摘 要：采用批式發(fā)酵方式，考察菊芋秸稈與豬糞在不同溫度（20、25、37 ℃）下共消化特性及關(guān)鍵微生物變化情況。結(jié)果表明：不同溫度下菊芋秸稈與豬糞共消化時(shí)均具有明顯的物料協(xié)同作用，且共消化能在一定程度上緩解低溫導(dǎo)致的甲烷產(chǎn)率低問題。同時(shí)，不同溫度下共消化的最適配比不同，溫度越高最適配比的豬糞含量越高。37 ℃時(shí)，菊芋秸稈與豬糞質(zhì)量配比為1∶4時(shí)獲得最大積累甲烷產(chǎn)量，為332.29 mL/g VS；而在20和25 ℃時(shí)，菊芋秸稈與豬糞配比分別為1∶1和1∶2時(shí)最大。微生物分析顯示多數(shù)優(yōu)勢細(xì)菌類群隨溫度的升高其相對(duì)豐度也升高，Syner-01和Chirstensenellaceae-R-7-group等類群在共消化樣品中相對(duì)豐度較高。溫度對(duì)古菌群落變化影響顯著，隨著溫度的降低，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌—產(chǎn)甲烷菌屬相對(duì)豐度增加；且在不同溫度下，共消化系統(tǒng)能夠促進(jìn)不同類型產(chǎn)甲烷菌（甲烷八疊球菌屬、甲烷短桿菌屬和甲烷桿菌屬）的富集。

關(guān)鍵詞：甲烷；農(nóng)業(yè)廢棄物；共消化；溫度；協(xié)同作用；微生物群落

中圖分類號(hào)：X705" " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引 言

中國作為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國，各類農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量可達(dá)10億t［1］，其中，菊芋秸稈畝產(chǎn)量為4～5 t，是極佳的生物質(zhì)資源［2］。然而目前大部分菊芋秸稈仍被隨意堆放或露天燃燒，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。同時(shí)，中國養(yǎng)殖業(yè)每年產(chǎn)生的畜禽糞便總量高達(dá)38億t［3］，其中生豬出欄數(shù)已超過4億頭，年產(chǎn)糞污量占比巨大。而豬糞中含有大量未消化的蛋白質(zhì)等有機(jī)物，同樣能被再利用［4］。未妥善處理的豬糞也易造成大氣及水體污染，對(duì)人類社會(huì)生產(chǎn)生活產(chǎn)生影響。在此背景下，厭氧消化作為一種可持續(xù)的、環(huán)境友好型技術(shù)的重要性日漸凸顯，對(duì)秸稈和糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用具有重要意義［5］。特別是將二者進(jìn)行共消化處理時(shí)，不僅能彌補(bǔ)單一原料降解的局限性，還能改善消化環(huán)境，提升甲烷產(chǎn)率，更能有效避免各類廢棄物堆積造成的污染［6］。

目前中國多數(shù)厭氧消化反應(yīng)器都是在中溫或高溫條件下運(yùn)行的［7］，低溫領(lǐng)域的研究相對(duì)較少。由于中國北方冬季氣溫低，特別是青藏高原，晝夜溫差大，對(duì)熱量的保持能力較弱，導(dǎo)致沼氣池產(chǎn)氣性能低。同時(shí)，從性價(jià)比角度考慮，低溫反應(yīng)器能耗低、運(yùn)行成本不高，更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但低溫厭氧消化可能會(huì)破壞微生物間原有的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)消化過程造成負(fù)面影響，導(dǎo)致有機(jī)物降解效率下降［8］。共消化則可降低反應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度的需求，特別是適當(dāng)?shù)呐浔饶茉谝欢ǔ潭壬蠌浹a(bǔ)低溫脅迫造成的產(chǎn)氣率低問題［9］。李敦杰等［10］發(fā)現(xiàn)共消化能改善低溫環(huán)境下的產(chǎn)甲烷性能。然而，迄今為止，在中低溫環(huán)境下描述不同配比對(duì)共消化特性與微生物群落差異的研究較少。因此，本研究以菊芋秸稈和豬糞為原料在不同溫度（20、25、37 ℃）下進(jìn)行共消化試驗(yàn)，旨在考察溫度對(duì)不同底物配比條件下共消化特性及微生物群落特征的影響，以期為中低溫下農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菊芋秸稈取自青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝創(chuàng)新基地。風(fēng)干后粉碎過8目，陰涼通風(fēng)處保存?zhèn)溆?。豬糞采自青海裕福畜牧業(yè)發(fā)展有限公司。接種污泥取自貴德縣以羊糞為原料運(yùn)行穩(wěn)定的農(nóng)用沼氣池。原料及接種物特性見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用全自動(dòng)甲烷潛力測試儀（MultiTalent 203）進(jìn)行厭氧消化試驗(yàn)。將菊芋秸稈（記為G）與豬糞（P）按5種質(zhì)量比混合（基于VS）：4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，并依次記為G4P1、G2P1、G1P1、G1P2、G1P4。另設(shè)置單獨(dú)添加菊芋秸稈和豬糞的處理組分別記為G和P。設(shè)定接種物與物料添加總量為400 g，接種比為2∶1（基于VS），各處理的物料添加量見表2。設(shè)定自動(dòng)攪拌系統(tǒng)每隔3分鐘攪拌一次，每次攪拌時(shí)長為1 min，水浴鍋溫度控制在（20±0.5）、（25±0.5）、（37±0.5） ℃。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)平行樣，另設(shè)置純接種污泥作為空白對(duì)照。厭氧消化周期為25 d。

