摘 要：豬苓作為一種藥用真菌，在醫(yī)藥界備受青睞，但由于野生資源逐漸匱乏，開展豬苓人工栽培已成為一種趨勢。本試驗(yàn)從濕度、黑曲霉ZM-8液、生物素的使用等幾方面探究豬苓菌核快速形成的最佳配方。研究結(jié)果表明：黑曲霉ZM-8的加入，有助于豬苓菌核和蜜環(huán)菌菌索的形成與生長。適宜濃度的生物素對豬苓菌核的形成也有極大的促進(jìn)作用。在四種主要影響因素中，濕度水平對豬苓菌核形成影響最大。控制培養(yǎng)基濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。該條件下培養(yǎng)30 d豬苓菌核直徑可達(dá)32.8 mm。

關(guān)鍵詞：豬苓；蜜環(huán)菌；菌核；條件優(yōu)化

中圖分類號：R282.2" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）10-0052-05

收稿日期：2024-02-05 修回日期：2024-03-13

基金項(xiàng)目：渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院2023年度院級科研計(jì)劃項(xiàng)目（WZYYZ202309）。

第一作者簡介：郭楠（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)樗幱谜婢A(chǔ)研究。

Study on Condition Optimization for Sclerotial Formation "of %Polyporus Umbellatus%

GUO Nan1， ZHANG Zongzhou2

（1.Weinan Vocational and Technical College， Weinan， Shaanxi 714026， China; 2.School of Bioengineering and Biotechnology， Tianshui Normal University， Tianshui， Gansu" 741001， China）

Abstract： %Polyporus umbellatus %is a medicinal fungus that is highly valued in the pharmaceutical industry. Due to the gradual depletion of wild resources， artificial cultivation of Polyporus umbellatus has become a trend. This study investigated the optimal formula for the rapid formation of sclerotia in %Polyporus umbellatus% from several aspects， including humidity， Aspergillus niger ZM-8 liquid concentration， and biotin supplementation. The results indicate that the introduction of %Aspergillus niger% ZM-8 significantly enhances the formation and growth of both sclerotia and %Armillaria mellea %rhizomorphs. Additionally， an appropriate concentration of biotin plays a crucial role in promoting sclerotial formation. Among the four main factors tested， the optimal conditions for sclerotial formation of %Polyporus umbellatus %were identified as： medium humidity at 50%， 25 mL of %Aspergillus niger %ZM-8 liquid， 12 ppm of 30 alkanol （specify if possible）， and 15 ppm of NAA. Under these conditions， the diameter of %Polyporus umbellatus% sclerotia could reach up to 32.8 mm after 30 days.

Key words：%Polyporus umbellatus; Armillaria mellea; %Sclerotium; Condition optimization

豬苓是一種珍貴的真菌類中藥材［1］，屬擔(dān)子菌門、多孔菌科、多孔菌屬[5，12]。豬苓味甘、性平，有利水、消腫的功效［2］，中醫(yī)臨床上常用于治療急性腎炎、全身浮腫、小便不暢、尿急尿頻、急性肝炎等疾病。隨著醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，以豬苓為原料的成品藥不斷開發(fā)，保護(hù)豬苓野生資源，開展豬苓人工栽培勢在必行［3］。

豬苓的生長發(fā)育需經(jīng)過擔(dān)孢子、菌絲體、菌核和子實(shí)體四個(gè)階段。擔(dān)孢子在適宜的條件下萌發(fā)成菌絲和次生菌絲，構(gòu)成菌絲體，無數(shù)菌絲纏繞構(gòu)成菌核。菌核多年生，能貯存營養(yǎng)，環(huán)境不適時(shí)可長期休眠，遇蜜環(huán)菌和適宜的環(huán)境能萌生菌絲，串破菌核表層[4，10]，形成白苓，進(jìn)而開始下一輪無性繁殖過程。豬苓菌核具有利水、滲濕、消腫等功能，其多糖對動(dòng)物移植性腫瘤有抑制作用[5]。豬苓菌核國內(nèi)及出口用量大，野生資源日益減少，雖然利用蜜環(huán)菌伴栽豬苓菌核人工栽培[8，9]和菌絲發(fā)酵[6]已獲得成功，但由于豬苓菌核生長緩慢、繁殖率低、種苓缺乏，為此很難提供大量豬苓菌核用于人工栽培，限制了豬苓栽培的規(guī)模。

