摘 要： 本研究旨在體外原核表達(dá)貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus， FIPV）SH2021株核衣殼蛋白（nucleocapsid， N），制備兔源多克隆抗體。根據(jù)FIPV SH2021株N基因序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建pCold-I-N重組表達(dá)質(zhì)粒。隨后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），在終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG和16 ℃的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行表達(dá)。最后，利用His層析柱進(jìn)行純化，純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。結(jié)果表明，純化獲得重組N蛋白大小約為45 ku，制備的N蛋白兔多克隆抗體效價(jià)可達(dá) 1∶512 000，該抗體對(duì)N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本研究成功所制備了FIPV N蛋白兔多克隆抗體，該抗體具有良好的反應(yīng)原性和特異性，為FIPV抗原抗體檢測(cè)以及研究N蛋白生物學(xué)功能研究提供重要工具。

關(guān)鍵詞： 貓傳染性腹膜炎病毒；貓冠狀病毒；N蛋白；基因克隆；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4773-06

收稿日期：2023-10-07

基金項(xiàng)目：上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)（ZD2021CY001）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22ZR1476300）

作者簡(jiǎn)介：劉?？担?998-），男，甘肅慶陽(yáng)人，碩士生，主要從事動(dòng)物解剖與組織胚胎學(xué)研究，E-mail： liufukang1015@163.com

*通信作者：袁莉剛，主要從事動(dòng)物解剖與組織胚胎學(xué)、動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail： yuan2918@126.com；朱 杰，主要從事小動(dòng)物病毒分子機(jī)制研究，E-mail： zj121@shvri.ac.cn

Preparation and Application of N Protein Polyclonal Antibody of Feline Infectious Peritonitis

Virus SH2021 Strain

LIU" Fukang1，2， YUAN" Ligang1*， ZHANG" Da2， TANG" Aoxing2， LIU" Guangqing2， ZHU" Jie2*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

Shanghai Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai" 200241，

China）

Abstract：" This study aimed to express the nucleocapsid protein （N） of feline infectious peritonitis virus （FIPV） strain SH2021 in vitro and prepare rabbit polyclonal antibodies. Primers were designed based on the N gene sequence of FIPV strain SH2021 to construct the recombinant expression plasmid pCold-I-N. Subsequently， the recombinant plasmid was transformed into expression-competent cells BL21 （DE3）， and expression was induced under conditions of 1.0 mmol·L-1 IPTG and 16 ℃. Finally， purification was performed using a His column， and the purified recombinant protein was used to immunize New Zealand white rabbits to prepare polyclonal antibodies. The experimental results showed that the purified recombinant N protein had a size of approximately 45 ku， and the titer of the prepared rabbit polyclonal antibodies against the N protein reached 1∶512 000. The antibodies exhibited good reactivity and specificity towards the N protein. This study successfully prepared rabbit polyclonal antibodies against the FIPV N protein， which showed good reactivity and specificity， providing important tools for FIPV antigen-antibody detection and research on the biological functions of the N protein.

Key words： feline infectious peritonitis virus; feline coronavirus; N protein; gene cloning; prokaryotic expression; polyclonal antibody

*Corresponding authors：" YUAN Ligang， E-mail： yuan2918@126.com; ZHU Jie， E-mail： zj121@shvri.ac.cn

貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）是貓群中常見(jiàn)的致死性病毒［1］， 屬于α冠狀病毒科，α冠狀病毒屬［2-3］，有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒［4］，F(xiàn)IPV引起全身系統(tǒng)性疾病，主要臨床癥狀分為3種，1）濕性，主要表現(xiàn)為患貓出現(xiàn)胸水或腹水；2）干性，主要表現(xiàn)為多組織臟器出現(xiàn)肉芽腫；3）混合性FIP，很少見(jiàn)，其可能是由濕性到干性或干性到濕性的過(guò)渡階段［5-6］。根據(jù)S基因序列差異和病毒中和抗體反應(yīng)，F(xiàn)CoV分為兩種血清型：Ⅰ型和Ⅱ型［7］。目前，我國(guó)以流行I型毒株為主，Ⅱ型毒株偶有報(bào)道。

