摘要：為深入探究低溫環(huán)境對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）轉錄組的影響，特別關注SNP標記位點及其關聯基因SNP-Unigene在低溫脅迫條件下的作用。選擇在低溫環(huán)境和原產地條件下飼養(yǎng)的中華絨螯蟹作為研究對象，利用Illumina平臺對其肝胰腺進行轉錄組測序。使用SOAPsnp軟件對測序數據進行SNP位點檢測，并對這些SNP-Unigene進行GO、KOG和KEGG數據庫的比對及功能注釋。結果表明，在中華絨螯蟹中共發(fā)現了429 684個SNP位點，這些位點分散在22 249條SNP-Unigene上。SNP 位點的突變類型有 12 種，其中轉換SNP位點遠遠多于顛換SNP位點，而其中又以C-T類型的突變數量最為顯著。功能分析結果顯示，在低溫脅迫下，中華絨螯蟹的SNP-Unigene主要涉及細胞活動、代謝途徑和信號傳遞等關鍵生物學過程，尤其是與能量代謝相關的路徑。進一步研究篩選出了599條SNP-Unigene被注釋到了磷脂酰肌醇3-激酶信號通路等26條與信號轉導相關的通路中，以及315條SNP-Unigene被注釋到了趨化因子信號通路等22條與免疫相關的通路中。本研究為未來深入探討中華絨螯蟹在低溫脅迫條件下的分子機制提供了重要的理論依據和基礎材料。

關鍵詞：中華絨螯蟹；低溫脅迫；轉錄組測序；單核苷酸多態(tài)性；功能分析

中圖分類號：S917 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0197-07

收稿日期：2024-05-27

基金項目：貴州省教育廳科技拔尖人才項目（編號：黔教技［2022］096）；畢節(jié)市揭榜掛帥項目（編號：畢科合重大專項字［2021］1）；畢節(jié)市科學技術項目（編號：畢科聯合字［2023］48）。

作者簡介：李 青（1989—），女，山西臨汾人，博士，副教授，研究方向為水生生物學。E-mail：liqingdream@163.com。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），別稱河蟹，是我國一種重要的淡水經濟品種。隨著消費市場的不斷擴大，中華絨螯蟹的養(yǎng)殖區(qū)域已經從傳統(tǒng)的江浙地區(qū)逐漸擴展到全國范圍，包括云南、貴州、河北等地^［1］。然而，作為變溫動物，水溫對其生長、發(fā)育、繁殖、抗病能力、攝食和蛻殼等生理過程具有顯著影響。研究表明，中華絨螯蟹在不同水溫下的攝食行為差異明顯。在5～10 ℃的低溫環(huán)境中，蟹幾乎不進食；在20～26 ℃時，其攝食量達到最高水平；而當水溫超過35 ℃時，蟹的攝食活動幾乎停止。水溫也對其蛻殼和生長過程產生重要影響，通常在19～25 ℃的適宜溫度下，中華絨螯蟹能夠正常蛻殼和生長，但在低于10 ℃或高于30 ℃的條件下，生長和蛻殼會受到抑制。此外，劇烈的水溫變化同樣會影響其生長，尤其對幼蟹的影響更加顯著^［2-4］。盡管已有許多研究探討了水溫對中華絨螯蟹生長及發(fā)育的影響，但低溫脅迫對其生理生化機制的具體作用仍不明確。因此，深入研究低溫脅迫如何影響中華絨螯蟹的生理生化反應，特別是其生長、發(fā)育與適應能力，將有助于優(yōu)化養(yǎng)殖管理，提高養(yǎng)殖效益。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）是指基因組中因單個核苷酸的變化而導致的DNA序列變異，主要包括堿基的顛換和轉換。SNP具有數量眾多、分布廣泛和遺傳穩(wěn)定性高等特點，是最常見的可遺傳變異形式，也是生物進化的重要途徑^［5-7］。相較于其他分子標記技術，如限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）和簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR），SNP標記法因其檢測自動化、成本低廉和高效性等優(yōu)勢，已被廣泛應用于種質資源評估、遺傳圖譜的建立、基因定位、遺傳育種以及人類疾病預防等多個研究領域^［8-12］。隨著測序技術的進步，轉錄組測序在篩選和識別特定性狀SNP位點方面逐漸成為有效工具^［5］。目前，已有多項研究利用轉錄組測序篩選SNP位點，涉及多個經濟甲殼類，如凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、方斑東風螺（Babylonia areolata）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）等^［13-17］。然而，關于中華絨螯蟹的相關研究尚顯不足，現有文獻僅涉及MIH基因SNP多態(tài)性及其與性早熟的關系，以及與生長性狀相關的SNP位點篩選等方面^［18-19］。至于中華絨螯蟹在低溫脅迫下的SNP位點挖掘和功能注釋，目前尚無相關報道。