人工室內(nèi)促生豬苓種，即人工培養(yǎng)豬苓菌核，可以為半人工栽培豬苓提供無限的種源，又能打破豬苓栽培的時(shí)空限制，推動(dòng)豬苓栽培業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，豬苓栽培的第一步也是研究豬苓菌核的形成問題，也就是如何讓豬苓孢子在最適的培養(yǎng)條件下形成大量的菌絲，又讓這大量的菌絲交織在一起快速的形成豐滿的菌核，這是目前亟待解決的問題，也是豬苓人工栽培中最難解決的問題。本研究的目的是找到豬苓菌核形成的最佳外界條件，掌握豬苓菌核形成的基本規(guī)律，以推動(dòng)豬苓菌核的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 豬苓原種、蜜環(huán)菌原種由天水師范學(xué)院微生物研究室提供的雜木屑原種。

1.1.2 原料 鋸末、麩皮、馬鈴薯、玉米面、大豆面、蛋白胨、白糖、石膏粉等。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 鋸末75%、麥麩14%、玉米面5%、大豆面2%、蛋白胨1%、白糖1%、多維磷酸二氫鉀1%、石膏粉1%、加豬苓寶2#0.3%，加水至含水55%左右。

1.1.4 器材 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機(jī)械廠）電子天平、恒溫培養(yǎng)箱（上海恒科技有限公司）、酒精燈、培養(yǎng)皿、電爐、量筒、500 mL三角瓶、250 mL菌種瓶、500 mL菌種瓶、濾紙、多個(gè)1 mL移液管。

1.2 方法

1.2.1 蜜環(huán)菌、豬苓栽培種培養(yǎng)將配料拌勻，裝瓶，松緊適度，中間插一孔，用棉花做塞子，滅菌。分別接種豬苓、蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。后置于黑暗條件下培養(yǎng)30 d，注意觀察。

1.2.2 豬苓菌核形成條件優(yōu)化

（1）黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響。

黑曲霉對豬苓菌核和蜜環(huán)菌菌索的形成有促進(jìn)作用，是偶然發(fā)現(xiàn)的。之后我們著意用幾種黑曲霉感染，取得了較好的效果。培養(yǎng)基配方同上。分別接種野生黑曲霉、黑曲霉UV-11、黑曲霉ZM-8各1 mL，對照不接，重復(fù)6次。其中3次接種豬苓菌種，另外3次接種蜜環(huán)菌菌種。培養(yǎng)30 d，取3個(gè)樣的平均數(shù)。

（2）生物素對豬苓菌核的促進(jìn)作用[11]?？紤]到豬苓生長速度比較緩慢，一般自然界一年才能形成豬苓種，三年以上才能長成商品豬苓，為促生豬苓種，我們引入了生物素試驗(yàn)。

1#處理：馬鈴薯100 g；白糖10 g；牛肉膏5 g；KH-2PO-4 2 g；瓊脂8 g；自來水500 mL（馬鈴薯煮化）。制成500 mL特殊的PDA培養(yǎng)基。滅菌，并倒成20個(gè)培養(yǎng)皿，每皿加滅過菌的中性濾紙一張。加生物素液0.5 mL。生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的濃度，分別形成1#A、1#B、1#C、1#D四個(gè)處理，每處理4個(gè)重復(fù)。對照1#CK，不加生物素，重復(fù)4個(gè)。只接種豬苓菌種，25℃培養(yǎng)30 d。

2#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的濃度，分別形成2#A、2#B、2#C、2#D四個(gè)處理，每處理4個(gè)重復(fù)。對照2#CK，不加生物素，重復(fù)4個(gè)。同時(shí)接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

3#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的濃度，分別形成3#A、3#B、3#C、3#D四個(gè)處理，每處理4個(gè)重復(fù)。對照3#CK，不加生物素，重復(fù)4個(gè)。只接種豬苓菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