1.3 指標(biāo)檢測

采用烘干法測定總固體（total solid， TS）和揮發(fā)性固體（volatile solid， VS）；采用元素分析儀（Flash SMART）測定全碳和全氮含量；采用pH計(jì)（pHS-2F）測定pH值；采用纖維洗滌劑法測定木質(zhì)纖維素含量［11］。

1.4 動(dòng)力學(xué)分析

采用修正的Gompertz模型對(duì)累積甲烷產(chǎn)量進(jìn)行擬合處理：

[M=P·exp-expRm·eP·（λ-t）+1] （1）

式中：[M]——累積甲烷產(chǎn)量，mL/g VS；[P]——產(chǎn)甲烷潛力，mL/g VS；[Rm]——最大產(chǎn)甲烷速率，mL/（g?d） VS；[λ]——遲滯時(shí)間，d；[t]——消化時(shí)間，d。

1.5 微生物分析

選取各溫度下G組、P組和共消化最優(yōu)組共計(jì)9個(gè)樣品交付杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行高通量測序分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)共消化產(chǎn)甲烷潛力的影響

2.1.1 日產(chǎn)甲烷量

由圖1可知，溫度對(duì)日產(chǎn)甲烷量影響較大。不同溫度下各處理日產(chǎn)甲烷量雖均呈先升高后降低的趨勢，但差異明顯，溫度越高發(fā)酵啟動(dòng)越快。在整個(gè)反應(yīng)周期中，各處理均出現(xiàn)一個(gè)明顯的產(chǎn)甲烷高峰。20 ℃時(shí)，各處理產(chǎn)甲烷高峰集中在11～16 d，前期日產(chǎn)甲烷量較少，啟動(dòng)較慢。37 ℃時(shí)，各處理產(chǎn)甲烷高峰集中在2～5 d，即發(fā)酵啟動(dòng)后微生物就開始降解原料中的有機(jī)物，在前期大部分可利用的有機(jī)物就被消耗完畢。25 ℃時(shí)，各處理日產(chǎn)甲烷高峰集中在6～9 d，介于20～37 ℃之間。同時(shí)，不同溫度下獲得日產(chǎn)甲烷最大峰值的物料配比也不同。20、25和37 ℃下日產(chǎn)甲烷最大峰值的配比分別為P、G1P1和G2P1處理，其值分別為94.40、186.13和223.79 mL。此外，同溫度下共消化各處理的日產(chǎn)甲烷峰值明顯高于G處理，且共消化各處理甲烷高峰持續(xù)的時(shí)間較G處理也更長。