本研究以不同水溫條件下養(yǎng)殖的中華絨螯蟹肝胰腺轉錄組測序數據為基礎，篩選出大量SNP位點，并通過功能注釋和通路分析探討這些SNP位點所在基因的潛在功能。以期為中華絨螯蟹適應低溫環(huán)境及相關性狀的分子標記開發(fā)提供基礎，為未來研究中華絨螯蟹響應低溫脅迫的分子機制和耐低溫品系的遺傳選育提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2022年10月，分別從貴州省畢節(jié)市（27.15°N，104.94°E；年平均氣溫約為12.5 ℃，平均海拔約為1 600 m）和江蘇省蘇州陽澄湖（31.38°N，120.98°E；年平均氣溫約為18 ℃，平均海拔約2 m）的養(yǎng)殖基地采集了正常發(fā)育并性成熟的二齡雌性中華絨螯蟹。這些樣本被分為低溫處理組（TL）和對照組（TC），每組各有15只。測量雌蟹的形態(tài)學指標，并采集其肝胰腺組織，隨后將樣品迅速冷凍于液氮中，并儲存于-80 ℃冰箱中以備轉錄組學分析使用。

1.2 轉錄組測序

試驗樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。首先，使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA的完整性。接著，利用附有多聚T寡核苷酸的磁珠從總RNA中提取mRNA。每組構建3個轉錄組文庫，文庫的RNA樣本由5只雌蟹的肝胰腺RNA等量混合而成，隨后進行Illumina測序以獲得原始讀取數據（raw reads）。在去除含接頭序列和低質量數據后，獲得讀取數據（clean reads）。最后，使用Trinity軟件對clean reads進行拼接，得到轉錄本序列。

1.3 SNP位點檢測及其所在Unigene 的注釋與功能分析

使用SAMtools和picard-tools對測序結果進行染色體坐標排序，并去除重復的reads。通過SAMtools/BCFtools進行SNP Calling，對樣本數據進行變異位點分析；統(tǒng)計SNP位點的數量及其分布情況。通過諾禾生物云平臺（https：//magic.novogene.com/customer/main#/homeNew）提供的生物信息學工具，將SNP位點的基因序列與GO、KOG和KEGG數據庫進行比對，以獲得SNP-Unigene序列的功能注釋，并進一步篩選出與信號轉導和免疫相關的KEGG通路^［8］。

2 結果與分析

2.1 SNP位點分析

使用SOAPsnp軟件對轉錄組數據進行了分析（表1），共識別出429 684個SNP位點，這些位點分布在22 249條Unigene中。其中，TL組識別到 224 565 個SNP位點，而TC組則發(fā)現了205 119個SNP位點。在所有識別的SNP中，有218 713個被歸類為純合SNP，TL組中有115 606個純合SNP，而TC組則包含103 107個純合SNP。

根據Unigene中SNP位點的分布情況進行統(tǒng)計（圖1），在TC、TL組中，含有超過10個SNP位點的Unigene數量均超過總數的一半以上，分別占到總數的52.55%、52.80%，其次為2～10個SNP位點的Unigene，分別有4 323、4 674條，分別占總數的40.48%、40.40%；而含有單個SNP位點的Unigene數量均最少，分別為744、786條，分別占總數的6.97%、6.20%。

對SNP位點突變類型的分析結果（圖2）表明，在TC組中，顛換位點有64 735個，占總SNP位點的31.56%；而轉換位點則有140 384個，占68.44%。在TL組中，顛換位點為72 161個，占32.13%；轉換位點為152 404個，占67.87%。在12種核苷酸變異類型中，T-A發(fā)生顛換的比例最高，分別占SNP位點總數的18.52%（TC組11 987個）和17.37%（TL組12 537個）；而C-T的轉換比例最高，分別占SNP位點總數的29.55%（TC組41 485個）和29.76%（TL組45 360個）。