4#處理：培養(yǎng)基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的濃度，分別形成4#A、4#B、4#C、4#D四個(gè)處理，每處理4個(gè)重復(fù)。對照4#CK， 不加生物素，重復(fù)4個(gè)。同時(shí)接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d。

1.2.3 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度）[7] 黑曲霉ZM-8液的制作方法：稱取5 g黑曲霉ZM-8，加500 mL水浸泡在三角瓶中10 h，置高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后使用。

在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，這次重點(diǎn)討論萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度等四因素對豬苓菌核形成的影響。我們設(shè)置四因素三水平正交試驗(yàn)。萘乙酸5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg；三十烷醇4 mg/kg、8 mg/kg、

12 mg/kg；黑曲霉ZM-8液15 mL、20 mL、25 mL；培養(yǎng)基濕度50%、60%、70%。設(shè)置9個(gè)處理，每處理5個(gè)重復(fù)，共1個(gè)對照。將配料拌勻，裝入培養(yǎng)皿，每皿約10 g左右，保持皿內(nèi)培養(yǎng)基疏松。滅菌，接種豬苓菌種，25 ℃培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)生長結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響

菌核的形成是豬苓產(chǎn)生的第一步，由表1可以看出：野生黑曲霉對豬苓菌核的產(chǎn)生有益，30d菌核平均可達(dá)13.2 mm；接種黑曲霉UV-11，菌核平均可達(dá)14.4 mm；接種黑曲霉ZM-8，菌核平均可達(dá)16.8 mm，而不接黑曲霉的對照樣品在30 d根本無法產(chǎn)生菌核。試驗(yàn)結(jié)果可知接種黑曲霉ZM-8，菌核大而飽滿，不接黑曲霉的對照組菌絲較白，但無菌核產(chǎn)生。蜜環(huán)菌菌索的生長也受黑曲霉的影響，接種野生黑曲霉，蜜環(huán)菌菌索30 d平均可達(dá)17 mm；接種黑曲霉UV-11，蜜環(huán)菌菌索30 d平均可達(dá)34 mm；蜜環(huán)菌菌索接種黑曲霉ZM-8，30 d平均可達(dá)51 mm，而不接黑曲霉的對照樣品在30 d菌索長度只有8 mm。由此說明，黑曲霉不影響蜜環(huán)菌菌索的產(chǎn)生，但影響蜜環(huán)菌菌索的生長速度，特別是接種黑曲霉ZM-8，蜜環(huán)菌菌索的長度是對照組的6.38倍，影響相當(dāng)之大。這一發(fā)現(xiàn)將成為豬苓生產(chǎn)中的一個(gè)重要措施。

2.2 生物素對豬苓菌核形成的影響

從表2可以看出，生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促進(jìn)豬苓菌核的形成。1#處理只接種豬苓菌種，在萘乙酸濃度10 mg/kg時(shí)達(dá)到高峰，豬苓菌核直徑18.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大

14.2 mm。2#處理接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，在萘乙酸濃度10" mg/kg時(shí)達(dá)到高峰，豬苓菌核直徑20.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大12.5 mm。3#、4#處理加的三十烷醇，在8" mg/kg時(shí)達(dá)到高峰，菌核分別比不加三十烷醇大10.2 mm和8.5 mm。且相同加量下，生物素濃度越高，豬苓菌核生長速度越慢。同時(shí)認(rèn)為加萘乙酸比加三十烷醇的效果更好。另一方面，在萘乙酸濃度10" mg/kg和三十烷醇濃度8" mg/kg時(shí)，同時(shí)接種蜜環(huán)菌和豬苓菌種的2#和4#比只接種豬苓菌種的1#和3#菌核直徑大2 mm，由此說明：蜜環(huán)菌能為豬苓提供營養(yǎng)，也說明豬苓可以脫離蜜環(huán)菌自己吸收營養(yǎng)。在營養(yǎng)充足的情況下，豬苓是可以單獨(dú)生長的，打破了豬苓必須依靠蜜環(huán)菌提供營養(yǎng)才能生長的定勢思維。

