摘要：本研究探究了4個不同基礎(chǔ)材料單倍體在不同地點(diǎn)的自然加倍率，以及經(jīng)過不同除草劑處理下的單倍體加倍效果之間的差異。結(jié)果表明，海南試驗(yàn)點(diǎn)的自然加倍率要明顯高于吉林試驗(yàn)點(diǎn)的自然加倍率，說明海南的氣候和光照等適宜的環(huán)境條件更有利于玉米單倍體的自然加倍，且不同品種的單倍體自然加倍率有很大差異，說明不同基礎(chǔ)材料由于遺傳背景的差異對加倍效果產(chǎn)生不同影響；化學(xué)除草劑加倍處理下，濃度為80 μmol·L-1炔苯酰草胺及60 μmol·L-1安磺靈的加倍效果最好，而高濃度安磺靈的加倍率明顯低于炔苯酰草胺；同為80 μmol·L-1炔苯酰草胺處理下的針刺生長點(diǎn)法的加倍率稍高于浸芽法的加倍率。

關(guān)鍵詞：玉米 單倍體 自然加倍 除草劑加倍玉米作為我國不可或缺的糧食作物，其新品種選育的迫切性有目共睹，然而常規(guī)的育種技術(shù)育種周期普遍較長，通常需要經(jīng)過6-10代的自交才能選育出優(yōu)良的新品種[1]。單倍體育種技術(shù)在很大程度上規(guī)避了常規(guī)育種耗時長、消費(fèi)高的弊端，做到高效又節(jié)省成本，通過兩代的培育就可以得到純合的自交系，并且該技術(shù)還能夠選育出具有植株高大、花期長、花粉量大、抗病蟲害等優(yōu)良性狀的新品種[2]。目前我國常規(guī)的育種技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在玉米育種行業(yè)的普及，但對玉米單倍體育種技術(shù)的研究起步較晚，與國外的發(fā)達(dá)國家依然存有差距。國外發(fā)達(dá)國家的某些種子公司已經(jīng)建立了全面的單倍體育種體系，并能夠進(jìn)行大規(guī)模的工廠化育種。但我國的一些育種公司與科研院所還無法達(dá)到規(guī)?；N。還存在著由于單倍體加倍率低導(dǎo)致玉米單倍體育種技術(shù)發(fā)展受阻的問題[3]。為推動單倍體育種技術(shù)的發(fā)展，突破發(fā)達(dá)國家的技術(shù)封鎖，單倍體加倍率低已成為各育種單位和育種家重點(diǎn)研究和攻克的方向。

玉米單倍體育種技術(shù)的自然加倍法能夠節(jié)約育種的成本，減輕對自然環(huán)境的危害，加倍環(huán)節(jié)簡單快捷，受到廣泛的青睞。玉米單倍體的化學(xué)加倍法使用最多的化學(xué)藥劑是秋水仙素，但秋水仙素具有較高的毒性，容易危害植株的生長發(fā)育甚至死亡并且處理程序煩瑣，也可能對環(huán)境造成污染，影響土壤和水源從而破壞生態(tài)環(huán)境和生態(tài)平衡[4]。為了玉米單倍體育種技術(shù)的發(fā)展和環(huán)境的保護(hù)，必須尋找安全的化學(xué)試劑，本研究主要使用的除草劑為安磺靈和炔苯酰草胺，這兩種除草劑與秋水仙素相似，同樣具有使單倍體加倍的效果，但目前對這兩種除草劑的研究相對較少。除這兩種除草劑之外，甲基胺草磷和氟樂靈也是常用于單倍體加倍的除草劑[5]。根據(jù)前人的研究表明，這四種除草劑雖然都具有抑制細(xì)胞分裂的效果，但每種除草劑的加倍效果不同，并且不同基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)出的單倍體對不同除草劑的適應(yīng)程度也不同[6]。

