[摘要]"呼吸道傳染病是發(fā)病率較高的一類疾病，病原體檢測是該類傳染病防治的關鍵措施之一。高通量快速檢測技術可單次檢測多個樣品或在同一反應體系中同時進行多項檢測，具有速度快、準確度高等優(yōu)點。多重聚合酶鏈反應、基因測序、生物芯片技術是當前在呼吸道傳染病檢測中應用較為廣泛的高通量快速檢測技術。本文探討上述3種技術的優(yōu)缺點，并對高通量快速檢測技術的發(fā)展前景進行展望。

[關鍵詞]"高通量快速檢測技術；病原體；檢測；呼吸道傳染病

[中圖分類號]"R446.5；R51""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.36.025

呼吸道傳染病的發(fā)病率較高，其造成的疾病負擔日益加重[1-2]。呼吸道傳染病可通過飛沫、氣溶膠、直接接觸途徑傳播[3]。引發(fā)呼吸道疾病的病原體主要包括細菌、病毒和支原體等[4-5]；各種病原體引發(fā)呼吸道疾病的臨床表現十分相似，難以區(qū)分[6]。故病原體的快速檢出關系到患者的隔離和治療措施，進而影響患者的康復效果和疾病的傳播情況[7]。傳統(tǒng)病原體檢測技術操作步驟煩瑣、檢測時間較長，難以滿足當前衛(wèi)生健康工作需求，急需研發(fā)新的病原體高通量快速檢測技術。

高通量快速檢測技術是一種可單次檢測多個樣品或在同一設備體系中可同時進行多項檢測的技術，相比于其他檢測技術，高通量快速檢測技術優(yōu)勢明顯。本文重點闡述多重聚合酶鏈反應（multiplex"polymerase"chain"reaction，mPCR）、全基因組測序（whole"genome"sequencing，WGS）和生物芯片技術的原理，并分析各自的優(yōu)缺點及當前的研究現狀，為今后病原體檢測領域的快速發(fā)展提供參考。

1""mPCR技術

mPCR是在同一聚合酶鏈反應（polymerase"chain"reaction，PCR）體系里加入兩對及以上引物并擴增出多個核酸片段的技術，其反應原理、所需試劑和操作步驟與傳統(tǒng)PCR無異。傳統(tǒng)PCR應用一對引物擴增產生一個核酸片段，僅用于單一病原體檢測。mPCR既保留傳統(tǒng)PCR特異性強、靈敏度高的特點，又能快速檢測多種病原體，是一種經濟、高效的檢測方法[8-11]。在檢測數量方面，mPCR通?？蓪崿F一個病原體2～4個基因或2～4個目標病原體的同時檢測，甚至更多。Miringu等[12]開發(fā)一種用于檢出包括肺炎克雷伯菌等11種細菌的mPCR檢測方法。另有學者設計一種基于擴增子基因組富集的mPCR高通量引物及能創(chuàng)建LRRK2基因編碼區(qū)域的二代測序（next-generation"sequencing，NGS）面板，并使用該面板研究354個DNA樣本，其中至少有30個讀數覆蓋目標區(qū)域97.4%的中位覆蓋率[13]。Oh等[14]研究證實，應用mPCR能快速檢測（約1h）包括百日咳在內的病原體。

雖然mPCR優(yōu)勢顯著，應用廣泛。但諸多因素會影響mPCR的檢測結果[15]；樣品成分較復雜（如病原體含量低或含有其他物質）易導致檢測靈敏度降低，出現假陰性結果。當前研究方向主要是通過優(yōu)化mPCR的反應條件，并與其他技術聯合應用以進一步完善檢測體系，提高其在檢測過程中的有效性與可行性。有學者提出基于mPCR的呼吸道病毒納米孔測序快速檢測技術，該技術簡單快捷，可實時獲取擴增片段的序列信息，特異性強，靈敏度高[16]。有學者將mPCR與其他高通量測序技術結合，設計適用于人腺病毒亞型全基因組擴增的mPCR引物，通過Illumina"NGS技術進行高通量測序[17]。Zhao等[18]利用嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe"acute"respiratory"syndrome"coronavirus"2，SARS-CoV-"2）非變異體及合成的攜帶SARS-CoV-2變異體的質粒核酸序列，建立基于mPCR擴增產物單堿基質量探針延伸的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜方法，該方法可實現多位點同時檢測，解決WGS技術耗時、成本高、技術要求高的問題。為克服mPCR難以區(qū)分死病原體和活病原體的缺陷，有學者通過加入疊氮溴化乙錠、疊氮溴化丙錠的方式使死病原體的DNA分子在擴增時被抑制，從而提高mPCR檢測活病原體的準確率[19]。

