摘要：為探究長(zhǎng)期施用新型氮肥對(duì)玉米連作體系根際土壤固氮微生物（nifH基因）群落的影響，采集長(zhǎng)期定位試驗(yàn)（2014年始）玉米吐絲期根際土壤樣品，以不施氮肥（NO）為對(duì)照，分析同常規(guī)尿素（CU）相比，3種新型氮肥[控釋尿素（SU）、穩(wěn)定性肥料（SF）、硫包衣尿素（SCU）]的施用對(duì)土壤固氮微生物群落的影響差異。結(jié)果表明：不施氮肥處理的固氮微生物nifH基因豐度高于施氮肥處理，不同氮肥處理中，穩(wěn)定性肥料處理的固氮微生物nifH基因豐度（3.4x10 copies·g-1）顯著低于其他處理，pH（相對(duì)影響值為44.51％）和有機(jī)質(zhì)（相對(duì)影響值為35.01％）是影響固氮微生物nifH基因豐度的主要因素。與不施氮肥相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的豐富度及多樣性，與常規(guī)尿素處理相比，新型氮肥提高了nifH基因的豐富度指數(shù)但降低了多樣性指數(shù)。固氮微生物nifH基因?qū)偎街鲗?dǎo)物種為Desulfovibrio（相對(duì)豐度為14.11％-33.39％）、Stenotrophomonas（相對(duì)豐度為2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（相對(duì)豐度為2.68％-6.32％）。是否施氮對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的變化有顯著影響（P=0.001），但施用不同新型氮肥處理與常規(guī)尿素相比對(duì)群落結(jié)構(gòu)變化無(wú)顯著影響（P=0.1）。研究表明，施用新型氮肥提高了固氮微生物nifH基因豐富度，改變了固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：新型氮肥；玉米根際土壤；固氮微生物nifH基因；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S513；S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）02-0360-08 doi：10.11654/jaes.2023-0251

東北黑土區(qū)是我國(guó)最重要的商品糧主產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)國(guó)家供給側(cè)改革政策的提出雖然導(dǎo)致玉米的種植面積減少，但作為主要糧食作物的玉米仍大面積連年種植。種植結(jié)構(gòu)單一、化肥過(guò)量施用與肥料利用率較低均會(huì)導(dǎo)致土壤肥力下降、有機(jī)質(zhì)含量降低及土壤養(yǎng)分失衡。因此，優(yōu)化施肥結(jié)構(gòu)、調(diào)整施肥方式、提高肥料利用率，對(duì)于保護(hù)黑土資源和保障國(guó)家糧食安全具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)氮肥的當(dāng)季利用率僅為30％-35％，這在造成資源大量浪費(fèi)的同時(shí)降低了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)?？蒯尩誓軌蛘{(diào)控氮素釋放時(shí)間以滿(mǎn)足作物生育期內(nèi)的養(yǎng)分需求；穩(wěn)定性肥料是指在生產(chǎn)過(guò)程中加入硝化抑制劑或脲酶抑制劑或兩者同時(shí)加入，通過(guò)降低尿素在土壤中的水解速度來(lái)降低銨態(tài)氮的硝化和反硝化作用，最終達(dá)到肥料氮素緩慢釋放和減少氮素?fù)p失的一類(lèi)肥料；硫包衣尿素（以硫磺為主要包膜材料）可在補(bǔ)充硫和氮素的同時(shí)緩釋養(yǎng)分。新型氮肥具有肥效長(zhǎng)、釋放穩(wěn)定、改善土壤質(zhì)量等特點(diǎn)，新型氮肥的施用能夠減少肥料浪費(fèi)和環(huán)境污染，提高氮肥利用效率。

新型氮肥在玉米中的施用效果研究較多，主要集中在作物產(chǎn)量、土壤物理化學(xué)性質(zhì)、土壤酶活性、環(huán)境效應(yīng)、土壤細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。在生物固氮的過(guò)程中，固氮菌能夠與氮?dú)饨Y(jié)合，將不可吸收利用的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為銨態(tài)氮進(jìn)而被植物吸收利用，因此對(duì)土壤氮循環(huán)起著至關(guān)重要的作用。而關(guān)于新型氮肥施用下土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化鮮有報(bào)道。研究表明，固氮菌群落的豐度、多樣性和組成是決定土壤固氮能力的關(guān)鍵生物學(xué)因素，固氮菌群落受到土壤中各種生物和非生物因素的影響，包括肥料、土壤養(yǎng)分、耕作制度等。根際是土壤與作物進(jìn)行物質(zhì)能量交換的重要場(chǎng)所，植物通過(guò)根系分泌物來(lái)影響土壤理化性質(zhì)，其影響最先反映在根際土壤上，因此本研究在玉米連作體系下，以固氮微生物nifH基因作為固氮菌的指示基因，利用高通量測(cè)序技術(shù)，分析3種新型氮肥（控釋尿素、硫包衣尿素、穩(wěn)定性肥料）對(duì)玉米根際土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，并分析其與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系，以期為該地區(qū)高效施氮的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

