【摘要】基于蛋白復(fù)合物在鈉離子通道相關(guān)疾病中的調(diào)控作用，本文綜述了蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)建蛋白質(zhì)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)通路中涉及的體內(nèi)和體外相關(guān)檢測(cè)方法，如酵母雙雜交系統(tǒng)、雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀技術(shù)、融合蛋白Pull-Down技術(shù)、單分子下拉、高通量蛋白質(zhì)芯片、微生物質(zhì)譜、串聯(lián)親和蛋白純化，以及以生物信息學(xué)為主的研究方法，并通過(guò)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)在大分子蛋白復(fù)合物中的應(yīng)用獲得新的靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；酵母雙雜交系統(tǒng)；雙分子熒光互補(bǔ)；免疫共沉淀技術(shù)；串聯(lián)親和蛋白純化

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.055

The Application of Protein Interaction Technology at the Molecular Level

HAN Juanzhu1*， YANG Wenyao2，3， GAO Duo1

（1.Liaoning Inspection， Examination&Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China； 2.Liaoning Chengda Biotechnology Co.， Ltd.，Shenyang 110179， China； 3.Shenyang Pharmaceutical University School of Life Sciences and Biopharmaceuticals， Shenyang 110016，China）

Abstract： Based on the regulatory role of protein complexes in sodium ion channel related diseases， this article reviews the in vivo and in vitro detection methods involved in the construction of protein relationship networks and biological pathways through protein interactions： yeast two hybrid system， bimolecular fluorescence complementarity， immune coprecipitation technology， fusion protein Pull-Down technology， single-molecule pull-down， high-throughput protein chip， microbial mass spectrometry， tandem affinity protein purification， and bioinformatics based research methods. Through the application of relevant detection technologies in large molecule protein complexes， new targets are obtained.

Keywords： protein protein interaction； Y2H； BiFC； Co-IP； TAP

蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）技術(shù)是一種隨著生物技術(shù)進(jìn)步而發(fā)展的新型研究方法，它是新型靶點(diǎn)藥物研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)，同時(shí)也是研究藥物副反應(yīng)的基礎(chǔ)方法，為藥物治療開(kāi)辟了新的道路。通過(guò)建立蛋白質(zhì)關(guān)系的化學(xué)網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)通道，可以鑒定由功能失調(diào)或病變引起的異常表達(dá)蛋白，從而發(fā)現(xiàn)與病毒的小分子相互作用機(jī)制，并明確治療干預(yù)的靶點(diǎn)。

蛋白質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)相互作用幾乎指導(dǎo)了細(xì)胞功能的各個(gè)方面。了解活細(xì)胞中大分子的相互作用是破解它們?cè)诩?xì)胞功能和調(diào)節(jié)中作用的關(guān)鍵。單個(gè)蛋白質(zhì)也是多種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的一部分，這使得分離出發(fā)生在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的各種排列具有挑戰(zhàn)性。PPI檢測(cè)技術(shù)主要包括體內(nèi)檢測(cè)和體外檢測(cè)兩個(gè)方面。

1體內(nèi)技術(shù)研究

1.1酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast-hybrid system，Y2H）是1989年Fields和Song提出并創(chuàng)立的一種直接在酵母細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的遺傳學(xué)新方法。這一技術(shù)在細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)和凋亡、信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物作用、基因表達(dá)調(diào)控元件及蛋白特異性等方向帶來(lái)很多熱點(diǎn)研究。其主要用于互作蛋白的篩選，適用方向由蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間擴(kuò)展到蛋白質(zhì)與DNA、RNA及其他小分子相互作用，對(duì)新作用蛋白的發(fā)現(xiàn)起到巨大的推動(dòng)作用。

Y2H的建立是基于真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)，起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄因子，如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4，其在結(jié)構(gòu)上包含兩個(gè)主要部分：一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD），二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）。待測(cè)蛋白與AD、BD融合表達(dá)形成Prey-AD和bait-BD，只有通過(guò)誘餌蛋白與目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用，AD和BD之間會(huì)相互吸引，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，形成完整的轉(zhuǎn)錄因子，并激活酵母基因組中的報(bào)告基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在實(shí)驗(yàn)時(shí)只要通過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)水平就能判斷蛋白質(zhì)復(fù)合物之間是否存在相互作用。Y2H系統(tǒng)能夠真實(shí)反映體內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物之間的相互作用，蛋白表型和基因型聯(lián)系緊密，聯(lián)用簡(jiǎn)便高效的Gateway表達(dá)載體構(gòu)建方法，因而在大規(guī)模PPI研究中的應(yīng)用前景具有普遍性。然而，盡管傳統(tǒng)二代Y2H系統(tǒng)在分析PPI及小分子藥物蛋白靶標(biāo)探索中的應(yīng)用認(rèn)可度高，但無(wú)法提供PPI的密切程度且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，故可結(jié)合免疫共沉淀或GST-pull down試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但高通量篩選方面仍具有局限性。