2.2 SNP-Unigene 的注釋與功能

與GO數據庫的比對結果（圖3）表明，共計4 736條SNP-Unigene與GO條目相匹配，涵蓋生物過程（biological process，BP）（74.41%）、細胞組分（cellular component，CC）（13.98%）以及分子功能（molecular function，MF）（11.61%）這3個主要功能類別的34個亞類。在生物過程的分類中，涉及細胞過程和代謝過程的SNP-Unigene數量最多；在細胞組分中，參與細胞解剖實體和胞內區(qū)的SNP-Unigene數量較高；而在分子功能方面，涉及結合和催化活性的SNP-Unigene數量最為豐富。

與KOG數據庫的比對結果顯示，共有2 532條SNP-Unigene成功匹配到KOG注釋信息，并根據功能分為26類。其中，功能預測類占比最高，包含360條SNP-Unigene，占被注釋總數的14.22%；其次是信號轉導機制，涉及292條SNP-Unigene，占比11.53%；翻譯后修飾、蛋白質周轉和蛋白質伴侶基因則位列第三，包含235條SNP-Unigene，占比9.28%（圖4）。

KEGG數據庫的注釋結果顯示，共有263條SNP-Unigene參與了環(huán)境信息處理、細胞過程、有機系統(tǒng)、遺傳信息處理和代謝這五大類生化途徑（圖5）。其中，信號轉導相關的SNP-Unigene數量最多，共有32條；其次是免疫系統(tǒng)相關的SNP-Unigene，有22條；內分泌系統(tǒng)相關的SNP-Unigene則排在第3位，數量為16條。

2.3 信號轉導相關的SNP-Unigene富集及特異SNP位點

由表2可知，通過對KEGG信號通路進行富集分析，共有599條SNP-Unigene被注釋到26條與信號轉導相關的通路中。其中， 注釋到PI3K-Akt信號通路的SNP-Unigene數量最多，達50條；其次是MAPK信號通路，包含38條SNP-Unigene；Ras信號通路和mTOR信號通路各有37條SNP-Unigene。

2.4 免疫系統(tǒng)相關的SNP-Unigene富集及特異SNP位點

由表3可知，通過KEGG信號通路的富集分析，共有315條SNP-Unigene被注釋到22條與免疫系統(tǒng)相關的通路中。其中，Chemokine信號通路注釋的SNP-Unigene數量最多，達到33條，其次是NOD-like受體信號通路，有26條；Toll和Imd信號通路有24條，而Fc gamma R介導的吞噬作用則有21條。

3 討論

3.1 SNP位點特征分析

SNP標記作為一種先進的分子標記技術，因其具有更高的穩(wěn)定性、準確性和重復性，在水產動物的研究中展現了廣泛的應用潛力和前景。相比于許多魚類和貝類，甲殼類動物由于其染色體數量較多^［20-21］，給SNP標記的開發(fā)帶來了一定的挑戰(zhàn)。然而，隨著高通量測序技術的進步，轉錄組測序有效地克服了這些困難，為甲殼類動物的SNP標記開發(fā)提供了重要的支持。

本研究利用高通量測序技術，從中華絨螯蟹的TL和TC轉錄組數據中共鑒定出分布于22 249條SNP-Unigene序列上的429 684個SNP位點，其中轉換型SNP位點占67.87%，這一結果與在方斑東風螺和軍曹魚等物種上的研究^［5-8］相似。SNP堿基替換是推動基因突變及生物進化的重要因素^［7］，主要包括顛換（如A-T、C-G、A-C、T-G的相互置換）和轉換（如A-G和T-C的相互置換）2種類型。理論上，SNP中轉換與顛換的比例應為1∶2，當轉換與顛換的比例超過0.5時，稱為“轉換偏差”^［22］。在本研究中，TL和TC轉錄組中轉換與顛換的SNP數量比值分別為2.11和2.17，表明轉換的比例顯著高于顛換，符合“轉換偏差”的現象。這一現象同樣在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）、軍曹魚（Rachycentron canadum）和大口黑鱸（Micropterus salmoides）等水產動物中得到證實^{［5，16-17，23-24］}， 表明SNP位點的堿基突變并非隨機生成，可能與不同物種的生物堿基組成及其在進化過程中所承受的環(huán)境壓力和選擇機制有關^［24］。在自然選擇的過程中，轉換突變一般導致同義突變，這也解釋了為何SNP轉換類型在蛋白編碼序列中數量多于顛換類型^［25］。此外，本研究發(fā)現C-T轉換在12種核苷酸變異類型中占比最高，這一結果與大多數物種的研究一致，可能是由于CpG二核苷酸中5-甲基胞嘧啶容易發(fā)生脫氨基反應，從而導致堿基C變?yōu)閴A基T^［26］。