本研究不僅探索不同除草劑的加倍效果，對化學(xué)加倍的方法也進(jìn)行了一定程度的研究。常用的化學(xué)加倍方法有浸芽法、浸根法、針刺生長點(diǎn)法及滴心葉法。本試驗(yàn)采用的化學(xué)加倍方法是浸芽法和針刺生長點(diǎn)法。浸芽法是將玉米單倍體的幼芽浸泡在含有藥劑的溶液中，以促進(jìn)其染色體加倍，而針刺生長點(diǎn)法是在單倍體幼苗的生長點(diǎn)處進(jìn)行針刺處理，并配合使用藥劑處理，以實(shí)現(xiàn)染色體加倍。這兩種的原理與浸根法基本相似，但處理的目標(biāo)不同，主要受處理時間的影響。滴心葉法是將藥劑溶液滴在單倍體玉米的心葉上，操作較為煩瑣。又有眾多研究表明，本試驗(yàn)在吉林和海南兩地進(jìn)行，分別采用自然加倍法和化學(xué)加倍法研究單倍體的加倍率。在化學(xué)加倍法中，使用炔苯酰草胺和安磺靈兩種除草劑，通過浸芽法和針刺生長點(diǎn)法測定不同除草劑和不同處理方法下的玉米單倍體加倍率，旨在探究更適合單倍體加倍的除草劑和處理方法，從而為培育新品種提供更有利的試驗(yàn)條件，并為玉米單倍體育種提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)將4個單倍體品種的籽粒作為試驗(yàn)材料進(jìn)行玉米單倍體加倍試驗(yàn)，分別是九單525、九單918、九單186和九單200。以上4個基礎(chǔ)材料為母本，吉科誘115為父本，在前一季玉米種植前進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，收獲的單倍體籽粒為單倍體材料。由于本研究采用自然加倍法、浸芽法以及針刺生長點(diǎn)法三種試驗(yàn)方法，所以將四種單倍體種子分為三組進(jìn)行研究，分配種子時要進(jìn)行隨機(jī)挑選，平均每組1000粒，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。而用于自然加倍的單倍體籽粒分為兩部分種植，一部分位于吉林省吉林市吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院吉林玉米育種試驗(yàn)地（吉林試驗(yàn)點(diǎn)）種植，另一部分位于海南省三亞市崖州區(qū)南濱農(nóng)場的南繁基地試驗(yàn)地（海南試驗(yàn)點(diǎn)）進(jìn)行種植。采用安磺靈和炔苯酰草胺兩種除草劑，使用浸芽法和針刺生長點(diǎn)法進(jìn)行的除草劑加倍試驗(yàn)均在吉林試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行。安磺靈和炔苯酰草胺購自于長春百金生物科技有限公司。

（二）單倍體鑒定

使用籽粒Navajo標(biāo)記鑒定，紫頂白胚的為單倍體籽粒。該方法是使用具有遺傳標(biāo)記基因的誘導(dǎo)系進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)系與基礎(chǔ)材料進(jìn)行雜交，在單倍體籽粒中導(dǎo)入Navajo標(biāo)記。正常二倍體籽粒為紫頂紫胚。田間苗期鑒定可以通過觀察玉米植株的生長情況，初步判斷玉米植株是否為單倍體。單倍體的葉鞘為綠色，并且葉片與正常二倍體不同，數(shù)量少、寬度狹窄、較為直立，在幼苗生長到4-5葉期時，通過觀察植株矮小瘦弱，生長勢弱的為單倍體，而正常二倍體幼苗的葉鞘為紫色，植株高大、生長勢強(qiáng)。

（三）單倍體加倍

自然加倍：在吉林試驗(yàn)點(diǎn)和海南試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行正常田間播種，使植株正常生長，并統(tǒng)一管理，當(dāng)雄穗有花粉但花藥不開裂時人為破壞花藥，讓花粉散出進(jìn)行自交授粉。

除草劑加倍：以濃度為2.5%的二甲基亞砜（DMSO）作為助滲劑，將安磺靈、炔苯酰草胺原液制成濃度分別為40、60、80和100 μmol·L-1 的溶液并將試劑瓶放置在陰暗避風(fēng)處保存待用。以九單525和九單186作為除草劑處理對象。浸芽法：將種子浸泡6h，用毛巾卷發(fā)芽法30℃催根，待根尖長至1cm時，從毛巾卷中取出種子，降低溫度到24℃，將種子放入搪瓷盤中，噴水保持濕度，用薄膜密封催芽。當(dāng)幼芽長至1.5cm時，將幼芽頂端芽鞘切掉1-2 mm，露出1個小口。將其在室溫下密閉浸泡在藥劑溶液中，浸泡后用清水沖洗60min，清洗后將其種在育苗盤中，幼苗長到4-5片葉時移栽至大田。生長期間進(jìn)行數(shù)據(jù)調(diào)查、記錄和收集，秋季收獲自交果穗，計(jì)算加倍率。針刺生長點(diǎn)法：將上述準(zhǔn)單倍體籽粒種植于田間，得到單倍體植株。待單倍體幼苗生長到三葉期時，選擇生長良好、一致的幼苗，分別用濃度為40、60、80和100 μmol·L-1 的除草劑+2.5%DMSO混合液1 mL，用微量移液器注射于幼苗莖稈盾片節(jié)處的生長點(diǎn)。