1.2雙分子熒光互補(bǔ)

蛋白質(zhì)相互作用是產(chǎn)生生物調(diào)節(jié)特異性的基本機(jī)制，活細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用的研究具有特別重要的意義，因?yàn)榘l(fā)生在特定細(xì)胞中的相互作用取決于細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)的完整補(bǔ)充以及影響細(xì)胞的外部刺激。雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）分析可以直接可視化活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用。Hu等[3]在2002年提出了BiFC技術(shù)，以最短的時(shí)間、最易于理解的方式說(shuō)明蛋白在細(xì)胞中的位置跟蹤和蛋白與蛋白之間的作用關(guān)系。

BiFC測(cè)定基于熒光蛋白的兩個(gè)非熒光片段之間的關(guān)聯(lián)，它們通過(guò)融合片段的蛋白質(zhì)之間的相互作用而彼此接近。在許多不同的細(xì)胞類型和生物體中，使用BiFC測(cè)定法可以觀察到許多蛋白質(zhì)相互作用。按照規(guī)則，標(biāo)記分子主要采用熒光報(bào)告蛋白中沒(méi)用熒光的片段，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)融合技術(shù)共表達(dá)攜帶標(biāo)記分子的誘餌蛋白和捕獲蛋白。

Paul等[4]為了尋找FGF14∶Nav1.6復(fù)合物上游的關(guān)鍵細(xì)胞途徑，通過(guò)使用分裂螢光素酶互補(bǔ)測(cè)定法穩(wěn)定地重建了FGF14∶Nav1.6復(fù)合物，并對(duì)267種FDA批準(zhǔn)的化合物進(jìn)行了高通量篩選（HTS），這些化合物能夠靶向細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的已知介體。在篩選過(guò)程中，5種化合物被驗(yàn)證并確認(rèn)具有活性，其中，酪氨酸激酶抑制劑來(lái)舒替尼排名最高，表現(xiàn)出對(duì)FGF14∶Nav1.6裝配的亞微摩爾抑制作用。BiFC技術(shù)已被國(guó)際上眾多實(shí)驗(yàn)室采用，在熒光顯微鏡下，通過(guò)顯示器可以看到在生理狀態(tài)下目標(biāo)蛋白的作用情況，包括具體的作用部位、作用的時(shí)間、作用的程度、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等。在活細(xì)胞內(nèi)證明蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。

2體外技術(shù)研究

2.1免疫共沉淀技術(shù)

目前，體外研究確定蛋白質(zhì)之間相互作用的黃金標(biāo)準(zhǔn)之一是Co-IP測(cè)定，它依賴于相互作用蛋白質(zhì)的親和基礎(chǔ)上的共同純化，然后通過(guò)western blot或質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。它利用特異性抗體與抗原的結(jié)合來(lái)確定蛋白質(zhì)之間的互動(dòng)。誘餌蛋白抗體加入后，將獵物蛋白在免疫沉淀反應(yīng)的作用下被共沉淀下來(lái)，然后使用SDS-PAGE或二維電泳并結(jié)合微生物質(zhì)譜鑒定，得到獵物蛋白的具體信息。Jia J等[5]使用共免疫沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用（Co-IP/MS）技術(shù)鑒定出23種與母羊卵巢提取物中的FecB特異性相互作用的蛋白質(zhì)。所選PPI的生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)ecB主要通過(guò)卵巢中的信號(hào)傳導(dǎo)與其他幾種BMP相關(guān)。

2.2融合蛋白Pull-Down技術(shù)（GST pull-down）

用傳統(tǒng)的免疫沉淀法很難確定哪些蛋白質(zhì)在生理復(fù)合體中有多少拷貝。此外，在樣品制備和測(cè)量之間往往消耗大量時(shí)間并且經(jīng)過(guò)多個(gè)操作步驟，因而在分析之前體內(nèi)相互作用的保存程度存在不確定性。通過(guò)了解蛋白之間的相互作用能夠掌握細(xì)胞功能和調(diào)控的機(jī)制，揭示生命最基本的作用方式。GST Pull-Down技術(shù)采用誘餌蛋白（Bait protein）和標(biāo)簽蛋白（生物素-、His-或GST-），通過(guò)谷胱甘肽和GST之間的特異性關(guān)系在細(xì)菌、細(xì)胞體系中進(jìn)行表達(dá)，在色譜柱上固定誘餌蛋白，從而特異性結(jié)合捕獲細(xì)胞中互相作用的靶蛋白。Kordiukova MIu等[6]通過(guò)GST融合的蛋白，即人GST-SURF6和與C末端有85%同源性的小鼠Surf6的保守C末端結(jié)構(gòu)域、人SURF6保守域（GST-Surf6-dom）的鑒定，以鑒定人HeLa細(xì)胞中與SURF6相互作用的蛋白質(zhì)。