2.1.2 累積甲烷產(chǎn)量

不同溫度下，均為P處理累積甲烷產(chǎn)量最高，G處理最低，且不同溫度下共消化各處理累積甲烷產(chǎn)量均顯著高于G處理（[plt;0.05]），如圖2所示。說明不同溫度下共消化具有較好的物料協(xié)同作用。然而不同溫度下共消化的最適配比不同，37 ℃下，隨著豬糞添加量的增加，共消化累積甲烷產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)菊芋秸稈與豬糞配比為1∶4時(shí)（G1P4）最大，為332.29 mL/g VS，較G處理和共消化累積甲烷產(chǎn)量最低配比（G4P1）處理分別提高了80.72%和18.25%。20和25 ℃時(shí)，隨著豬糞添加量的增加，共消化累積甲烷產(chǎn)量均呈先升高后降低的趨勢，且分別當(dāng)菊芋秸稈與豬糞配比為1∶1（G1P1）和1∶2（G1P2）時(shí)最大，分別為173.75和280.14 mL/g VS，分別較G處理和最低配比（G4P1）處理提高了70.76%和22.39%、106.78%和31.21%。

值得注意的是，共消化能在一定程度上緩解由低溫導(dǎo)致的甲烷產(chǎn)率低問題。如圖2所示，各溫度下G處理累積甲烷產(chǎn)量雖存在顯著差異（[plt;0.05]），但20 ℃下共消化各處理累積甲烷產(chǎn)量均高于25 ℃的G處理，且20 ℃下G2P1、G1P1、G1P2、G1P4與25 ℃的G處理差異顯著（[plt;0.05]）。類似的，25 ℃下共消化各處理累積甲烷產(chǎn)量均顯著（[plt;0.05]）高于37 ℃的G處理。同時(shí)，盡管各溫度下均為P處理累積甲烷產(chǎn)量最高，但20 ℃和25 ℃下共消化最佳配比G1P1和G1P2僅比同溫度下P處理分別低了0.78%和2.13%，且與P處理之間無顯著性差異（[plt;0.05]）。此外，20、25和37 ℃時(shí)，最適配比G1P1、G1P2和G1P4對(duì)應(yīng)的C/N分別為15.95、14.93和14.38（表2）。盡管厭氧消化適宜的C/N范圍在20～30之間，但隨著環(huán)境因素、廢棄物類型以及消化底物組成的改變，其值可能有所不同［9］；且溫度提升往往導(dǎo)致最適C/N降低［10］。

2.1.3 動(dòng)力學(xué)分析

不同溫度下各處理的[R2]在0.9826～0.9996之間，說明Gompertz模型對(duì)不同溫度下各處理的產(chǎn)甲烷過程擬合較好（表3）。隨著溫度的升高，各處理[Rm]值由20 ℃的6.24～11.83 mL/（g?d）VS增加到37 ℃的17.59～39.93 mL/（g?d）VS，且不同溫度下，共消化各處理[Rm]值均高于G處理，說明提升溫度能促進(jìn)物料的產(chǎn)甲烷速率［12］；而共消化能有效提升秸稈類物質(zhì)的甲烷產(chǎn)率，Karki等［13］的研究也得到了相同的結(jié)論。同時(shí)，各處理λ隨溫度的升高而降低，反映出溫度升高時(shí)厭氧消化過程啟動(dòng)更快。此外，20、25和37 ℃下各處理達(dá)到[T80]時(shí)間分別為15～18、10～15和10～11 d，說明隨著溫度的升高，厭氧消化周期明顯縮短，與曹雷鵬等［14］研究結(jié)果一致。

2.2 微生物群落多樣性分析

不同處理共獲得9914個(gè)細(xì)菌分類的OTUs和2065個(gè)古菌的OTUs（表4）。樣品的Coverage均大于0.99，表明測序結(jié)果對(duì)物種的覆蓋全面。隨著溫度的升高，細(xì)菌和古菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均升高，說明升溫能增加微生物群落的豐富度和多樣性。對(duì)于不同配比而言，細(xì)菌中各溫度下均為純豬糞和共消化樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)相對(duì)較高，而古菌則在各溫度下的共消化樣品中各項(xiàng)指數(shù)更高，說明共消化樣品的營養(yǎng)物質(zhì)更均衡，更有利于微生物生存。

由圖3a可知，多數(shù)優(yōu)勢細(xì)菌類群隨溫度升高相對(duì)豐度也升高，如擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistota）和變形菌門（Proteobacteria）等，平均相對(duì)豐度分別由20 ℃的25.83%、15.09%、8.89%和8.49%升至37 ℃的37.64%、20.76%、11.00%和10.66%。這些細(xì)菌類群均是厭氧消化系統(tǒng)中常見的功能類群［15-16］。其中，擬桿菌門和厚壁菌門分別是所有樣品的最優(yōu)勢和次優(yōu)勢類群；互養(yǎng)菌門和變形菌門為第三優(yōu)勢類群，前者在甲烷產(chǎn)量相對(duì)較高的樣品（各溫度下的豬糞和共消化樣品）中相對(duì)豐度較高；后者在各溫度下的純豬糞樣品中相對(duì)豐度較高。