2.3 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度、）的正交試驗(yàn)結(jié)果

在條件優(yōu)化中，豬苓菌核形成條件的正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表3，不同因素的正交試驗(yàn)結(jié)果（L-9（34））如表4。設(shè)計(jì)的因素與因素水平，是在原來單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的。

從表4可以看出，培養(yǎng)基濕度水平的極差、ZM-8液水平的極差、三十烷醇水平的極差和萘乙酸水平的極差分別是12.4、10.83、8.03和1.7。說明在環(huán)境條件的確定中，濕度對豬苓菌核生長的影響最大，濕度的改變明顯影響豬苓的生長及大小；萘乙酸水平對豬苓菌核生長的影響最小。在9個(gè)處理中，處理3的豬苓菌核直徑最大，可達(dá)32.8 mm，處理6的豬苓菌核直徑最小，僅9.8 mm。處理3菌核直徑是處理6菌核直徑的3.35倍，所以認(rèn)為處理3的條件適宜豬苓菌核的形成。也就是控制空氣濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。在這個(gè)條件下30 d，豬苓菌核直徑可達(dá)32.8 mm，這樣大小的豬苓菌核可以直接用于豬苓生產(chǎn)。

3 小結(jié)與討論

3.1 單因素試驗(yàn)討論

3.1.1 黑曲霉ZM-8對蜜環(huán)菌菌索和豬苓菌核形成的影響

在自然界可能也存在促進(jìn)豬苓菌核形成的因素。我們在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，形成豬苓菌核的培養(yǎng)基被黑曲霉感染后不會阻礙豬苓菌核的形成，反而會促進(jìn)豬苓菌核的形成。之后，采用幾種黑曲霉去侵染，取得了較好的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黑曲霉可以促進(jìn)豬苓菌核的形成，特別是黑曲霉ZM-8菌株。黑曲霉ZM-8可以促進(jìn)豬苓菌核的產(chǎn)生和膨大，也能促進(jìn)蜜環(huán)菌菌索的伸長，接種黑曲霉ZM-8蜜環(huán)菌菌索的長度是對照的6.38倍。

3.1.2 生物素對豬苓菌核形成的影響 生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促進(jìn)豬苓菌核的形成。僅接種豬苓菌種的處理，在萘乙酸濃度10 mg/kg達(dá)到高峰，豬苓菌核直徑18.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大14.2 mm。接種豬苓菌種和蜜環(huán)菌菌種，在萘乙酸濃度10 mg/kg達(dá)到高峰，豬苓菌核直徑20.5 mm，比不加萘乙酸的處理菌核直徑大12.5 mm。加三十烷醇，在8 mg/kg時(shí)達(dá)到高峰，分別比不加三十烷醇菌核大10.2 mm和8.5 mm。在生物素影響豬苓菌核形成的過程中我們還發(fā)現(xiàn)，豬苓可以獨(dú)立吸收營養(yǎng)，形成菌核，也可以借助蜜環(huán)菌的菌索提供營養(yǎng)形成菌核，蜜環(huán)菌的存在有助于豬苓菌核的產(chǎn)生與生長。

3.2 條件優(yōu)化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、濕度）的正交試驗(yàn)討論

在四種主要影響因素中，培養(yǎng)基濕度水平對豬苓菌核形成影響最大，黑曲霉ZM-8液影響次之。培養(yǎng)基相對最佳濕度是50%。條件優(yōu)化中認(rèn)為：控制培養(yǎng)基濕度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的條件最適宜豬苓菌核的形成。在這個(gè)條件下30 d，豬苓菌核直徑可達(dá)32.8 mm。黑曲霉ZM-8液的加入啟發(fā)我們，它在豬苓菌核形成的培養(yǎng)基中可能充當(dāng)著某種營養(yǎng)成份，有待進(jìn)一步研究。

促生豬苓種，即人工培養(yǎng)豬苓菌核，可以為栽培豬苓提供無限的種源，又能打破豬苓栽培的時(shí)空限制，推動(dòng)豬苓栽培業(yè)的發(fā)展。

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