、赤霉素快速響應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)植物一系列的生理生化反應(yīng)，以抵御堿脅迫傷害。在本研究中，GO和KEGG分析均發(fā)現(xiàn)DEGs在ABA和赤霉素相關(guān)途徑有富集，表明兩者均參與了油莎豆對堿脅迫的響應(yīng)。同時，本研究中DEGs在淀粉和蔗糖代謝途徑也有較多富集，而且油莎豆幼苗葉片中的淀粉酶活性在堿脅迫下也發(fā)生了顯著變化，這表明淀粉和蔗糖代謝途徑也在油莎豆抵御堿脅迫時發(fā)揮了作用。

4結(jié)論

油莎豆苗期對混合堿脅迫具有一定的耐性，脅迫6d是對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析的最佳取樣時間。從堿脅迫6d的油莎豆葉片中，共鑒定到3 136個上調(diào)表達(dá)和2 706個下調(diào)表達(dá)基因，這些DEGs主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）等途徑。本研究結(jié)果可為油莎豆耐堿品種選育和耐堿分子機(jī)制解析奠定基礎(chǔ)。