與門分類的規(guī)律相同，在屬分類水平上（圖3b），隨著溫度升高，多數(shù)優(yōu)勢類群相對(duì)豐度也升高，如發(fā)酵單胞菌屬（Fermentimonas）、DMER64、Syner-01、Chirstensenellaceae-R-7-group、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，平均相對(duì)豐度分別由20 ℃的10.02%、4.42%、6.90%、5.16%、4.39%和3.68%升至37 ℃的15.36%、12.64%、9.01%、9.72%、6.42%和5.30%。同時(shí)，由于物料配比的不同，各細(xì)菌類群的相對(duì)豐度會(huì)發(fā)生一定變化。發(fā)酵單胞菌屬和DMER64與其隸屬的擬桿菌門一樣，是所有樣品中較為優(yōu)勢的類群，主要負(fù)責(zé)碳化合物的水解［17］。Syner-01和Chirstensenellaceae-R-7-group為次優(yōu)勢類群，均在各溫度下的共消化樣品中相對(duì)豐度較高。前者能實(shí)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)水解酸化與產(chǎn)甲烷的同步促進(jìn)［18］，后者可與產(chǎn)甲烷菌在互營產(chǎn)甲烷過程中進(jìn)行直接電子傳遞，并促進(jìn)難以降解的纖維素水解［19］。嗜蛋白菌屬和假單胞菌屬為第三優(yōu)勢類群，在各溫度下的純豬糞樣品中相對(duì)豐度均較高，常在以畜禽糞便為原料的發(fā)酵系統(tǒng)中主要利用含氮底物作為能量來源產(chǎn)生乙酸［20，15］。此外，Bacteroidetes_vadinHA17_unclassified、Anaerol ineaceae_unclassified和Bellilinea雖不是優(yōu)勢類群，但均在各溫度下的共消化樣品中相對(duì)豐度較高，說明菊芋秸稈與豬糞共消化體系中增加了細(xì)菌類群的相對(duì)豐度。

溫度對(duì)古菌群落結(jié)構(gòu)變化影響顯著。如圖4a所示，甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和甲烷微菌目（Methanomicrobiales）是所有樣品的最優(yōu)勢和次優(yōu)勢類群，常在厭氧消化系統(tǒng)中作為優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌類群存在［21］。隨溫度變化二者的相對(duì)豐度變化較為明顯。其中，甲烷八疊球菌目在37 ℃各處理中平均相對(duì)豐度最高，為43.74%，隨著溫度的降低，其相對(duì)豐度也降低，在25和20 ℃各處理中平均相對(duì)豐度分別為35.51%和30.75%。甲烷微菌目豐度變化與甲烷八疊球菌目相反，在37 ℃下平均相對(duì)豐度最低，為12.78%，在20 ℃下最高，為23.19%。同時(shí)，甲烷桿菌目（Methanobacteriales）也是能參與甲烷生成的古菌類群，雖受溫度變化影響不大，但各溫度下其在共消化樣品中的相對(duì)豐度均較高。

從圖4b可看出，甲烷絲菌屬（Methanothrix）和產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium）是所有樣品的最優(yōu)勢和次優(yōu)勢類群，二者同其隸屬的甲烷八疊球菌目和甲烷微菌目變化規(guī)律一致，受溫度影響較大。甲烷絲菌屬是乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，隨著溫度的降低，其平均相對(duì)豐度從37 ℃的36.69%降至20 ℃的20.77%，說明其對(duì)溫度變化敏感，適宜生存在中溫厭氧環(huán)境中，降低溫度會(huì)導(dǎo)致其相對(duì)豐度下降。李敦杰等［10］也發(fā)現(xiàn)在廢紙板和酵母菌共消化處理中甲烷絲菌屬的相對(duì)豐度由37 ℃的82.20%降至15 ℃的59.20%。產(chǎn)甲烷菌屬是氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，隨著溫度的降低，其平均相對(duì)豐度從37 ℃的6.01%升至20 ℃的17.57%。說明產(chǎn)甲烷菌屬同樣對(duì)溫度變化敏感，且其具有特殊的生理特性和適應(yīng)性，常出現(xiàn)在低溫發(fā)酵條件下，并為系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷的最主要功能類群［22］。整體上，菊芋秸稈與豬糞共消化系統(tǒng)的古菌主要利用乙酸產(chǎn)甲烷，但隨著溫度的降低，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑增加，與張立國等［23］報(bào)道一致。同時(shí)，還有一些產(chǎn)甲烷古菌，受溫度變化影響不大，但在不同物料配比樣品中豐度存在一定差異。甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的產(chǎn)甲烷途徑主要為乙酸營養(yǎng)型，但也可利用H2/CO2和甲醇產(chǎn)甲烷［24］，各溫度下均為在共消化樣品中相對(duì)豐度較高。甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷桿菌屬（Methanobacterium）作為常見的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，各溫度下同樣在共消化樣品中相對(duì)豐度較高，說明菊芋秸稈與豬糞共消化的系統(tǒng)可引起不同類型產(chǎn)甲烷菌的富集。

