摘要：疫苗是控制動物疫病的重要手段，傳統(tǒng)疫苗的設計理念為人類與動物疫病的防控做出巨大貢獻。隨著分子生物學、免疫學等學科的發(fā)展和技術的進步，現(xiàn)代疫苗技術在疫苗研發(fā)上的優(yōu)勢愈發(fā)明顯。本文從傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的研發(fā)切入，結(jié)合免疫學、病原學、生物醫(yī)藥等學科，淺析新型疫苗的設計思路，以期為研發(fā)更加安全有效的疫苗提供參考。

關鍵詞：疫苗；反向疫苗學；生物信息學；免疫學

疫苗是目前控制動物疫病最經(jīng)濟實效的方式之一。人們通過注射含有特異性抗原的疫苗刺激機體免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生針對特定病原體的保護作用，從而預防或減輕該病原體引起的相關疾病。早在1796年，英國醫(yī)生愛德華·詹納發(fā)現(xiàn)通過接種牛痘的方式能夠成功建立對天花病毒的免疫，這是人類運用免疫學原理成功研制的第一支疫苗。隨后在1885年，法國病理學家路易斯·巴斯德針對牛瘟篩選出可以連續(xù)傳代的弱毒活疫苗，這是獸用疫苗研發(fā)的開端。此后，針對養(yǎng)殖業(yè)重要畜禽病的研究持續(xù)深入，很多新的疫苗被研發(fā)用于臨床。

經(jīng)過200多年的發(fā)展，獸用疫苗技術已經(jīng)在實驗室研究和養(yǎng)殖實踐中得到了不斷的完善。傳統(tǒng)的疫苗研發(fā)遵循病原體的分離鑒定、純化培養(yǎng)、滅活或改造的思路，這種循序遞進的方式盡管解決了很多疫病困擾，但仍存在著研發(fā)周期較長、病原可能發(fā)生基因組變異或抗原漂移、免疫效果低下、機體副作用強、免疫方式繁瑣等一系列問題[1]。而與傳統(tǒng)的疫苗技術相比，現(xiàn)代疫苗技術不僅可以更精確的靶向疫苗的抗原，更快捷地投產(chǎn)，還能夠針對復雜的病原提供更多的解決方案。本文以傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的類型為綱，結(jié)合免疫學、病原學、生物醫(yī)藥等學科知識，淺析新型動物疫苗研發(fā)的思路，以期為生產(chǎn)更加安全有效的疫苗提供理論參考。

1 傳統(tǒng)疫苗類型

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是指使用物理或化學方法致使病原體失去其致病能力而保留其抗原性的一類疫苗，是目前制作方式最簡便的疫苗。經(jīng)滅活后的病原體保留了一定程度的抗原特性，能夠激發(fā)動物機體產(chǎn)生免疫反應，提高免疫應答的能力。滅活疫苗因其研發(fā)方法成熟、批量生產(chǎn)簡便且安全性較高，一直是疫苗開發(fā)的主要方式，目前大多數(shù)動物疫病病原都有相應的滅活疫苗。但是，由于滅活疫苗病原在機體內(nèi)不能進行自我復制，因此在大動物上使用滅活疫苗通常需要加大免疫劑量、增加注射頻次才能獲得強效持久的免疫保護。

1.2 弱毒活疫苗

弱毒活疫苗是最早的疫苗類型，牛痘疫苗和牛瘟疫苗都是典型的弱毒活疫苗。傳統(tǒng)的弱毒疫苗主要是通過化學方法或突變方法從強毒株中篩選出弱毒株，在保留病原體的抗原及復制能力的前提下，使其降低或失去致病能力，實現(xiàn)疫苗的相對安全和免疫保護作用。與滅活苗相比，弱毒活疫苗的用量小并且持續(xù)作用效果顯著，但這種機體內(nèi)的持續(xù)復制并不可控，有毒力返強的隱患，因此在免疫力低下或處于惡劣環(huán)境的動物群體中應謹慎使用弱毒活疫苗。

1.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗又稱次單位疫苗、組分疫苗，是一種利用分離、純化病原體的抗原表位（如細菌的外膜蛋白、莢膜多糖等）制成的疫苗。相比于滅活疫苗和弱毒活疫苗，亞單位疫苗只含有病原體中特定的抗原組分，同時其既不能在體內(nèi)復制又不包含致病毒力因子，因此誘發(fā)疾病的可能性較小，具有更高的安全性。然而亞單位疫苗的所攜帶的抗原表位較少，與弱毒活疫苗相比，其免疫原性低，需要加強劑量以維持長期免疫力。

