[摘" "要]" "目的：探究甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase-like 3， METTL3）在食管鱗癌中的表達(dá)水平和作用機(jī)制。方法：體外構(gòu)建食管鱗癌細(xì)胞Eca-109的METTL3敲低模型，利用實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）、Western Blot驗(yàn)證敲低水平，檢測腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力。利用差異分析、富集分析以及生存分析等尋找METTL3的靶基因。結(jié)果：敲低METTL3可以顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力；利用生物信息學(xué)分析尋找到受METTL3調(diào)控的9個可能的靶基因（精脒/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶1（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1， SAT1）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor， LDLR）、整合素β1（integrin subunit beta 1， ITGB1）、細(xì)胞間黏附分子5（intercellular adhesion molecule 5， ICAM5）、富含谷氨酸的WD重復(fù)序列蛋白1（glutamate-rich WD40 repeat containing 1， GRWD1）、含纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域3A 蛋白（fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A， FNDC3A）、DnaJ熱休克蛋白家族成員C2[DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2， DNAJC2]、卷曲螺旋域蛋白88C（coiled-coil domain containing 88C， CCDC88C）、Rho GTP酶激活蛋白12（Rho GTPase activating protein 12， ARHGAP12），其中SAT1高表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：METTL3在食管鱗癌中發(fā)揮促癌作用，可能通過調(diào)控SAT1等靶基因的m6A甲基化影響食管鱗癌患者的預(yù)后。

[關(guān)鍵字]" "食管鱗癌；甲基轉(zhuǎn)移酶樣3；細(xì)胞增殖；生存分析

[中圖分類號]" "R735.1" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2024）02-0101-06

Study on the function of methyltransferase-like 3 in regulating esophageal squamous cell carcinoma cells*

XIONG Jiashi1**， JI Pengxiang2， WANG Junjie2， HE Gang3***" " " " （1Department of Oncology， Shanghai Fengxian District Central Hospital， Shanghai 201499; 2Department of Biochemistry and Molecular Biology， Medical College， Soochow University; 3Department of Thoracic Surgery， Shanghai Fengxian District Central Hospital）

[Abstract]" "Objective： To explore the expression levels and mechanisms of methyltransferase-like 3（METTL3） in esophageal squamous cell carcinoma. Methods： In vitro construction of METTL3 knockdown model in Eca-109， validated by quantitative real-time PCR（qRT-PCR） and Western Blot to confirm knockdown levels， and assessment of tumor cell proliferation and migration abilities. Exploring METTL3 target genes through differential analysis， enrichment analysis， and survival analysis. Results： Knocking down METTL3 significantly inhibits the proliferation and migration abilities of esophageal cancer cells. Through bioinformatics analysis， we identified 9 potential target genes regulated by METTL3 spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1（SAT1）， low density lipoprotein receptor（LDLR）， integrin subunit beta 1（ITGB1）， intercellular adhesion molecule 5（ICAM5）， glutamate-rich WD40 repeat containing 1（GRWD1）， fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A（FNDC3A）， DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2（DNAJC2）， coiled-coil domain containing 88C（CCDC88C）， Rho GTPase activating protein 12（ARHGAP12）. High expression of SAT1 is closely associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma patients. Conclusions： METTL3 exerts a pro-cancer role in esophageal squamous cell carcinoma， potentially impacting the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma patients by regulating m6A methylation of target genes such as SAT1.

[Key words]" "esophageal squamous cell carcinoma; methyltransferase like-3; cell proliferation; survival analysis

食管癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)病、高轉(zhuǎn)移的消化道惡性腫瘤。由于食管癌侵襲性強(qiáng)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]，患者發(fā)現(xiàn)時往往已達(dá)晚期，且診斷方式、治療技術(shù)的局限性導(dǎo)致患者生存率較低[2-4]。因此深入探究食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對其臨床治療及診斷具有重要意義。

甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase like-3， METTL3）是甲基轉(zhuǎn)移酶樣基因家族成員之一，可與甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（methyltransferase like-14， METTL14）以及腎母細(xì)胞瘤1關(guān)聯(lián)蛋白（recombinant Wilms tumor 1 associated protein， WTAP）等形成多組分甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，它可在mRNA和ncRNA的腺嘌呤堿基的第6位氮原子上添加1個甲基形成N6-甲基腺嘌呤[5]。目前已有多項(xiàng)研究[6-7]表明METTL3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，在肝癌、乳腺癌等中METTL3可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。在食管癌中，有研究[8]表明METTL3與多種免疫細(xì)胞相關(guān)，可作為潛在的免疫治療生物標(biāo)志物，但其研究不多，涉及的信號通路復(fù)雜，因此探究METTL3在食管鱗癌中發(fā)揮的生物學(xué)作用，尋找其調(diào)控靶基因的分子機(jī)制，可以對食管鱗癌的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1" "材料和方法

