關鍵詞 氧化鋅量子點；二氧化錫量子點；糖類抗原125；人附睪分泌蛋白4；電感耦合等離子體質譜；單顆粒分析

卵巢癌是世界上最致命的婦科惡性腫瘤之一[1-2]。目前，臨床上卵巢癌的篩查方法包括盆腔檢查、超聲成像和測定糖類抗原125（Carbohydrate antigen 125， CA125）的含量[3]。人血清中生物標志物濃度的升高可作為癌癥的預警，為癌癥的診斷提供依據。CA125 是一種由MUC16 基因編碼的糖蛋白，最早從卵巢癌125 單克隆抗體中檢出[1]。CA125 在正常人體組織中含量較低，在卵巢癌中含量較高，因此， CA125是診斷卵巢癌重要的生物標志物[2]。人附睪分泌蛋白4（Human epididymis protein 4， HE4）是乳清酸性蛋白4-二硫鍵核心結構域2（Whey-acidic-protein （WAP） four-disulfide core domain 2， WFDC2）基因的分泌性糖蛋白產物。HE4 在卵巢癌、肺癌、結腸癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞系中均有高水平表達，并在卵巢癌患者的血清中檢測到高水平的分泌型HE4。研究表明，聯(lián)合檢測血清中的HE4 和CA125 可提高卵巢癌的臨床診斷率，是診斷和鑒別良性和惡性卵巢腫瘤的良好指標[4]。因此，同時檢測人血清中CA125 和HE4 的含量對卵巢癌的早期診斷具有重要意義。

目前，已報道的用于檢測血清中CA125和HE4的方法有計算機斷層成像[5]、化學發(fā)光免疫分析法[6]、電化學免疫分析[7-8]、電化學發(fā)光[9-10]、酶聯(lián)免疫吸附分析[11]和激光誘導擊穿光譜[12]等。上述方法需要專業(yè)人員操作，而且檢測成本高。目前，探索簡單和低成本的檢測方法已成為生物標志物研究的重要方向[13]。電感耦合等離子體質譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）[14]具有檢測靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、抗干擾能力強和具有多重分析能力等優(yōu)點[15-16]，元素標記結合ICP-MS近年來被廣泛應用于測定RNA[17]、DNA[18]、蛋白質[19-24]、細胞[25-27]和病毒[28-30]等。量子點（Quantumdots， QDs）由于其生物相容性良好、在ICP-MS 中靈敏度高和在生物樣品中背景低等特性，在ICP-MS 免疫分析中得到了廣泛關注。文獻報道用于ICP-MS 免疫分析的量子點有CdSe QDs[29]、CdTe QDs[31]、ZnSe QDs[22-23]、ZnS QDs[32]和MoS2 QDs[32]等。本研究組在前期工作中利用ZnSe QDs、MoS2 QDs 和ZnS QDs 標記結合磁免疫單顆粒，采用ICP-MS 測定了人血清中的生物標志物[22-23，32]。

氧化鋅量子點（ZnO QD）以其獨特的光學、電學、抗菌活性及低成本、無毒、良好的生物相容性和長期環(huán)境穩(wěn)定性等特性而備受關注[33]。氧化錫量子點（SnO2 QD）具有卓越的物理和化學穩(wěn)定性、高光敏性和優(yōu)異的電學性能，廣泛應用于傳感器、細胞毒性和抗菌活性等研究[34]。四氧化三鐵磁納米粒子（Magnetic nanoparticles， MNPs）具有超順磁性，可將目標分析物從復雜樣品中快速分離[35]。目前，利用ZnO QD 和SnO₂ QD 標記抗體結合磁免疫ICP-MS 檢測人血清中卵巢癌生物標志物CA125 和HE4 的研究尚未見報道。

本研究提出了一種高靈敏的ZnO QD 和SnO₂ QD 標記抗體結合磁免疫單顆粒ICP-MS 分析人血清中卵巢癌生物標志物CA125 和HE4 的新方法。本方法將自主合成的氨基功能化的四氧化三鐵磁納米粒子（Amino modified magnetic nanoparticles， AMNPs）與CA125 和HE4 一抗結合，利用ZnO QD 和SnO₂ QD 分別標記CA125 和HE4 二抗，通過夾心免疫反應形成磁免疫復合物，采用ICP-MS 測定Zn 和Sn 的信號頻數，從而實現對CA125 和HE4 的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