2 基于反向疫苗學的新型疫苗研究

反向疫苗學是一種基于基因組測序和生物信息學的新型疫苗研發(fā)方法。與傳統(tǒng)的疫苗研發(fā)思路不同，反向疫苗學更注重病原體抗原的預測與篩選，其研發(fā)思路主要是先利用生物信息學工具分析全基因組測序數(shù)據(jù)中可能具有免疫原性的抗原位點，再通過表達、純化得到相應的候選疫苗進行驗證開發(fā)[2]。

2.1 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗又稱基因工程疫苗，其設計原理是整合編碼具有抗原性質(zhì)的基因，利用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等具有表達外源基因特性的原核或真核表達系統(tǒng)表達相應的蛋白或多肽，經(jīng)分離提純后制得疫苗。高效的異源表達系統(tǒng)不僅彌補了病原體抗原物質(zhì)量短缺的問題，還保證了疫苗的高度特異性。此外，這類疫苗規(guī)避了傳統(tǒng)的亞單位疫苗的病原體培養(yǎng)問題，在生產(chǎn)過程中避免了生物污染，滿足了疫苗研發(fā)過程中的安全性需求。

2.2 合成多肽疫苗

合成多肽疫苗是將比對得到的病原體天然抗原決定簇通過化學合成的方法合成相應的多肽或肽鏈所制成的一類疫苗。這類合成多肽與天然抗原決定簇相似，其能夠在宿主細胞表面被MHC Ⅰ型和MHC Ⅱ型分子遞呈，進而被CD8+ T細胞或CD4+ T細胞識別并殺傷，從而達到免疫或治療的目的[3]?；瘜W合成多肽方法成熟、成本低、操作簡潔，且不會引入活細菌、病毒、毒素等生物材料，避免了生物性的感染或中毒，同時短肽的穩(wěn)定性和可編輯性強，具有良好的激活免疫應答的能力。

2.3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗與重組亞單位疫苗類似，均是利用改造的載體進行病原體抗原物質(zhì)的異源表達，但是重組活載體疫苗是將活載體直接注射到機體中，利用活載體可以自我復制的特性來增強免疫原的穩(wěn)定性、延長儲存期。常見的病毒活載體包括牛痘病毒和腺病毒，細菌活載體有卡介苗、乳酸桿菌、大腸桿菌等。除了注射方式外，重組活載體疫苗還可以采用口服、滴鼻等多種方式進行免疫，免疫形式更加多元，操作也更加簡便。目前，常見的利用基因敲除方法所構(gòu)建的基因缺失弱毒疫苗本質(zhì)上也屬于重組活載體疫苗的一種，即通過敲除病原體的毒力基因或抑制其表達以降低病原體的致病力。但與弱毒苗類似，基因缺失弱毒疫苗也存在毒力返強和病毒抗原漂移、轉(zhuǎn)移的隱患[4-5]。

2.4 重組病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒是一種由細胞分泌并自組裝的結(jié)構(gòu)蛋白所形成的納米級顆粒。人們通過對目標病毒進行基因測序獲悉相應具備免疫原性的蛋白，并將其克隆、與高效的表達載體連接隨之轉(zhuǎn)化到表達體系中，以此獲得結(jié)構(gòu)蛋白。所表達的結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)表達體系中各種化學鍵和非化學鍵作用，能夠自組裝成球形、錐形等不同形態(tài)的病毒樣顆粒，將這些病毒樣顆粒進行病毒純化后即可獲得可用于免疫的病毒樣顆粒。這些病毒樣顆粒具有病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，但不含有活性病毒基因組，這使其在宿主機體內(nèi)可以被免疫系統(tǒng)識別但不能進行自我復制，大大提高了疫苗的安全性，是一種理想的疫苗形式。但由于病毒樣顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)配套工藝尚未完善，這類疫苗目前僅有部分市售，有待從實驗室大規(guī)模走向市場[6]。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗是指利用含有特定蛋白編碼基因的質(zhì)粒所制備的疫苗，這些質(zhì)粒能夠整合到機體細胞中通過細胞自身轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程表達出相應的抗原蛋白，從而激活機體免疫應答。作為一種新型疫苗，核酸疫苗在獸用疫苗領域的探索十分深入，取得的一系列成果也令人矚目[7]。與其它基因工程疫苗相比，核酸疫苗的研制周期更短，生物安全系數(shù)更高，但受限于核酸及質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，需要更嚴苛的保存和制備環(huán)境，同時外源基因如何更好地與宿主基因組整合依然是需要解決的問題[8-9]。

3 新型疫苗設計的展望

盡管傳統(tǒng)疫苗技術存在著安全性不高、免疫程序繁瑣等弊端，但不可否認傳統(tǒng)疫苗在疫病防控中確實起到了積極作用。在新型疫苗設計的過程中，根據(jù)各類疫苗的特性揚長避短，可設計出很多實用性較高的新疫苗。