1.1" "Eca-109細(xì)胞株培養(yǎng)和shRNA轉(zhuǎn)染" "人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院——細(xì)胞資源中心，使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗）進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境設(shè)置為37 ℃，5%CO2。利用https：//www.sigmaaldrich.com設(shè)計METTL3的shRNA序列（shMETTL3-1-F：CCGGGCCAAGGA-ACAATCCATTGTTCTCGAGAACAATGGATTGTTCC-TTGGCTTTTTG；shMETTL3-1-R：AATTCAAAAAG-CCAAGGAACAATCCATTGTTCTCGAGAACAATGG-ATTGTTCCTTGGC；shMETTL3-2-F：CCGGCGTCA-GTATCTTGGGCAAGTTCTCGAGAACTTGCCCAAG-ATACTGACGTTTTTG；shMETTL3-2-R：AATTCAA-AAACGTCAGTATCTTGGGCAAGTTCTCGAGAACT-TGCCCAAGATACTGACG；shNC-F：CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCA-TCTTGTTGTTTTTG；shNC-R：AATTCAAAAACAAC-AAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTT-CATCTTGTTG）。使用PEI（翌圣生物）轉(zhuǎn)染試劑在Eca-109細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shNC與shMETTL3。

1.2" "RNA逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）" "使用TRIZOL（諾唯贊）法抽提RNA并測定RNA濃度。根據(jù)Vazyme公司的HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒說明書，配置RNA終質(zhì)量濃度為15 ng/μL，總體積為20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)。利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）設(shè)計定量引物（METTL3-F：CCAGGGTCTGGATTGTGATGT； METTL3-R：AGGGTGATCCAGTTGGGTTG；ACTB-F：GAAAATCTGGCACCACACCT；ACTB-R：ATAGCA-CAGCCTGGATAGCAA），以ACTB為內(nèi)參。采用Vazyme公司的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測METTL3基因在對照組和shRNA敲低組的食管癌細(xì)胞中的mRNA水平，采用相對定量分析方法，通過2-ΔΔCT計算目的基因相對于內(nèi)參基因ACTB的表達(dá)量。

1.3" "蛋白質(zhì)免疫印跡" "使用Western及IP裂解液（碧云天）裂解細(xì)胞，并通過BCA檢測試劑盒（弗德生物）對蛋白定量。將蛋白樣品與5×loading buffer混勻后100 ℃下變性10 min，然后經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用含有5%脫脂奶粉的1×TBST進(jìn)行封閉。使用anti-METTL3與anti-β-actin一抗4 ℃孵育16 h后，再使用同源二抗室溫孵育2 h。均勻滴加適量超敏ECL發(fā)光液于膜上，使用gensens 2000成像系統(tǒng)（Clinx）進(jìn)行成像。

1.4" "細(xì)胞增殖" "在96孔板中接種細(xì)胞，使每孔細(xì)胞密度為1 000個/100 μL，細(xì)胞貼壁后在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm吸光度作為第0天的數(shù)據(jù)，隨后每隔24 h進(jìn)行數(shù)據(jù)測量。使用Graphpad Prism軟件，以細(xì)胞培養(yǎng)時間為橫軸、OD450 nm值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5" "細(xì)胞克隆" "在12孔板中接種細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度為500個/mL，細(xì)胞分散均勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)生長情況連續(xù)培養(yǎng)1～2周。待細(xì)胞克隆生長至一定大小后，使用結(jié)晶紫染色細(xì)胞，拍照計數(shù)，結(jié)果分析。

1.6" "細(xì)胞遷移" "在Transwell上室中加入200 μL混合均勻的細(xì)胞懸液，每個小室內(nèi)細(xì)胞個數(shù)為5×104個，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。甲醇固定、結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上室中殘留的液體。顯微鏡下拍照、計數(shù)。

1.7" "生信分析" "從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載與METTL3敲低相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE 179267。將樣本分成正常對照組和METTL3敲低組，通過R軟件中“Limma”程序包，設(shè)定條件|log2FC|gt;1且Plt;0.05獲取差異表達(dá)基因（differentially expressed genes， DEGs），以用于后續(xù)火山圖的繪制，以及進(jìn)一步的分析鑒定表達(dá)差異顯著的基因。M6A2Target（http：//m6a2target.canceromics.org/）是一個m6A調(diào)節(jié)因子的靶基因數(shù)據(jù)庫，通過下載其提供的m6A調(diào)節(jié)因子靶標(biāo)數(shù)據(jù)，分析尋找受METTL3調(diào)控的靶基因。利用整合基因本體（Gene Ontology， GO）、京都基因和基因組大百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）、UniProt以及DrugBank等多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫資源的metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/）進(jìn)行基因功能富集分析。下載TCGA數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌RNA-seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)臨床信息數(shù)據(jù)，使用“survival”、“survminer”等R包對相關(guān)基因進(jìn)行生存分析及繪制生存曲線。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "METTL3對細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)功能的影響" "為檢測METTL3基因在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用，構(gòu)建了METTL3敲降的載體，瞬時轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞并對其敲降效率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shRNA后METTL3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖1A～B）。在此基礎(chǔ)上，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)分析了METTL3基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敲降METTL3基因能顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力（Plt;0.01）。Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了食管鱗癌細(xì)胞在敲低METTL3前后體外遷移能力，結(jié)果表明METTL3敲降后，食管鱗癌細(xì)胞體外遷移能力受到顯著抑制（圖2）。