N蛋白為冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量約45 ku，在調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞免疫和細(xì)胞周期等方面具有重要作用［8］。該蛋白免疫原性較高，在病毒感染早期即可分泌到體液中，為抗原檢測(cè)的主要標(biāo)志物，因此，N蛋白抗體可用來(lái)檢測(cè)冠狀病毒感染［9］。在N蛋白結(jié)構(gòu)方面，有研究表明，冠狀病毒N蛋白高度保守，具有相似的結(jié)構(gòu)［10］，可用于抗原診斷、病毒學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)診斷工具的開(kāi)發(fā)。本研究利用重組蛋白制備所得多抗，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，為FCoV的研究、診斷與鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pCold-I載體質(zhì)粒、貓腎細(xì)胞（Crandell-Rees feline kidney，CRFK）、FIPV-SH2021毒株（GenBank 登錄號(hào)：OR295209）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所伴侶動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)保存。8周齡新西蘭大白兔購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)碼：SCXX（滬） 2020-0123］。

1.2 N基因擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒pCold-I-N構(gòu)建

提取FIPV-SH2021 毒株感染的 CRFK 細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。并以該cDNA為模板，利用FIPV N引物（FIPV-N-F：5′-TATGGAGCT-CGGTACCATGGCCACACAGGGACAACGCGT-C-3′，F(xiàn)IPV-N-R：5′-CGACAAGCTTGAATTCTTAGTTCGTAACCTCATCAATCAT-3′）擴(kuò)增該毒株N基因全長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。隨后利用 EcoRⅠ和 KpnⅠ內(nèi)切酶對(duì)pCold-I載體雙酶切后進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后，挑選單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果正確的菌株小提質(zhì)粒即得到重組原核質(zhì)粒。

1.3 重組N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將上述pCold-I-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于E. coli BL21（DE3），挑單克隆接種于5 mL 氨芐抗性LB培養(yǎng)液中，按照1∶100接種于200 mL培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，菌液OD600 nm為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，以16 ℃誘導(dǎo)16 h，根據(jù)BeyoGoldTM His-tag Purification Resin（耐還原螯合型）蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化、洗滌、洗脫后留樣分析蛋白純化效果，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將符合免疫要求的洗脫液收集透析去除咪唑，使用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定濃度。

1.4 兔源N蛋白多克隆抗體的制備

所得重組蛋白與等體積弗氏佐劑混合乳化作為免疫原，免疫6周齡新西蘭大白兔，背部皮下多點(diǎn)注射免疫，第三次免疫后一周，以心臟采血方式收集血清，即得到兔源FIPV N蛋白多克隆抗體。

1.5 ELISA測(cè)定兔抗N多克隆抗體效價(jià)

用N重組蛋白包被ELISA板：用pH=9.6碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋N蛋白濃度至 2 μg·mL-1，一抗為不同稀釋度的多克隆抗體；二抗為添加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000 稀釋），滴加TMB顯色，使用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處的吸光值。設(shè)置兔陰性血清為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。

1.6 Western blot檢測(cè)

收集FIPV-SH2021毒株感染的CRFK細(xì)胞，電泳分離將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，兔抗N蛋白血清作為一抗（稀釋比1∶200），β-actin抗體（1∶1 000稀釋），HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗（1∶10 000稀釋），洗膜后顯影。

1.7 間接免疫熒光檢測(cè)（IFA）

FIPV-SH2021毒株MOI=0.1接種CRFK細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，兔抗N蛋白血清作為一抗（稀釋比1∶200），PBS稀釋二抗避光孵育，PBS稀釋 DAPI（1∶5 000）避光染色，觀察并拍照。設(shè)置未免疫兔陰性血清作為陰性對(duì)照。

1.8 免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)

采用免疫組化法對(duì)FIPV陽(yáng)性病死貓組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。石蠟切片常規(guī)脫蠟，高壓修復(fù)抗原，N蛋白多克隆抗體（稀釋度1∶1 000）作為一抗，孵育二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液；DAB顯色液顯色后觀察并拍照。陰性對(duì)照以PBS代替一抗進(jìn)行染色。