2.3單分子下拉

通常，為了研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，常采用的技術(shù)是傳統(tǒng)的共免疫沉淀（Co-IP/pulldown）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。然而，該技術(shù)沒(méi)有提供關(guān)于PPI動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)量的精確信息。另外，傳統(tǒng)Co-IP的敏感性不適合檢查稀有細(xì)胞中的PPI。鑒于Co-IP方面存在的不足，Jain A等[7]建立了單分子下拉（SiMPull）方法，該方法能夠分析出一種蛋白的多種關(guān)聯(lián)蛋白，以單個(gè)分子的分辨率來(lái)證明蛋白質(zhì)復(fù)合體的特性和特征，以及化學(xué)計(jì)量特性和特征，同時(shí)通過(guò)分層次的光漂白來(lái)分析確定化學(xué)計(jì)量特性和特征。該方法將熒光顯微方法與pulldown方法結(jié)合在一起，直觀獲得蛋白復(fù)合體的圖像，特別擅長(zhǎng)組織內(nèi)、細(xì)胞器和膜蛋白的內(nèi)源性蛋白分析。目前，SiMPull分析用于研究稀有細(xì)胞，為研究細(xì)胞途徑中的蛋白復(fù)合物提供了一種用時(shí)少、檢測(cè)限低、準(zhǔn)確率高的方法。

2.4串聯(lián)親和純化

在研究蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)革命中，Rigaut等[10]提出了串聯(lián)親和純化技術(shù)（TAP），主要應(yīng)用在生理狀態(tài)下。該方法的特點(diǎn)是采用了兩個(gè)相連的標(biāo)簽，提高了特異性，排除了更多干擾。該方法通過(guò)讓目標(biāo)蛋白融合TAP特異性標(biāo)簽，再經(jīng)過(guò)串聯(lián)親和層析獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物，經(jīng)過(guò)二維電泳和微生物質(zhì)譜鑒定等技術(shù)，得到更多的蛋白信息。該方法耗時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確性高，能夠應(yīng)用在細(xì)菌、真菌、病毒、昆蟲(chóng)等實(shí)驗(yàn)載體。

2.5質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)互動(dòng)分析過(guò)程中的運(yùn)用

質(zhì)譜技術(shù)（MS）被廣泛應(yīng)用于包括人類蛋白質(zhì)組在內(nèi)的各種細(xì)胞、組織和生物體的綜合分析。Petricoin等[12]將低分子量蛋白質(zhì)譜引入癌癥蛋白質(zhì)組學(xué)。穩(wěn)定同位素標(biāo)記是一種標(biāo)記定量技術(shù)，在相同的質(zhì)譜運(yùn)行條件下對(duì)肽的譜特征分別定量。目前，常用的同位素標(biāo)記分別為2H、13C、15N和18O。加入同位素標(biāo)記的方法主要有：化學(xué)標(biāo)記法（ICAT）和代謝標(biāo)記法（SILAC）。化學(xué)標(biāo)記法是在提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白、經(jīng)親和層析后加入同位素標(biāo)記（體外標(biāo)記），主要包括酶標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記兩大類。由于同位素“輕”“重”之間存在差異性，采用質(zhì)譜技術(shù)能夠方便、簡(jiǎn)單及快速地區(qū)分并鑒定實(shí)驗(yàn)組中特異的蛋白質(zhì)。

2.6其他方法

在mRNA水平的層面進(jìn)行研究，側(cè)面說(shuō)明蛋白作用情況。研究基因產(chǎn)物的作用關(guān)系是通過(guò)刺激細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)量的變化。Stuart等[13]對(duì)人、果蠅及線蟲(chóng)的基因共表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了2萬(wàn)多種具有保守性的共表達(dá)關(guān)系。多維蛋白鑒定技術(shù)通過(guò)定位蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制。GST pull-down、Far-western、免疫共沉淀、化學(xué)交聯(lián)等可用于小規(guī)模的分析驗(yàn)證試驗(yàn)。

3結(jié)束語(yǔ)

高等動(dòng)物基因組研究人員指出，真正調(diào)節(jié)生物體復(fù)雜性的因素并非基因總量的增長(zhǎng)，而是通過(guò)更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間所發(fā)生的作用，及其相互影響后形成的生物學(xué)作用機(jī)制，構(gòu)建起這些分子間的互動(dòng)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是后基因組時(shí)代的首要任務(wù)。今后，隨著蛋白相互作用的深入研究，以及對(duì)蛋白相關(guān)靶點(diǎn)的廣泛研究，與蛋白相互作用相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

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【作者簡(jiǎn)介】

通信作者：韓鐫竹，女，1985年出生，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物源細(xì)菌耐藥性，261131312@qq.com。

（編輯：于淼）