2.2" "DEGs的鑒定及METTL3靶基因的尋找" "對數(shù)據(jù)集GSE 179267進(jìn)行差異分析，得到180個DEGs，其中包括58個上調(diào)基因和122個下調(diào)基因（|log2FC|gt;1，Plt;0.05）。利用DEGs的分析結(jié)果繪制火山圖，其中紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因（圖3A）。通過m6A2Target數(shù)據(jù)庫篩選受METTL3調(diào)控的靶基因，并與上述差異基因取交集，共得96個候選基因（圖3B）。

2.3" "富集分析" "通過Metascape數(shù)據(jù)庫對上述96個候選靶基因進(jìn)行功能及通路富集分析（圖4）。結(jié)果顯示主要與對Ⅰ型干擾素的反應(yīng)、血管發(fā)育、免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子信號、白細(xì)胞聚集以及調(diào)控蛋白復(fù)合物的組裝等相關(guān)。這些功能和通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.4" "生存分析" "利用 “survminer”以及“survival”包的Survfit函數(shù)對候選靶基因進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)9個基因與食管鱗癌患者生存顯著相關(guān)（圖5）：精脒/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶1（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1， SAT1）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor， LDLR）、整合素β1（integrin subunit beta 1， ITGB1）、細(xì)胞間黏附分5（intercellular adhesion molecule 5， ICAM5）、富含谷氨酸的WD重復(fù)序列蛋白1（glutamate-rich WD40 repeat containing 1， GRWD1）、含纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域3A 蛋白（fibronectintype-Ⅲ domain-containing protein 3A， FNDC3A）、DnaJ熱休克蛋白家族成員C2[DnaJ heat shock protein family（Hsp40） member C2， DNAJC2]、卷曲螺旋域蛋白88C（coiled-coil domain containing 88C， CCDC88C）、Rho GTP酶激活蛋白12（Rho GTPase activating protein12， ARHGAP12）。其中LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1、FNDC3A、DNAJC2、CCDC88C、ARHGAP12的低表達(dá)提示食管鱗癌預(yù)后不良；而SAT1的高表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。

3" "討" " " 論

食管鱗癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)病、高轉(zhuǎn)移的消化道惡性腫瘤，惡性程度高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，嚴(yán)重危害國民健康水平[9]。因此，探索食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制顯得尤為重要。近年來，越來越多的研究[10-13]表明，m6A甲基化修飾相關(guān)的酶在肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌等多種癌癥中均發(fā)揮著重要作用，它們可通過調(diào)控靶基因的mRNA的可變剪接、穩(wěn)定性以及出入核等方式影響靶基因的翻譯效率，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。METTL3是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，可以通過在特定RNA轉(zhuǎn)錄本的m6A甲基化影響RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。多項(xiàng)研究[14-16]表明METTL3在乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種癌癥中均起到關(guān)鍵作用。然而，目前在食管鱗癌中受METTL3 m6A修飾的靶基因以及涉及的信號通路尚不明確。因此，尋找食管鱗癌中受METTL3調(diào)控的靶基因及相關(guān)信號通路，可能為食管鱗癌的診斷及治療提供新的思路。

本研究采用體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對METTL3在食管鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)METTL3在食管鱗癌中發(fā)揮促癌活性。在食管鱗癌細(xì)胞Eca-109中敲降METTL3基因可顯著抑制其增殖和遷移能力。利用差異分析、富集分析以及生存分析等方法找到9個可能的靶基因（SAT1、ARHGAP12、CCDC88C、DNAJC2、LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1、FNDC3A），其中SAT1高表達(dá)提示食管鱗癌患者預(yù)后不良，RHGAP、CCDC88C、DNAJC2、LDLR、ITGB1、ICAM5、GRWD1和FNDC3A基因低表達(dá)提示預(yù)后不良。富集分析結(jié)果顯示，ARHGAP12、CCDC88C、ICAM5以及FNDC3A在影響白細(xì)胞聚集方面發(fā)揮作用，而白細(xì)胞的異常聚集則對腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。目前已有多篇研究[17-20]報道ITGB1與食管癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)，而SAT1、ARHGAP12、LDLR以及FNDC3A等基因則在結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用。由此可見，上述基因在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要的角色。

然而，本研究也有一些局限性，對m6A靶基因的生物學(xué)功能也有待進(jìn)一步探究。未來將進(jìn)一步挖掘相關(guān)數(shù)據(jù)，并結(jié)合本研究的結(jié)論，對篩選到的相關(guān)靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以確定其是否可以作為新的METTL3靶點(diǎn)，為食管鱗癌的臨床診治提供理論依據(jù)。

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[收稿日期] 2023-12-01