2 結(jié) "果

2.1 FIPV SH2021株N蛋白克隆與表達(dá)

利用特異性引物擴(kuò)增FIPV-SH2021毒株N基"" 因，經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測(cè)，特異性條帶與預(yù)期片段大?。? 124 bp）基本一致（圖 1A）；使用EcoRⅠ 和 KpnⅠ內(nèi)切酶（圖 1B）后進(jìn)行無(wú)縫克隆重組反應(yīng)并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確，表明pCold-I-N重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白在約45 ku左右出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期相符，且N蛋白以上清形式表達(dá)較多（圖 1C泳道3）。純化蛋白保留E4、E5、E6（圖 1D中的12、13、14泳道）洗脫液并混合測(cè)得蛋白濃度為0.57 mg·mL-1。

2.2 N蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，該抗體效價(jià)可達(dá)1∶512 000（圖2）。

2.3 N蛋白多克降抗體與 FIPV-SH2021株N蛋白特異性結(jié)合

Western blot結(jié)果顯示（圖 3A），在40～55 ku有一條清晰的條帶，對(duì)照組未見(jiàn)條帶。該結(jié)果表明，制備所得多抗特異性強(qiáng)。IFA結(jié)果顯示（圖 3B），F(xiàn)IPV-SH2021毒株感染組細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光，而感染組和陰性血清組未見(jiàn)，證明該多抗的特異性強(qiáng)、靈敏性高。

2.4 IHC檢測(cè)N蛋白多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性

早期貓冠狀病毒感染主要集中在腸道，為此選擇十二指腸進(jìn)行免疫組化。IHC結(jié)果顯示，陽(yáng)性組織細(xì)胞間存在黃褐色顆粒，該黃褐色顆粒表明病毒感染的細(xì)胞表達(dá)N蛋白，對(duì)照組未見(jiàn)（圖 4）。該結(jié)果證明該多抗有較好的反應(yīng)性、特異性和靈敏性。

3 討 論

冠狀病毒（coronavirus， CoVs）是一種在自然界中分布廣泛的 RNA 病毒，宿主范圍廣泛，包括哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類。近年來(lái)，形成了全球大流行的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅到畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全［11］。在冠狀病毒所編碼的抗原中S 蛋白與其入侵機(jī)體密切相關(guān)，S 蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但S蛋白相較于N蛋白而言，其易突變且保守性較低。相比之下，N蛋白具有較高的免疫原性，可以在早期感染時(shí)分泌到體液中，因此有可能作為抗原檢測(cè)的生物標(biāo)志。冠狀病毒的N蛋白是病毒最為豐富的組成部分，其具有多種功能，如與基因組RNA形成復(fù)合物，在病毒組裝期間與病毒膜蛋白相互作用，提高轉(zhuǎn)錄和裝配效率以及在致病過(guò)程中起關(guān)鍵作用［12］。N蛋白具有多功能性、高表達(dá)量、高度保守，且在病毒感染后機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)N蛋白的抗體，具有產(chǎn)生時(shí)間較早、抗體水平高和維持時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此N蛋白常被作為PDCoV的診斷抗原［13］。

多克隆抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)，成本低、周期短、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、可識(shí)別的抗原多樣化、檢測(cè)靈敏度高［14］。在FIPV的研究報(bào)道中，對(duì) N 蛋白制備多抗的報(bào)道較少，根據(jù)對(duì) N 蛋白的結(jié)構(gòu)功能分析，該蛋白可以作為診斷候選抗原，因此本研究選擇 N 蛋白制備多克隆抗體。本研究所表達(dá)的 N 蛋白以上清表達(dá)的形式存在，通過(guò)鎳柱純化獲得高濃度的 N 蛋白，以該重組蛋白為免疫原制備兔源 N 蛋白多抗。經(jīng)驗(yàn)證表明兔源 N 蛋白抗體有較強(qiáng)的特異性，能夠特異地識(shí)別目的蛋白，同時(shí)使用原核表達(dá)純化的 N 抗原可以進(jìn)行間接 ELISA 試驗(yàn)驗(yàn)證。該多抗的制備對(duì) FIPV 的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室研究具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)純化FIPV-SH2021株N蛋白，并成功制備兔源N蛋白多克隆抗體，經(jīng)試驗(yàn)證明該多抗具有良好的反應(yīng)性和特異性。

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（編輯 白永平）