長(zhǎng)期定位試驗(yàn)始于2014年，試驗(yàn)設(shè)置在吉林省梨樹(shù)縣中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)梨樹(shù)試驗(yàn)站（43°16′43.6″N，124°26′ 9.5″E）。該地區(qū)屬溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，全年降水主要集中在6-8月，年平均氣溫為6.8℃，年均降水量為614 mm。供試土壤類(lèi)型為薄層黑土，基本理化性質(zhì)如下：pH 5.74、有機(jī)質(zhì)含量為18.9 g·kg-1、堿解氮含量為87.5 mg·kg-1、速效磷含量為18.5 mg·kg-1、速效鉀含量為186.3 mg·kg-1。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：①不施氮肥（NO）；②常規(guī)尿素（CU）；③控釋尿素（SU）；④穩(wěn)定性肥料（SF）；⑤硫包衣尿素（SCU）。其中常規(guī)尿素采用28-11-11復(fù)合肥（中化化肥控股有限公司），控釋尿素為樹(shù)脂包裹的高分子無(wú)機(jī)肥料（中國(guó)-阿拉伯化肥有限公司），穩(wěn)定性肥料為同時(shí)添加脲酶和硝化抑制劑的肥料（中國(guó)-阿拉伯化肥有限公司），硫包衣控釋肥為硫磺包裹的無(wú)機(jī)肥料（上海漢楓集團(tuán)），上述氮肥施用量均為224kg·hm-2（以N計(jì)）。所有處理磷、鉀肥料施用量完全相同（P2O5 88 kg·hm-2，K2O 88 kg·hm-2），磷肥為磷酸二銨（P2O5 46％，N 18％），鉀肥采用氯化鉀（K2O60％），所有肥料作為基肥在播前一次性施入。每個(gè)處理3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)，完全隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為40 m2（寬3.6 m、長(zhǎng)11.1 m）。試驗(yàn)地為玉米連作，每年5月初播種，10月初收獲，供試玉米品種為良玉99，種植密度為65 000株·hm-2。

1.3土壤樣品采集及測(cè)定項(xiàng)目

土壤樣品采集于2021年7月玉米吐絲期，取樣器具經(jīng)滅菌處理，采用抖根法收集根際土壤樣品。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)均勻選取3個(gè)點(diǎn)，迅速去除可見(jiàn)動(dòng)植物殘?bào)w及石塊等，將3個(gè)點(diǎn)的土壤樣本過(guò)2 mm孔徑無(wú)菌網(wǎng)篩后混合均勻并作為1個(gè)土壤樣品，取5-10 g土樣裝入無(wú)菌管中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存，用于微生物提取，剩余土壤樣品4℃冷藏保存，用于土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定。土壤pH（土水比1：2.5）采用電位法測(cè)定；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；速效鉀采用NH4OAc浸提、火焰光度計(jì)法測(cè)定；速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色、分光光度計(jì)法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定。

1.4土壤DNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

微生物組DNA提取方法參照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）[Omega Stool DNA Kit]試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取得到的DNA用1％瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)，質(zhì)檢合格后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為5’-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’和5’-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’。采用絕對(duì)定量PCR檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)固氮微生物nifH基因數(shù)量。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。土壤性質(zhì)對(duì)nihH基因豐度的相對(duì)影響通過(guò)使用gbm包進(jìn)行聚合增強(qiáng)樹(shù)分析（ABT）進(jìn)行定量估計(jì)，其中500棵樹(shù)用于增強(qiáng)，5折交叉驗(yàn)證估計(jì)誤差；基于R（4.2.2）中vegan包計(jì)算細(xì)菌群落Shannon和Chaol指數(shù)；根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同樣本在各分類(lèi)水平（如域、界、門(mén)、綱、目、科、屬、種、OTU等）上的物種組成情況，利用R（4.2.2）軟件制圖；使用RColorBrewer包基于Bray-Curtis距離計(jì)算并繪制非度量多維排列分析（Multidimensional scaling，NMDS）和組間差異分析（Analysis of similarities，ANOSIM）圖；同時(shí)利用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）評(píng)估氮肥施用和肥料類(lèi)型對(duì)固氮微生物nifH基因多樣性（Alpha多樣性指數(shù)）和結(jié)構(gòu)（OTU豐度）的影響，利用R（4.2.2）軟件完成。