（四）統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)自然加倍法和除草劑加倍法中存活單倍體總株數(shù)與結(jié)實(shí)單倍體植株數(shù)，計(jì)算兩種方法的加倍率。加倍率計(jì)算公式如下：加倍率=（結(jié)實(shí)單倍體植株數(shù)/存活單倍體總株數(shù)）×100%。采用DPS7.1統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

二、結(jié)果分析

（一）單倍體自然加倍率分析

4個單倍體材料在兩個試驗(yàn)點(diǎn)的加倍效果如表1所示，通過數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，海南試驗(yàn)點(diǎn)的加倍效果明顯好于吉林試驗(yàn)點(diǎn)。九單525與九單186在吉林試驗(yàn)點(diǎn)的加倍率均低于0.5%，而在海南試驗(yàn)點(diǎn)能夠達(dá)到1%-4%。在4個材料之中，九單525的自然加倍效果最好，在吉林試驗(yàn)點(diǎn)的平均自然加倍加倍率為0.3%，在海南進(jìn)行自然加倍可以使平均自然加倍率提升至3%。九單186的自然加倍效果次之，在吉林試驗(yàn)點(diǎn)的加倍效果與九單525基本相似，但在海南試驗(yàn)點(diǎn)比九單186的平均加倍率低1.6%，僅僅只有1.4%。而九單918與九單200的加倍效果最差，九單200在兩個試驗(yàn)點(diǎn)的加倍率均為0%，說明九單200不適合進(jìn)行自然加倍。九單918雖然在吉林試驗(yàn)點(diǎn)的加倍率為零，但在海南的加倍率能夠達(dá)到0.6%，說明優(yōu)良的氣候環(huán)境更有利于自然加倍。結(jié)果顯示，在不同的地點(diǎn)玉米單倍體植株加倍率出現(xiàn)明顯差異，導(dǎo)致加倍率出現(xiàn)明顯差異的原因可能是不同地點(diǎn)的氣候和光照等自然環(huán)境條件影響玉米單倍體的自然加倍，吉林試驗(yàn)點(diǎn)晝夜溫差較小的逆境生態(tài)條件不利于單倍體雄穗加倍。

（二）不同基礎(chǔ)材料的自然加倍率

由表1可知，進(jìn)行試驗(yàn)的4個單倍體材料通過2年自然加倍得到的自然加倍率以九單525（1.65%）最高，九單186（1.8%）較高，九單918（0.3%）次之，九單200單倍體無論是在吉林試驗(yàn)點(diǎn)還是在海南試驗(yàn)點(diǎn)的自然加倍均未加倍成功，由此可以體現(xiàn)出基礎(chǔ)材料對單倍體自然加倍至關(guān)重要，對單倍體自然加倍率有重要影響。通過表1中也可以得出結(jié)論，4個材料由于遺傳背景的差異導(dǎo)致基因型不同，每個基礎(chǔ)材料對自然加倍的適應(yīng)程度不同。但從九單918可以看出，優(yōu)良的氣候條件對單倍體的加倍具有幫助。不同基因型基礎(chǔ)材料通過基因的控制，通常導(dǎo)致雄穗育性恢復(fù)能力較差，易出現(xiàn)花期不遇的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致玉米單倍體的加倍率差異。