3.2 中華絨螯蟹對低溫的適應性

水溫對水生生物的適應性機制具有重要影響，不同水域的溫度和壓力差異會促使水生動物形成本地適應性^［27］。例如，俞夢超研究發(fā)現，不同海拔梯度下的裂腹魚類在低溫適應機制上存在差異^［28］；羅慧等則指出，青海湖裸鯉在不同環(huán)境中形成了適應不同水溫的特征^［6］。本研究結果表明，低溫處理組與對照組的SNP數量和位置并不完全相同，顯示中華絨螯蟹在低溫環(huán)境下發(fā)生了SNP位點的變異，可能形成了與低溫環(huán)境相適應的本地適應性及分子機制。在對中華絨螯蟹的SNP-Unigene進行功能注釋時，結果顯示在22 249條SNP-Unigene中，分別有 4 736、2 532、263條分別被注釋到GO、COG及KEGG數據庫。這些SNP-Unigene大多數參與了細胞過程、代謝過程和信號轉導等機制，尤其是與能量代謝相關的通路，這些基因在中華絨螯蟹適應低溫脅迫中發(fā)揮了關鍵作用。作為變溫動物，中華絨螯蟹可能通過體內的多種酶和代謝模式來應對低溫脅迫，利用儲存的能量以適應環(huán)境變化，因此能量的產生與轉運顯得尤為重要。KEGG信號通路的富集分析發(fā)現，脂質代謝（lipid metabolism）、糖代謝（carbohydrate metabolism）、聚糖生物合成與代謝（glycan biosynthesis and metabolism），以及氨基酸代謝（amino acid metabolism）等4條主要代謝通路均與能量代謝相關，且會影響中華絨螯蟹的生長和免疫過程。為了深入研究中華絨螯蟹的信號轉導和免疫防御機制，本研究篩選出了599條與信號轉導相關的SNP-Unigene，主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路和mTOR信號通路等重要通路。同時，篩選出315條與免疫防御相關的SNP-Unigene，這些基因大部分被注釋到趨化因子信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll和Imd信號通路以及Fc gamma R介導的吞噬作用等免疫信號通路中。這些篩選到的SNP-Unigene及其相關通路可能與中華絨螯蟹對低溫脅迫的響應密切相關，為深入研究其適應低溫環(huán)境的分子機制奠定了基礎。

4 結論

本研究基于低溫脅迫下中華絨螯蟹肝胰腺的高通量轉錄組測序數據，鑒定出了429 684個SNP位點。通過對22 249條SNP-Unigene的序列比對與功能注釋，發(fā)現這些SNP位點所對應的基因與多種生物學過程密切相關。其中，599條和315條SNP-Unigene分別被注釋到與信號轉導和免疫防御相關的重要信號通路中。這些與低溫脅迫響應相關的SNP-Unigene及其通路可能直接影響中華絨螯蟹對低溫環(huán)境的適應能力。這一研究為深入探討中華絨螯蟹在低溫脅迫下的分子機制提供了重要的理論支持和基礎材料。

參考文獻：

［1］彭 濤， 張冬冬， 姜曉東，等. 中華絨螯蟹“長蕩湖1號”奇數年群體選育第二代的生長性能和養(yǎng)殖效果評估［J］. 中國水產科學，2023，30（10）：1177-1187.

［2］張凱軍，姜鵬飛，王 軍，等. 不同溫度對中華絨螯蟹生長及腸道微生物菌群的影響［J］. 上海海洋大學學報，2022，31（2）：384-393.

［3］李志強. 溫度變化對中華絨螯蟹生理功能的影響［D］. 哈爾濱：東北農業(yè)大學，2023.

［4］李春波，沈晨晨，馮廣朋，等. 中華絨螯蟹棲息地因子適宜范圍的研究進展［J］. 海洋漁業(yè)，2023，45（6）：766-774.

［5］楊二軍，楊林桐，王維政，等. 軍曹魚響應低氧脅迫轉錄組SNP位點鑒定及其功能注釋分析［J］. 海洋學報，2022，44（1）：113-124.