NexIon 300 X 型ICP-MS 儀、Spectrum Two FT-IR 紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司）；Cary 60 紫外可見分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）；JEM-2100 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；D8 Advance X 射線衍射儀（德國Bruker 公司）；KQ5200B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1650-W 高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DZF-300 真空干燥箱（鄭州長城科工貿有限公司）；PHS-3C雷磁pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

K₂HPO₄、KH₂PO₄、SnCl₂·2H₂O、HNO₃、NaCl、硫脲、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS， 98%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、對氨基苯甲酸（PABA）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，98%）和氨水（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma-Aldrich 公司）；親和純山羊抗兔免疫球蛋白（Affinipure goat anti-rabbit IgG）和親和純山羊抗小鼠免疫球蛋白（Affinipure goat anti-mouse IgG）（武漢博士德生物工程有限公司）；人附睪分泌蛋白4 多克隆抗體（HE4polyclonal antibody）、糖類抗原125 單克隆抗體（CA125 monoclonal antibody，武漢三鷹生物技術有限公司）；CA125 和HE4（美國MedChemExpress 公司）；KCl（分析純，山東科源生化有限公司）；KOH、HCl、無水醋酸鋅、甲酸、檸檬酸、乙酸、甲醇和乙醇（分析純，四川西隴科學有限公司）；質譜調諧液分別為1 ng/mL 的Be、Mg、In、U 和Ce 混合標準溶液（美國PerkinElmer 公司）；氦氣（99.999%，廣西瑞達氣體有限公司（南寧））。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。除特別注明外，磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH=7.4）的濃度均為0.01 mol/L， BSA 濃度均為1%。血清樣本由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，相關研究經過相關倫理道德委員會批準，志愿者知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 AMNPs的制備

根據本研究組前期工作制備MNPs[21]。稱取0.5 g MNPs 分散在100 mL 乙醇-水（1∶1， V/V）溶液中，超聲30 min，轉入250 mL 三頸燒瓶中；在持續(xù)攪拌下加入2 mL APTES，在N₂ 保護條件下于60 ℃加熱2 h。反應結束后，冷卻至室溫，通過外部磁場分離，用水和無水乙醇交替洗滌數次，直至溶液的pH 值為中性，即得到AMNPs。在2000 Pa 壓力下于70 ℃干燥10 h， 在干燥器中保存，備用。

1.2.2 ZnO QD的制備

參考文獻[33]的方法并稍作修改合成ZnO QD（圖1A）。將含1 mol/L KOH 的甲醇溶液逐滴加入到0.1 mol/L 醋酸鋅的甲醇溶液中，磁力攪拌1 h 以控制顆粒的生長；將0.25 mL APTES 逐滴加入到上述溶液中，再加入0.5 mL 超純水，使其發(fā)生溶膠凝膠反應，得到ZnO QD。離心，用甲醇和水交替洗滌3 次，將獲得的膠體溶于水介質中。

1.2.3 SnO₂ QD的制備

參考文獻[36-37]的方法并稍作改進合成SnO₂ QD（圖1B）。稱取1.3539 g SnCl₂·2H₂O 和0.0457 g 硫脲，用30 mL 水超聲分散10 min，磁力攪拌24 h，再轉移至反應釜中，于200 ℃下反應12 h，離心，得到SnO₂ QD。將上述合成的SnO₂ QD 加入到30 mL PABA 的乙醇溶液中， 50 ℃下超聲30 min， 再置于60 ℃熱水浴中保持2 h；離心，用95%乙醇洗滌3次，在60 ℃下真空干燥2 h， 得到功能化的SnO₂ QD。

