摘 要： 本研究旨在建立一種豬瘟病毒E2單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，用于評(píng)價(jià)豬瘟C株弱毒苗和E2亞單位疫苗的免疫效果。首先，構(gòu)建豬瘟E2桿狀病毒表達(dá)載體pFastBAC，通過(guò)懸浮培養(yǎng)SF9細(xì)胞高效表達(dá)E2蛋白；其次，用純化的E2蛋白免疫BABL/c小鼠，通過(guò)流式分選IgM-PE-/E2-APC+型單個(gè)B細(xì)胞。然后，利用半巢式PCR分別擴(kuò)增E2特異性IgG抗體的重鏈和輕鏈，測(cè)序后將抗體重鏈及輕鏈構(gòu)建到pCDNA3.1載體，再將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，制備豬瘟E2單克隆抗體。結(jié)果表明，本研究通過(guò)單B細(xì)胞分選技術(shù)獲得的兩株單克隆抗體，即mAb3A9（IgG1，kappa）和mAb4F7（IgG2a，lambda），分別識(shí)別豬瘟E2蛋白B細(xì)胞線(xiàn)性表位25GLTTTWKEYSHDLQL39 和259GNTTVKVHASDERGP273。此外，用上述兩株單克隆抗體及E2蛋白建立的單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，在血清樣本檢測(cè)過(guò)程中，均展現(xiàn)出優(yōu)異的診斷敏感性（97.49%，95.97%）及特異性（96.08%，94.38%），該研究為我國(guó)豬瘟的逐步凈化提供了有利的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 豬瘟；E2；單B細(xì)胞；表位；ELISA

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.285.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4579-11

收稿日期：2023-12-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心戰(zhàn)略重點(diǎn)研究項(xiàng)目（NCTIP-XD/C03）

作者簡(jiǎn)介：馬中元（1989-），男，甘肅清水人，碩士，主要從事動(dòng)物病原生物學(xué)研究，E-mail： 1203639017@qq.com

*通信作者：曾巧英，主要從事動(dòng)物重要病原微生物的分子致病機(jī)理研究，E-mail：zengqy@gsau.edu.cn

Development of Monoclonal Antibodies against Classical Swine Fever Virus E2 Protein by Single B Cell Sorting

Technology and Its Application in ELISA

MA" Zhongyuan1， ZHENG" Junzuo1， LIANG" Zhibo1， PAN" Li2， ZENG" Qiaoying1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，

China）

Abstract：" The purpose of this study was to develop a classical swine fever virus （CSFV） E2 monoclonal antibody-based competition ELISA （Enzyme Linked Immunosorbent Assay） for evaluating the efficiency of the live attenuated C-strain and E2 subunit vaccines. Firstly， the E2 gene of CSFV was constructed into pFast BAC vector， and the E2 protein was efficiently expressed in SF9 cells; Secondly， 6-8 weeks of BABL/c mice were immunized at intervals with purified E2 protein， and the single B cells were then sorted out at the gate of IgM-/E2+ by flow cytometry. Then， the heavy and light chains of E2 antigen-specific IgG antibodies were amplified by semi-nested PCR， after sequencing， the heavy and light chains of the antibodies were constructed into pCDNA3.1vector， and then were co-transfected into HEK293 cells to prepare the monoclonal antibodies against CSFV E2. The results showed that the two monoclonal antibodies derived from single B cells， namely mAb3A9 （IgG1， kappa） and mAb4F7 （IgG2a， lambda）， could efficiently reacted with the linear epitopes25GLTTTWKEYSHDLQL39 and259GNTTVKVHASDERGP273 of CSFV E2 protein， respectively. In addition， the competitive ELISAs developed using the monoclonal antibodies and E2 protein mentioned above exhibited an excellent diagnostic sensitivity （97.49%， 95.97%） and specificity （96.08%， 94.38%） in the process of detecting serum samples， which provides a favorable technical support for the gradual elimination of CSF in China.

Key words： classic swine fever; E2; single B cells; epitopes; ELISA

*Corresponding author：" ZENG Qiaoying， E-mail： zengqy@gsau.edu.cn

豬瘟（classic swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classic swine fever virus， CSFV）感染引起的具有高度傳染性的豬病毒性疾病，嚴(yán)重危害我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1-2］。目前，疫苗接種仍然是我國(guó)豬瘟防控的主要措施。因此，及時(shí)評(píng)價(jià)豬瘟C株疫苗和E2亞單位疫苗免疫保護(hù)效果是有效防控CSF的關(guān)鍵［3］。CSFV是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬 （Pestivirus）成員，病毒粒子直徑約40～60 nm，基因組長(zhǎng)為12.3 kb的單股正鏈RNA，其開(kāi)放閱讀框編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（Core、Erns、E1、E2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）［4-5］。其中，E2蛋白以二聚體位于病毒囊膜表面，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量具有中和活性的抗體，是最主要的保護(hù)性抗原［6-7］，已廣泛應(yīng)用于亞單位疫苗設(shè)計(jì)、體外診斷及單克隆抗體制備等領(lǐng)域。

目前，單克隆抗體制備技術(shù)主要經(jīng)歷了以下發(fā)展：雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，噬菌體展示抗體文庫(kù)技術(shù)，單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)［8-10］。其中，通過(guò)流式分選單B細(xì)胞是近年來(lái)新興的一類(lèi)快速制備單克隆抗體的技術(shù)，其克服了傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)融合率低，篩選周期長(zhǎng)及染色體丟失等缺陷，成為制備功能多樣性單克隆抗體最重要的高通量方法之一［11-12］。因此，本研究應(yīng)用流式單B細(xì)胞分選技術(shù)制備了兩株高親和力的豬瘟E2單克隆抗體，并建立了豬瘟E2單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA的檢測(cè)方法，可用于評(píng)估豬瘟疫苗的免疫效力。作者的數(shù)據(jù)表明：在血清樣本檢測(cè)過(guò)程中，兩株單抗均體現(xiàn)出優(yōu)異的敏感性及特異性，該研究成果為我國(guó)豬瘟的逐步凈化提供了可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