3 結(jié) 論

1）不同溫度下菊芋秸稈與豬糞共消化時(shí)均具有明顯的物料協(xié)同作用，且共消化可在一定程度上緩解低溫導(dǎo)致的甲烷產(chǎn)率低的問題，提升了甲烷產(chǎn)量。不同溫度下共消化的最適配比不同，溫度越高最適配比的豬糞含量越高。37 ℃時(shí)，菊芋秸稈與豬糞配比為1∶4時(shí)積累甲烷產(chǎn)量最大，為332.29 mL/g VS；而在20和25 ℃時(shí)，菊芋秸稈與豬糞分別配比為1∶1和1∶2時(shí)最大，分別為173.75和280.14 mL/g VS。

2）多數(shù)優(yōu)勢細(xì)菌類群隨溫度的升高其相對(duì)豐度也升高，但物料配比不同，其相對(duì)豐度也會(huì)變化。如Chirstensenellaceae-R-7-group和Syner-01在共消化樣品中較高，嗜蛋白菌屬和假單胞菌屬在純豬糞樣品中較高。

3）溫度對(duì)古菌群落變化影響顯著，雖然共消化系統(tǒng)的古菌主要利用乙酸產(chǎn)甲烷，但隨著溫度的降低，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（產(chǎn)甲烷菌屬）相對(duì)豐度增加。同時(shí)，在不同溫度下，共消化系統(tǒng)能夠促進(jìn)不同類型產(chǎn)甲烷菌（甲烷八疊球菌屬、甲烷短桿菌屬和甲烷桿菌屬）的富集。

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EFFECT OF TEMPERATURE ON CO-DIGESTION CHARACTERISTICS AND MICROBIAL COMMUNITY OF Jerusalem artichoke

STRAW AND PIG MANURE

Wang Wei，Li Yi，Du Zhongping，Han Rui

（Qinghai Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology， Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University，

Xining 810016， China）

Abstract：This study employed a batch fermentation method to investigate the characteristics of methane yield and key microbial changes during the co-digestion of Jerusalem artichoke straw and pig manure at various temperatures （of 20， 25 and 37 °C）. The findings indicate a significant synergistic effect between Jerusalem artichoke straw and pig manure during co-digestion at different temperatures， effectively mitigating the decreased methane yields typically associated with lower temperatures. However， it was observed that the optimal mixing ratio for co-digestion varied with temperature， with higher temperatures corresponding to higher levels of optimally co-digested pig manure. The maximum cumulative methane yield of 332.29 mL/g VS was achieved when the ratio of Jerusalem artichoke straw to pig manure was 1∶4 at 37 °C， while the maximum methane production was obtained with different mixing ratios of Jerusalem artichoke straw and pig manure were 1∶1 and 1∶2 at 20 and 25 °C. Microbial analysis revealed that the majority of dominant bacterial community increased in relative abundance with increasing temperature， bacterial community such as Syner-01 and Chirstensenellaceae-R-7-group had higher relative abundance in co-digestion samples. Notably， the relative abundance of hydrogenotrophic methanogens， including Methanogenium， increased with decreasing temperature. Furthermore， at different temperature levels， the co-digestion system enriched distinct types of methanogenic archaea， encompassing Methanosarcina， Methanobrevibacter， and Methanobacterium.

Keywords：methane； agricultural wastes； co-digestion； temperature； synergy； microbial community