2""基因測序技術

WGS通過半導體感應器對DNA復制時產生的離子流進行檢測，主要用于對未知病原體進行基因組測序，可從未知病原體標本中快速、低成本檢測并識別未知病原體。該技術的主要優(yōu)點是讀數時間更長、樣本制備更簡單，無須培養(yǎng)，無須進行PCR擴增，還可實現單分子測序。宏基因組二代測序（metagenomics"next"generation"sequencing，mNGS）技術可直接利用患者標本進行核酸檢測以獲得病原體的基因序列，無須培養(yǎng)、無偏好性、陽性率高。目前，測序技術已發(fā)展出長讀測序、單細胞基因組學和納米孔測序技術[20]。應用廣泛的Illumina測序平臺作為NGS技術的典范，利用邊合成、邊測序的大規(guī)模并行測序原理，檢測結果準確、穩(wěn)定。Heikema等[21]使用Illumina"MiSeq和Oxford"Nanopore"16S"rRNA基因測序技術對59個鼻拭子進行白喉棒狀桿菌測序，結果表明Illumina平臺檢測鼻腔微生物群細菌屬的能力與納米孔測序平臺相當。Winand等[22]使用特征明確的參考樣本，對第二代（Illumina）和第三代（Oxford"Nanopore"Technologies）測序技術的16s靶向基因組學進行比較評估，結果表明該技術能可靠地識別細菌屬，快速分析混合樣品而無須任何培養(yǎng)步驟。Illumina公司推出的NovaSeq"6000系統(tǒng)，具有更強的靈活性，可將多種類型的測序試劑盒與雙流動槽模式結合，實現高擴展性的測序輸出，匹配從完整基因組測序到宏基因組學分析的廣泛應用[23]。

相對于WGS技術，NGS技術的成本更低、效率更高，檢測結果一致。Yang等[24]采用靶向二代測序（targeted"next-generation"sequencing，tNGS）技術檢測支氣管灌洗液中的肺結核，結果表明tNGS技術的敏感度高、特異性強，在病原體檢測中具有獨特優(yōu)勢。Murphy等[25]使用+NGS技術直接檢測耐藥結核分枝桿菌，對55個結核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進行tNGS檢測，并將結果與配對患者培養(yǎng)物的WGS檢測結果進行比較，發(fā)現82%的涂片陽性原發(fā)標本生成完整或部分易感性譜，tNGS識別的抗性突變與WGS一致。Miah等[26]建立一種直接從臨床標本中對流感病毒亞型進行測序的方法，成功對19個甲型流感病毒陽性臨床樣本進行WGS檢測，所有片段的覆蓋率為100%，從提取RNA到獲得完成的序列僅需24h。然而有學者提出，雖然tNGS能檢測出少數變異基因序列及檢測出比焦磷酸測序（pyrosequencing，PSQ）更多的靶標，但PSQ仍是部分三級實驗室的診斷選擇[27]。

納米孔技術通過在膜的正向和反向分別將陰極和陽極施加到溶液中實現病原體的檢測。帶負電荷的生物分子（如DNA）在施加電壓的電泳力作用下穿過膜上的孔。不同分子通過孔隙轉移時可捕獲不同水平的電流，利用計算機輔助工具進行病原體檢測。納米孔測序技術具有便于攜帶、實時測序、超長讀數等優(yōu)點。近年來，納米孔測序技術發(fā)展迅速。曹藍等[28]利用納米孔測序技術對新型重組H3N2禽流感病毒進行測序，發(fā)現該病毒與H5N6禽流感病毒發(fā)生基因重組。納米孔測序技術的錯誤率較高（5%～20%）[29]。有學者基于高級計算技術的堿基讀取方法，設計增加覆蓋度實現更高測序準確度的方案[30]。綜上，基因測序技術具有高精度、高速、低成本解讀等優(yōu)點，但也存在后續(xù)分析困難和設備高昂的問題，在大規(guī)模推廣應用中存在一定難度。