基于傳統(tǒng)疫苗研發(fā)的正向思維，在已有疫苗的基礎上可以針對抗原物質(zhì)進行優(yōu)化以提高免疫效果。首先是對已知抗原的優(yōu)化，目前針對細菌病原開發(fā)的蛋白多糖復合物疫苗是一類亞單位疫苗，其將表達的蛋白與細菌的多糖抗原結(jié)合，以實現(xiàn)多糖抗原的延時增效[6]。此外，注射抗原及其特異性抗體復合物亦可增強吞噬細胞的抗原攝取能力和抗原呈遞細胞的遞呈能力，誘導機體產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫應答[10-11]。

除了優(yōu)化抗原外，如何優(yōu)化抗原的遞送系統(tǒng)也是目前研究的一大熱點。近年，人們在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)細菌分泌的外膜囊泡可以作為疫苗遞送的載具。外膜囊泡的直徑僅有20～200 nm，富含外膜蛋白、脂多糖等細胞膜成分，這些物質(zhì)都是天然的抗原，具有很好的免疫原性[12-13]。在2018年，祝壯[14]利用大腸桿菌外膜囊泡成功構(gòu)建了遞呈胸膜肺炎放線桿菌GalT蛋白的外膜囊泡疫苗，經(jīng)驗證該疫苗能達到87.5%的免疫保護率，并有效激活了小鼠的細胞免疫。除外膜囊泡外，納米材料優(yōu)越的遞呈作用也是疫苗佐劑的研發(fā)方向，如納米金可加速抗原向淋巴結(jié)等部位的遷移和富集，促進免疫應答[15]，樹突狀介孔有機硅納米粒子包被細菌外膜囊泡后所誘導的抗體滴度顯著高于單一外膜囊泡免疫等[16]。這些案例提示，將納米材料與含有特定抗原的外膜囊泡相結(jié)合，可能是促進疫苗增效的一種方式。

現(xiàn)代疫苗技術不僅要優(yōu)化已知抗原，開發(fā)免疫增強劑，更是對未知病原及未知抗原的挖掘與分析?；诜聪蛞呙鐚W思路，不僅要在同一階段面對多重感染威脅時，根據(jù)各病原的流行特點創(chuàng)制多聯(lián)免疫疫苗，實現(xiàn)“一針多免”的目標，還要針對同一病原體的不同血清型或基因型研發(fā)能產(chǎn)生交叉免疫的疫苗。因此，基于比較基因組學、蛋白質(zhì)組學研究等分子生物學工具進行比對分析，挖掘具有交叉免疫保護的抗原物質(zhì)或抗原表位是疫苗研發(fā)的基礎。

“反向疫苗學2.0”的思路是在自然感染和獲得性免疫的模型中篩選出特異性抗體模型，進而通過結(jié)構(gòu)生物學方法篩選可能的抗原抗體結(jié)合位點，從而設計相關的疫苗，這種思路與結(jié)構(gòu)生物學的目的不謀而合。近年來人工智能算法搭配分子對接技術、AlphaFold2等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)演算工具的普及使得疫苗的快速研發(fā)成為可能。利用計算機強大的算法預測抗原抗體結(jié)合域并反向驗證，或利用結(jié)構(gòu)生物學的相關工具如X-晶體衍射、冷凍電鏡等對抗原抗體結(jié)合過程進行直接觀察，可以得到抗原表位設計的豐富

信息。

除了對病原體的直接研究外，病原體與機體間的相互作用近年來也備受關注。人們將高通量測序與系統(tǒng)生物學交叉融合，利用高通量測序的結(jié)果持續(xù)分析機體免疫系統(tǒng)在免疫前后的差異變化，動態(tài)地監(jiān)測疫苗研發(fā)各個階段的安全性及有效性，以促進疫苗的合理設計。此外，分析病原體與宿主在相互作用間的基因組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等組學數(shù)據(jù)在篩選重要的抗原靶標及抗原表位中也具有非常重要的作用，免疫組學作為新興學科必將對新型疫苗的設計研發(fā)起到指導作用[2]。

4 結(jié)語

疫苗的發(fā)展史是人類對微生物認知過程的縮影。從病原微生物的分離鑒定培養(yǎng)到亞單位組分的運用，從基因工程技術到組學分析技術，再到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確解析，每一次疫苗技術的突破都離不開對病原體和宿主的不懈探索。盡管疫苗技術日趨成熟，但仍然有很多動物疫病和人類傳染病領域尚未被涉及。新冠疫情為世界公共衛(wèi)生敲響了警鐘，人們對“同一個健康”的理念愈發(fā)深刻，在疫苗創(chuàng)制上，獸醫(yī)工作者應是與人醫(yī)工作者同一個賽道，通過各學科的交叉融合，創(chuàng)新創(chuàng)造新的疫苗。

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