2結(jié)果與分析

2.1不同氮肥施用對(duì)土壤性質(zhì)的影響

不同氮肥施用對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響見(jiàn)表1。根際土壤樣本中，施氮肥處理較NO處理pH值降低了0.12-0.31個(gè)單位，其中SCU處理pH值最低，為5.37。施氮肥可提高土壤堿解氮含量，其中以SU處理最為顯著，為80.29 mg·kg-1。不同氮肥施用對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀及速效磷的影響不顯著（Pgt;0.05）。

2.2固氮微生物nifH基因豐度及土壤性狀對(duì)其的影響

由圖1a可知固氮微生物nifH基因的豐度為3.4x10-4.9x10 copies·g-1，除SF處理顯著降低外，其余施氮肥處理固氮微生物nifH基因豐度與NO處理無(wú)顯著差異。不同施氮肥處理中，SF處理的固氮微生物nifH基因豐度（3.4x10 copies·g-1）低于其他處理。土壤性質(zhì)對(duì)基因豐度的相對(duì)影響由ABT模型確定（圖1b），其中pH和有機(jī)質(zhì)是影響固氮微生物nifH基因豐度的主要因素，相對(duì)影響值分別為44.51％和35.01％。

2.3不同新型氮肥對(duì)nifH基因Alpha多樣性的影響

本文中的Alpha多樣性指數(shù)通過(guò)Chaol和Shannon指數(shù)進(jìn)行分析，Chaol指數(shù)用來(lái)評(píng)估樣品中所含OTU的總數(shù)，其值越大nifH基因豐富度越高。與NO處理相比，氮肥施用降低了nifH基因豐富度，其中SF處理降低比例最大，降低了16.6％；不同氮肥施用處理中，新型氮肥處理的固氮微生物nifH基因豐富度高于CU處理。

Shannon指數(shù)用來(lái)估算固氮微生物nifH基因多樣性，其值越大，多樣性越高。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，NO處理的固氮微生物nifH基因多樣性高于施氮處理；不同氮肥施用處理中，SF和SCU處理的nifH基因多樣性指數(shù)低于CU處理，但均未造成顯著差異。

2.4不同新型氮肥對(duì)固氮微生物群落Bate多樣性的影響

圖3為固氮微生物的NMDS分析，應(yīng)力函數(shù)值（Stress=0.132）小于0.2，說(shuō)明NMDS分析排序性良好，可準(zhǔn)確反映樣本點(diǎn)的真實(shí)分布情況。NO處理與CU、SU、SF、SCU處理明顯分離，不同氮肥施用處理的空間分布較集中。ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)，施氮肥處理與NO處理間存在顯著差異（P=0.001），但施用不同新型氮肥處理與CU處理間不存在顯著差異（P=0.1）。

由表2可知，施氮顯著影響（P=0.002）固氮微生物群落結(jié)構(gòu)，氮肥類(lèi)型顯著影響（P=0.006）nifH基因多樣性。

2.5不同新型氮肥對(duì)土壤固氮微生物群落組成的影響

由圖4可知固氮微生物nifH基因?qū)偎阶⑨尳Y(jié)果中共有10個(gè)菌屬，其中Desulfovibrio（脫硫弧菌，豐度為14.11％-33.40％）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌，豐度為2.66％-17.72％）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌，豐度為2.68％-6.32％）為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。除Others外，Desulfovibrio在NO和SU處理中注釋結(jié)果豐度最高，占比分別為27.34％和33.40％；而CU和SF處理中固氮微生物nifH基因注釋結(jié)果豐度最高的屬為Stenotrophomonas，占比分別為14.92％和17.72％。與NO相比，SU、SF、SCU處理Stenotrophomonas的相對(duì)豐度分別顯著提高了44.00％、48.65％和100.00％，SU、SCU處理Bradyrhizobium的相對(duì)豐度分別降低了31.29％和34.30％，而SF處理使Bradyrhizobium的相對(duì)豐度提高了42.92％。與CU處理相比，SU、SF、SCU處理Stenotrophomonas的相對(duì)豐度分別降低了47.51％、15.81％、22.80％，Bradyrhizobium的相對(duì)豐度分別提高了13.66％、136.66％、8.53％。