1.2.4 磁免疫反應

取0.50 mL ZnO QD 分散在5 mL PBS 溶液中，加入12.5 mg EDC 和12.5 mg NHS，反應1 h 后離心，棄去上清液，用PBS 溶液洗滌3次；加入20 μL CA125-Ab2（Affinipure goat anti-mouse IgG），攪拌反應2h，離心；用PBS溶液洗滌3次，除去未反應的CA125-Ab2，得到CA125-Ab2-ZnO QD。加入BSA以封閉非特異性吸附位點（圖1C），離心，用PBS 溶液洗滌3 次，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取0.50 mL SnO₂ QD 分散在5 mL PBS 中，加入12.5 mg EDC 和12.5 mg NHS，反應1 h 后離心，棄去上清液，用PBS 溶液洗滌3 次；加入20 μL HE4-Ab2（Affinipure goat anti-rabbit IgG），攪拌下反應2 h，離心，用PBS溶液洗滌3次，除去未反應的HE4-Ab2，得到HE4-Ab2-SnO₂ QD。加入BSA 以封閉非特異性吸附位點（圖1D），離心，用PBS溶液洗滌3次，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取15 mg AMNPs 分散在10 mL PBS 溶液中，超聲0.5 h， 加入50 mg EDC 和50 mg NHS，反應1 h；磁分離，用PBS 溶液洗滌3 次；將AMNPs 分散于2 mL PBS 溶液中，分別加入10 μL CA125-Ab1 和HE4-Ab1，攪拌反應2 h，磁分離， PBS 溶液洗滌3 次，除去未反應的CA125-Ab1 和HE4-Ab1，得到AMNPs-Ab1。加入400 μL BSA 反應1 h，以封閉非特異性吸附結合位點（圖1E）。磁分離，用PBS 溶液洗滌3 次，于4 ℃保存?zhèn)溆?。移?00 μL AMNPs-Ab1，分別加入5 μL CA125 和HE4 或血清樣品，反應80 min，引發(fā)抗原抗體特異性結合；磁分離，用PBS 溶液洗滌3 次，得到AMNPs-Ab1-CA125/HE4 復合物。分別加入100 μL CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD，反應60 min，形成雙抗夾心AMNPs-Ab1-CA125/HE4-Ab2-ZnO QD/SnO₂ QD 復合物。磁分離，用PBS 溶液洗滌3 次。以100 μL 1 mol/L 檸檬酸作為洗脫劑，超聲10 min，磁分離，收集洗脫液。移取10 μL 洗脫液，用PBS 溶液稀釋至1 mL，用于ICP-MS測試；通過空白實驗消除樣品中Zn 的干擾。

1.2.5 ICP-MS 儀器的分析條件

射頻功率為1500 W，霧化氣流速為1.0 L/min，輔助氣流速為0.8 L/min，等離子體氣流速為14 L/min，RPq 值為0.45，駐留時間為0.1 ms，氦氣碰撞氣流速為1.2 mL/min，監(jiān)控元素為⁶⁴Zn 和120Sn。

2 結果與討論

2.1 MNPs 和AMNPs的表征

采用傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared， FT-IR）光譜和透射電子顯微鏡（Transmission electronmicroscopy， TEM）對自行合成的MNPs 和AMNPs 進行表征（圖2）。如圖2A 紅外光譜中a 譜線所示，在587 cm^–1 處為Fe—O 的特征吸收峰， 1632 和3427 cm^–1 處分別為—OH 的彎曲振動和伸縮振動的吸收峰，說明成功合成了MNPs。如圖2A 中b 譜線所示，由于Fe—O—Si 鍵的特征吸收峰與Fe—O 鍵的吸收峰發(fā)生重疊，因此在598 cm^–1 處形成了新的吸收峰；827 cm^–1 處為—NH₂ 彎曲振動吸收峰；1051 cm^–1 處的峰為Si—O—Si 的對稱伸縮振動峰；位于1632 cm^–1 處的譜峰歸屬于—OH 的彎曲振動；2973 和3433 cm^–1處的峰分別為—CH₂—的反對稱伸縮振動和N—H 伸縮振動峰，表明氨基已成功修飾在MNPs 上。圖2B和2C 分別為MNPs 和AMNPs 的TEM 圖， MNPs 和AMNPs 的平均粒徑分別為8.08 和9.28 nm。