［6］羅 慧，匡 箴，羅 穎，等. 基于離散SNP位點解析青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）對水溫和鹽度的適應性［J］. 基因組學與應用生物學，2023，42（1）：25-33.

［7］趙 輝，李啟寨，李 俊，等. 相鄰堿基組分與產生SN 的轉換或顛換在植物基因組中的研究［J］. 中國科學（生命科學），2006，36（1）：1-8.

［8］王 菁，劉付柏，許尤厚，等. 基于轉錄組測序的方斑東風螺單核苷酸多態(tài)性位點挖掘及功能注釋［J］. 廣東海洋大學學報，2021，41（1）：111-118.

［9］Rafalski A. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics［J］. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（2）：94-100.

［10］Esteras C，Gómez P，Monforte A J，et al. High-throughput SNP genotyping in Cucurbita pepo for map construction and quantitative trait loci mapping［J］. BMC Genomics，2012，13：80.

［11］Wuttke M，Schaefer F，Wong C S，et al. Genome-wide association studies in nephrology：using known associations for data checks［J］. American Journal of Kidney Diseases，2015，65（2）：217-222.

［12］Du Z Q，Ciobanu D C，Onteru S K，et al. A gene-based SNP linkage map for pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei［J］. Animal Genetics，2010，41（3）：286-294.

［13］楊春玲，陳慧芳，彭 敏，等. 凡納濱對蝦轉錄組測序分析及肌肉生長發(fā)育相關基因的篩選［J］. 南方農業(yè)學報，2021，52（9）：2319-2328.

［14］Yang Y N，Ye H H，Huang H Y，et al. Expression of Hsp70 in the mud crab，Scylla paramamosain in response to bacterial，osmotic，and thermal stress［J］. Cell Stress and Chaperones，2013，18（4）：475-482.

［15］周曉敏，孔嘉明，戴習林. SNP標記位點與羅氏沼蝦生長性狀的相關分析［J］. 南方農業(yè)學報，2021，52（8）：2284-2293.

［16］朱佶軒，戴 琴，段健誠，等. 脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點的篩選及其特征分析［J］. 水產科學，2021，40（3）：387-393.

［17］張德寧，呂建建，劉 萍，等. 三疣梭子蟹生長相關SNP位點的鑒定［J］. 中國水產科學，2015，22（3）：393-401.

［18］殷 悅，徐 宇，唐劉秀，等. 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素基因單核苷酸多態(tài)與性早熟的關聯性分析［J］. 水產養(yǎng)殖，2019，40（1）：14-17，22.

［19］陳義培，吳 廉，陳曉雯，等. 中華絨螯蟹MSTN基因SNPs多態(tài)性及與生長性狀的關聯分析［J］. 水生生物學報，2018，42（2）：293-299.

［20］張?zhí)熹? 羅氏沼蝦多倍體育種的研究［D］. 武漢：華中師范大學，2003.

［21］劉 磊. 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）遺傳連鎖圖譜的構建和生長相關性狀QTL定位的研究［D］. 青島：中國海洋大學，2014.

［22］Collins D W，Jukes T H. Rates of transition and transversion in coding sequences since the human-rodent divergence［J］. Genomics，1994，20（3）：386-396.

［23］雷 駱，祝駿賢，陳 辰，等. 基于轉錄組測序的中華鱉SSR和SNP特征分析及性別標記篩選［J］. 廣東海洋大學學報，2023，43（1）：25-32.

［24］李勝杰，白俊杰，趙 犖，等. 大口黑鱸 EST-SNP標記開發(fā)及其與生長性狀的相關性分析［J］. 海洋漁業(yè)，2018，40（1）：38-46.

［25］國鈺環(huán)，Naoki Y，彭正松，等. 基于轉錄組數據的三雌蕊小麥中SNP /InDel 位點的挖掘［J］. 華北農學報，2021，36（5）：35-42.

［26］Garg K，Green P，Nickerson D A. Identification of candidate coding region single nucleotide polymorphisms in 165 human genes using assembled expressed sequence tags［J］. Genome Research，1999，9（11）：1087-1092.

［27］曾本和，張忭忭，牟振波，等. 3種西藏土著魚類幼魚水溫耐受性的初步研究［J］. 水產科學，2019，38（1）：115-118.

［28］俞夢超. 通過裂腹魚類的轉錄組比較分析揭示青藏高原魚類的適應性進化［D］. 上海：上海海洋大學，2017.