3討論

土壤固氮菌群落對(duì)氮肥添加的響應(yīng)對(duì)土壤氮供應(yīng)的可持續(xù)性非常重要，關(guān)于固氮微生物的研究已經(jīng)有很多，其中有研究表明不同肥料可使固氮微生物多樣性及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本研究中（圖1a），施氮處理的固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)低于不施氮肥處理，這與李穎在玉米／大豆間作體系試驗(yàn)中得到的隨著施氮量的增加固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)逐漸下降的研究結(jié)果一致，且本研究結(jié)果并未表現(xiàn)出顯著差異，也與多數(shù)研究中氮肥的添加對(duì)固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)的變化無(wú)顯著影響的結(jié)果一致。ABT分析結(jié)果（圖1b）表明，土壤pH是驅(qū)動(dòng)土壤固氮菌生長(zhǎng)的主要因素，作為外源養(yǎng)分，氮肥在調(diào)節(jié)土壤pH方面發(fā)揮了重要作用，氮肥對(duì)土壤pH的調(diào)節(jié)間接影響了固氮微生物nifH基因豐度。本研究中，與不施氮相比，氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的Alpha多樣性指數(shù)，這與一項(xiàng)對(duì)東北黑土區(qū)玉米根際微生物群落的研究結(jié)果一致，微生物群落對(duì)氮的輸入具有抗性，隨著氮輸入的增加，Alpha多樣性顯著降低。新型氮肥相比常規(guī)尿素施用增加了固氮微生物nifH基因豐富度但降低了多樣性，可能原因是新型氮肥能夠延緩氮素釋放，使整個(gè)生育期內(nèi)的固氮微生物大量富集。

對(duì)固氮微生物nifH基因?qū)偎阶⑨尳Y(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，劉爽等的研究也證明在固氮微生物nifH相關(guān)分析中，Stenotrophomonas和Bradyrhizobium屬的相對(duì)豐度較高。本研究發(fā)現(xiàn)與不施氮肥和施用常規(guī)尿素相比，施用新型氮肥處理顯著提高了Stenotrophomonas菌屬的相對(duì)豐度，包?；ǖ难芯堪l(fā)現(xiàn)Stenotroph-omonas菌屬與農(nóng)田氮轉(zhuǎn)化相關(guān)，是一種能降解硝酸鹽、降低總氮含量的菌，正由于這種特性，導(dǎo)致它在施用新型氮肥處理中具有較高的含量，同時(shí)王保莉等研究發(fā)現(xiàn)，在以硝酸鈉為氮肥的處理中Stenotrophomonas為優(yōu)勢(shì)菌屬，說(shuō)明施用不同類(lèi)型的氮肥會(huì)造成Stenotrophomonas菌屬相對(duì)豐度的改變。而所有處理中，只有SF處理提高了Bradyrhizobium的相對(duì)豐度，其余處理均為降低趨勢(shì)，Bradyrhizobium為慢生型根瘤菌，施用不同類(lèi)型的氮肥會(huì)導(dǎo)致Bradyrhizobium相對(duì)豐度的變化，而Mark等發(fā)現(xiàn)Bradyrhizobium可以促進(jìn)作物對(duì)氮的吸收，增加作物產(chǎn)量，這與本研究在分析作物產(chǎn)量部分的研究結(jié)果一致，即施穩(wěn)定性肥料處理的作物產(chǎn)量最高。

施氮與不施氮處理在NMDS分析中明顯分離，但3種新型氮肥與常規(guī)尿素相比，固氮微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，ANOSIM結(jié)果與其相同。為了進(jìn)一步驗(yàn)證施用氮肥和氮肥類(lèi)型對(duì)固氮微生物nifH基因多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，本研究進(jìn)行了PERMANOVA分析，結(jié)果與ANOSIM分析一致，氮肥類(lèi)型對(duì)固氮微生物nifH基因多樣性的影響更大，而群落結(jié)構(gòu)主要受施氮影響。這與Chen等在東北黑土上一項(xiàng)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)結(jié)果一致，即不同含量氮肥的施用顯著影響固氮菌的群落結(jié)構(gòu)。不同類(lèi)型新型氮肥對(duì)固氮微生物nifH基因結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，可能原因是玉米連年種植均施用氮肥，在長(zhǎng)期定位的8年間，根際效應(yīng)形成了穩(wěn)定的微生物群落，因此新型氮肥類(lèi)型不會(huì)造成當(dāng)季的顯著差異。

4結(jié)論

長(zhǎng)期定位田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，新型氮肥通過(guò)影響土壤pH及有機(jī)質(zhì)影響固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)。與常規(guī)尿素處理相比，新型氮肥的施用降低了固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)，其中以施穩(wěn)定性肥料處理降低效果最為顯著；新型氮肥施用顯著影響固氮微生物nifH基因的Alpha多樣性指數(shù)，但對(duì)固氮微生物nifH基因群落結(jié)構(gòu)的影響并不顯著。