（三）單倍體除草劑加倍率分析

表2可知，單倍體加倍過程中經(jīng)除草劑處理的單倍體加倍率要極顯著高于未經(jīng)除草劑處理的。根據(jù)不同的除草劑濃度分析，炔苯酰草胺是以80 μmol·L-1的加倍率最高，安磺靈以60 μmol·L-1的加倍率最高，濃度60 μmol·L-1的炔苯酰草胺和濃度40 μmol·L-1的安磺靈次之，炔苯酰草胺和安磺靈均是以濃度100 μmol·L-1的最低。高濃度的除草劑毒性大，對植株幼苗損傷較大，導(dǎo)致植株生長發(fā)育受阻甚至死亡，單倍體加倍率低。經(jīng)針刺生長點(diǎn)法處理的單倍體加倍率較浸芽法處理的單倍體加倍率稍高，可能是因?yàn)獒槾躺L點(diǎn)法是在玉米單倍體幼苗的生長點(diǎn)處進(jìn)行針刺，然后注射除草劑，使除草劑直接作用于生長點(diǎn)，從而使單倍體達(dá)到加倍，這種方法處理精確，作用更強(qiáng)。在 80 μmol·L-1濃度下，炔苯酰草胺處理的單倍體加倍率要極顯著高于安磺靈處理的（表3），說明了炔苯酰草胺更適宜于九單525和九單186單倍體加倍。

（四）不同基礎(chǔ)材料的除草劑加倍率

在用80μmol·L-1的炔苯酰草胺處理九單525與九單186時，發(fā)現(xiàn)該濃度下的炔苯酰草胺的加倍效果最好，但 80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺對九單186的加倍效果明顯高與九單525的加倍效果。80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺處理下，九單186的平均加倍率為27.2%。而九單525的平均加倍率為20.1%，加倍效果較好但在平均單倍體加倍率上還是以7.1%的差值低于九單186。并且與自然加倍法相比，九單186單倍體加倍率平均增加了136倍，而九單525的加倍率增加了 67倍（表 4）。說明不同的基礎(chǔ)材料對除草劑的加倍率高低有重要影響，用炔苯酰草胺處理時，九單186比九單525更為敏感。

三、討論

（一）不同基因型對單倍體加倍率的影響

本研究用吉科誘115在相同栽培環(huán)境下對4個基礎(chǔ)材料進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，再對4個基礎(chǔ)材料進(jìn)行單倍體加倍。通過自然加倍和除草劑加倍的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，無論是經(jīng)過自然加倍或者除草劑加倍，四個基礎(chǔ)材料的單倍體加倍率均不同。根據(jù)前人的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的基礎(chǔ)材料會對單倍體的加倍率產(chǎn)生影響，這與本試驗(yàn)結(jié)論一致。不同遺傳背景的材料對除草劑的適應(yīng)程度不同，以及具有影響加倍的基因不同，導(dǎo)致部分基礎(chǔ)材料的加倍率較高適合加倍，而部分的材料則很難進(jìn)行單倍體的加倍[7-8]。為促進(jìn)玉米單倍體育種技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究母本基因型對單倍體加倍率的影響成為主要方向之一。

（二）不同加倍劑對單倍體加倍效果的影響

玉米單倍體育種技術(shù)中自然加倍法的加倍率較低，無法滿足大規(guī)模加倍的需求，化學(xué)加倍法中常用的秋水仙素毒素強(qiáng)，影響單倍體植株的生長發(fā)育和生態(tài)環(huán)境安全。通常采用能夠通過抑制植物細(xì)胞微管組裝形成來有效干擾細(xì)胞有絲分裂的除草劑替換秋水仙素，同樣能夠達(dá)到與秋水仙素相同的加倍效果，但單倍體的加倍效果也受除草劑種類、濃度和處理方式的影響[9]。本研究比較了炔苯酰草胺和安磺靈分別用浸芽法和針刺生長點(diǎn)法處理玉米單倍體的加倍效果，表明炔苯酰草胺的濃度為80 μmol·L-1時倍效果更好，而安磺靈的濃度為60 μmol·L-1時效果更好。高濃度安磺靈的加倍率明顯低于高濃度炔苯酰草胺的加倍率，說明安磺靈的毒性更高。

四、討論

本研究表明，采用自然加倍法時，海南試驗(yàn)點(diǎn)的氣候環(huán)境更有利于種植單倍體，獲得更高的單倍體加倍率，說明優(yōu)良的氣候環(huán)境更有利于自然加倍；采用除草劑加倍時，使用濃度為 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺比安磺靈的加倍效果更好，本試驗(yàn)中的九單186比九單525更為敏感。后續(xù)可以應(yīng)用濃度為 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺，采用針刺生長點(diǎn)法處理單倍體九單186，提高其結(jié)實(shí)率，促進(jìn)形成表現(xiàn)一致的穩(wěn)定DH系，加快育種進(jìn)程。

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