3""生物芯片技術

基因芯片又稱為DNA微陣列，是分子生物學領域廣泛應用的一種重要的體外分子診斷工具[31]?；蛐酒晒潭ㄔ诠腆w玻璃載玻片或硅基片上的微小DNA點組成，可同時分析數千個基因，以探索基因調控機制、識別生物標志物和檢測病原體。由于其具有平行化、自動化和微型化優(yōu)點，并可同時在一張芯片上進行多個目標病原體的檢測，且試劑消耗少等特點而廣泛應用于不同檢測環(huán)境中。

生物芯片主要用于傳染病的診斷、治療和預防，其發(fā)展依賴于傳感化學、微陣列制造（電子技術）和信息技術等多種技術。生物芯片技術可直接用于臨床標本中耐藥結核病的診斷[32-33]。采用生物芯片技術進行分枝桿菌種類鑒定研究證明生物芯片技術可快速鑒定痰標本中大多數分枝桿菌[34]。生物芯片技術在小型化、便攜式研發(fā)方面發(fā)展較快。Wang等[35]開發(fā)的集成便攜式低成本定制檢測器和新型微孔陣列生物芯片平臺，可快速準確地檢測SARS-CoV-2，并在25min內實現比色讀數。基于集成的連續(xù)流PCR和電泳生物芯片原理，Li等[36]制造一種用于快速診斷病原體的便攜式一體化微流控裝置，實現快速DNA擴增和現場PCR產物檢測，可在2min31s內完成擴增，3min43s內完成PCR產物檢測。Zhang等[37]報道的用于直接檢測RNA的微流控RNA芯片（微芯片原型）具有高特異性（區(qū)分單核苷酸差異）、快速性、準確性、核酸酶抗性和可重復使用性等特點。

近年來，生物芯片技術向電化學芯片、磁光芯片、化學蝕刻方面發(fā)展，進一步提高芯片技術的檢測效率。Manickam等[38]介紹一種用于高性能分子檢測的互補金屬氧化物半導體集成電化學生物芯片，可進行基于陣列的DNA檢測分析及DNA熔解分析和實時無標記DNA雜交檢測。Chen等[39]開發(fā)一種基于γ-Fe2O3@Au核/殼磁性納米顆粒的Cotton-Mouton效應的磁光生物芯片，用于檢測SARS-CoV-2，整個測試時間僅需50min。Gogianu等[40]開發(fā)的檢測平臺，使用一部納米銀催化刻蝕法在硅納米線基底上組裝3D微陣列芯片，可實現最佳信號強度（4.303，3.7）和變異系數（3.12%，2.59%），該平臺在DNA檢測方面有巨大潛力。

雖然生物芯片在病原體檢測方面具有很大的優(yōu)勢，但現有的單個生物芯片檢測敏感度低、重復性差、分析范圍窄，需要進行技術集成才能大規(guī)模運用。芯片傳感器和低功耗數據傳輸的限制阻礙生物芯片技術的發(fā)展[41]。

4""小結與展望

高通量快速檢測技術作為一種新型技術，具有傳統(tǒng)檢測方法沒有的優(yōu)勢，成為病原微生物領域的研究熱點。各種檢測方法各有利弊，仍處于完善階段。在今后的發(fā)展過程中，需解決以下問題：第一，病原體含量較低。多數情況下，樣品中病原體含量很低，且存在其他干擾成分，需對樣品進行前處理或培養(yǎng)。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間較長，因此需開發(fā)一批可快速富集多種目標病原體的培養(yǎng)基，這是實現高通量快速檢測的關鍵。第二，區(qū)分假陽性/陰性結果。在病原體檢測過程中，已死亡無活性的病原體仍可被檢出，以致出現假陽性。有些亞致死細胞經培養(yǎng)后未修復，導致無法檢出，以致出現假陰性。因此，需要對現有方法進行改進以有效區(qū)別有無活性的病原體，從而避免檢測中出現假陽性/陰性結果，進一步提高檢測結果的準確性。第三，提高定量分析準確度。很多檢測技術僅能進行半定量或相對定量分析，而目標病原體的快速準確定量分析則與疾病的后續(xù)處置密切相關。隨著檢測技術的發(fā)展，呼吸道病原體的高通量快速檢測必將成為現實。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–08–28）

（修回日期：2024–12–10）