2.2 ZnO QD的表征

分別采用紫外可見吸收光譜、FT-IR 光譜、X 射線衍射（X-ray diffraction， XRD）和TEM 表征自行合成的ZnO QD。如圖3A 所示， ZnO QD 在322 nm 處有紫外吸收峰。采用FT-IR 表征ZnO QD，如圖3B 的譜線a 所示， 2923 cm^–1 處的譜峰對應C—H 鍵的不對稱伸縮振動；1108 cm^–1 處的譜峰歸屬于Si—O—Si基團；1382 cm^–1 處的譜峰是由C—H 鍵振動產生；448 cm^–1 處的譜峰由Zn—O 的伸縮振動引起；3437和1632 cm^–1 處的譜峰由N—H 伸縮振動引起。此結果表明， APTES 成功修飾在ZnO QD 表面。如圖3C的譜線a 所示， ZnO QD 的衍射峰位于31.86°、34.81°、36.3°、47.48°、56.66°、62.89°和68.16°處，分別對應（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）和（112）晶面，說明成功合成了ZnO QD。ZnO QD 的TEM 圖如圖3D 所示，可見ZnO QD 的分散性較好，平均粒徑為4.07 nm（圖3D 插圖）。

2.3 SnO₂ QD的表征

分別采用FT-IR、XRD 和TEM 表征自行合成的SnO₂ QD。如圖3B 紅外光譜中的譜線b 所示，633 cm–1 處的譜峰對應Sn—O—Sn 基團；1632 和1387 cm^–1 處的譜峰分別對應—COO–的不對稱和對稱伸縮；1177 和3432 cm^–1 處的譜峰分別對應C—H 和N—H 的伸縮振動，說明PABA 成功包裹在SnO₂ QD表面。如圖3C 的XRD 譜圖的譜線b 所示， SnO₂ QD 的位于2θ為26.61°、33.89°、37.94°、51.79°和65.94°處的衍射譜峰，分別對應（110）、（101）、（200）、（211）和（301）晶面。圖3E 的TEM 圖顯示，合成的SnO₂ QD 較分散，其平均粒徑為2.1 nm（圖3E 插圖）。

2.4 磁免疫復合物的表征

采用TEM 表征合成的AMNPs-Ab1-CA125/HE4-Ab2-ZnO QD/SnO₂ QD 復合物。如圖3F 所示，磁免疫反應后， AMNPs 表面有明顯的ZnO QD/SnO₂ QD 量子點分布（圖3F 中紅色箭頭指示），表明AMNPs-Ab1-CA125/HE4-Ab2-ZnO QD/SnO₂ QD 復合物成功合成。

2.5 磁免疫反應條件的優(yōu)化

2.5.1 封閉試劑BSA 體積的選擇

非特異性吸附會干擾免疫反應的準確性，因此在免疫反應實驗前，本研究采用BSA 封閉非特異性吸附位點，實驗操作流程見圖1。收集磁免疫反應吸附后的殘留液，考察不同體積的BSA 對免疫反應的影響。由圖4A 可知，隨著BSA 體積增加，殘留液中Zn 和Sn 信號頻數逐漸增大，當BSA 體積大于400 μL 以上，殘留液中Zn 和Sn 信號頻數保持不變。因此，選擇BSA 體積為400 μL。

2.5.2 AMNPs-Ab1 的體積及孵育時間的選擇

固定AMNPs-Ab1 的濃度為2.5 μg/mL， CA125 和HE4 的體積均為5 μL， CA125 和HE4 的濃度分別為200 U/mL 和100 ng/mL， CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 的體積均為100 μL，標記時間為1 h，考察AMNPs-Ab1 體積變化對Zn 和Sn 信號頻數的影響。實驗結果表明， Zn 和Sn 的信號頻數隨著AMNPs-Ab1 體積增加而逐漸增大，當AMNPs-Ab1 體積大于300 μL 時， Zn 和Sn 的信號頻數逐漸下降（圖4B）。因此，選擇AMNPs-Ab1 體積為300 μL。

孵育時間過短會導致抗原抗體反應不充分，過長則會增加非特異性吸附。本研究考察了AMNPs-Ab1 和CA125、HE4 的孵育時間對Zn 和Sn 信號頻數的影響，結果表明， Zn 和Sn 信號頻數隨著孵育時間延長而逐漸增大，當孵育時間大于80 min 時， Zn 和Sn 的信號頻數變化不大，說明孵育80 min 時免疫反應完全（圖4C）。因此，選擇AMNPs-Ab1 和CA125、HE4 的孵育時間為80 min 進行后續(xù)實驗。

2.5.3 CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD的體積及孵育時間的選擇

為了保證CA125-Ab2-ZnO QD、HE4-Ab2-SnO₂ QD 與AMNPs-Ab1-CA125/HE4 完全標記，需要加入過量的CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD。固定CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 濃度均為5 μg/mL，考察CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 的體積變化對Zn 和Sn 信號頻數的影響。由圖5A 可知， Zn 和Sn 信號頻數隨著CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 的體積增加而逐漸增大，當CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 的體積大于100 μL 時， Zn 和Sn 信號頻數變化較小。因此，選擇CA125-Ab2-ZnO QD 和HE4-Ab2-SnO₂ QD 體積為100 μL。

考察了CA125-Ab2-ZnO QD、HE4-Ab2-SnO₂ QD 和AMNPs-Ab1-CA125/HE4 的孵育時間對Zn 和Sn信號頻數的影響。如圖5B 所示， Zn 和Sn 信號頻數隨著孵育時間延長而逐漸增大，當孵育時間大于60 min 時， Zn 和Sn 信號頻數保持不變，說明孵育60 min 時免疫反應已經完全。因此，選擇CA125-Ab2-ZnO QD、HE4-Ab2-SnO₂ QD 和AMNPs-Ab1-CA125/HE4 的孵育時間為60 min。

2.5.4 洗脫劑的選擇

分別考察了1 mol/L HNO₃、甲酸、乙酸和檸檬酸溶液對免疫復合物的洗脫效果。由圖5C 可見，與其它洗脫劑相比，檸檬酸對免疫復合物AMNPs-Ab1-CA125/HE4-Ab2-ZnO QD/SnO₂ QD 中的ZnO QD 和SnO₂ QD 的洗脫效果較好。因此，選擇檸檬酸作為洗脫劑。

2.6 分析性能考察

在最佳實驗條件下，利用本方法分別檢測不同濃度的CA125 和HE4。結果表明，在一定濃度范圍內， ⁶⁴Zn 和120Sn 的信號頻數（y）分別與CA125 和HE4 的濃度（x）呈線性關系。其中， CA125 的線性檢測范圍為0.02～200 U/mL，線性方程為y=3.54x+9.22（R²=0.9994），檢出限為0.004 U/mL（3σ），相對標準偏差（RSD）為2.2%（n=6）；HE4 的線性檢測范圍為0.02～100 ng/mL，線性方程為y=5.59x+13.77（R²=0.9995），檢出限為0.006 ng/mL（3σ）， RSD 為3.5%（n=6）。與其它檢測CA125 和HE4 的方法相比（表1），本方法的檢出限優(yōu)于文獻[8-9，19]報道的結果。

2.7 實際樣品分析

為了驗證本方法的可行性，將本方法應用于人血清樣品中CA125 和HE4 的測定。本研究所用血清樣品來自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，未經過任何預處理直接按照上述的磁免疫分析方法進行檢測，并于3 d 內完成分析，檢測結果見表2，加標回收率為95.0%～102.0%， RSD 在2.2%～3.4%之間。

3 結論

建立了一種高靈敏的ZnO QD 和SnO₂ QD 標記抗體結合ICP-MS 單顆粒模式分析人血清中卵巢癌生物標志物CA125 和HE4 的新方法。本方法利用ZnO QD 和SnO₂ QD 分別標記CA125 和HE4 二抗，采用ICP-MS 測定Zn 和Sn 的信號頻數，進而實現對CA125 和HE4 的定量分析。本方法具有檢測靈敏度高和試劑消耗少等優(yōu)點，適用于人血清中CA125 和HE4 含量的測定。本方法在提取樣品前不需要預處理，為生物標志物的多重測定提供了技術參考，具有良好的臨床應用價值。