6～8周齡BABL/c小鼠，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HEK293細(xì)胞、PK15細(xì)胞、SF9細(xì)胞，由作者所在課題組保存。

1.2 主要試劑

真核表達(dá)載體pCDNA 3.1，桿狀病毒表達(dá)載體pFast Bac1為本實(shí)驗(yàn)室保存；Single B cell lysis kit，SuperScriptTM VILOTM MASTE MIX，EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagent，rat anti-mouse IgM-PE，DNase I購(gòu)自Thermo公司；SMARTer? RACE 5′/3′ Kit，Peptide Coating Kit 購(gòu)自TaKaRa公司；HotStar Taq DNA聚合酶購(gòu)自QIAGEN公司; anti-Biotin APC購(gòu)自Miltenyi公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

抗體IgG序列5′端到3′端的結(jié)構(gòu)為Signal-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CH1-CH2-CH3-CH4；其中，Signal為分泌信號(hào)肽，引導(dǎo)抗體肽鏈正確折疊并修飾；FR1-4為序列保守的骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R區(qū)），位于互補(bǔ)決定區(qū)之間；CDR1-3為識(shí)別抗原的互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region， CDR區(qū)），CH1-4為抗體序列保守的恒定區(qū)（constant region， C區(qū)）。小鼠IgG抗體重鏈及輕鏈恒定區(qū)引物通過(guò)檢索IMGT?設(shè)計(jì)，分別合成gamma、lambda、kappa鏈引物，其中outer和inner反向引物序列可結(jié)合于恒定區(qū)C1，outer引物靠近CH1區(qū)外側(cè)，用于第一輪半巢式PCR擴(kuò)增，inner引物靠近CH1區(qū)內(nèi)側(cè)，用于第二輪半巢式PCR擴(kuò)增；gamma、lambda、kappa鏈可變區(qū)正向引物由5′Race PCR測(cè)序分析設(shè)計(jì)，正向引物序列結(jié)合于抗體FR1的5′末端。通過(guò)IMGT?檢索已公布的小鼠單克隆抗體，正向和反向引物PCR擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)產(chǎn)物的大小約500 bp，輕鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物大小約300 bp；引物序列如表1～3所示，所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 豬瘟病毒E2抗原表達(dá)純化及生物素標(biāo)記

豬瘟E2全長(zhǎng)基因根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性?xún)?yōu)化后，在其5′端插入分泌信號(hào)肽（MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLL-AAAAHSAFA），3′端插入linker序列 GSGSGS和 6×His 標(biāo)簽序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的E2序列通過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)插入pFast Bac載體，然后將pFast Bac-E2轉(zhuǎn)入E. coli DH10 Bac細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆并提取Bacmid，用制備的P2代桿狀病毒感染SF9細(xì)胞，表達(dá)分泌型E2蛋白。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用Ni2+親和層析柱純化E2蛋白，Western blot驗(yàn)證其反應(yīng)原性。按照說(shuō)明書(shū)操作流程，用Biotin標(biāo)記試劑盒標(biāo)記高純度的E2蛋白，置于-20 ℃冰箱保存，用于流式分選。

1.5 流式分選E2抗原特異性B淋巴細(xì)胞

使用方法“1.4”中純化的E2蛋白免疫6～8周齡BABL/c小鼠，免疫程序：使用弗氏佐劑與純化的E2蛋白等體積劑乳化后，采用皮下注射間隔免疫3次，每只小鼠免疫25 μg抗原，待抗體效價(jià)在阻斷率大于90%以上時(shí)（使用IDEXX試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)），收集小鼠脾細(xì)胞。用淋巴細(xì)胞分離液離心小鼠脾細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用細(xì)胞分選液稀釋細(xì)胞濃度至106·mL-1，每管200 μL加入流式管。細(xì)胞染色：加入生物素標(biāo)記E2抗原1 μL（濃度：1 mg·mL-1），避光靜置30 min；400×g離心5 min，用細(xì)胞分選液再清洗一次；加入2 μL anti-Biotin-APC抗體，1 μL rat-anti-mouse IgM-PE抗體，避光靜置30 min， 400×g離心5 min，用細(xì)胞分選液再清洗一次，設(shè)置FMO對(duì)照（不加抗原），準(zhǔn)備上機(jī)。E2特異性B細(xì)胞分選：設(shè)置流式細(xì)胞分選儀參數(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞分選模式，100 μm噴嘴，每秒6 000個(gè)細(xì)胞的分選速度，振幅20 psi，頻率 30 kHz， 關(guān)閉Sweet，調(diào)節(jié)Accudrop液滴延遲，將IgM-PE-/E2-APC+型單個(gè)B細(xì)胞分選進(jìn)含有反轉(zhuǎn)錄酶及裂解液的96孔PCR板。

1.6 E2單克隆抗體重鏈輕鏈擴(kuò)增測(cè)序及抗體表達(dá)

室溫裂解96孔PCR板的單個(gè)特異性單B細(xì)胞，使用oligo-dT引物反轉(zhuǎn)錄重鏈和輕鏈可變區(qū)mRNA成cDNA模板，RT-PCR條件為：42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。隨后進(jìn)行2輪巢式 PCR，獲得抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA模板。半巢式PCR擴(kuò)增：第一輪PCR條件：94 ℃ 30 s；50～55 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s；40個(gè)循環(huán)；電泳鑒定 PCR 產(chǎn)物，大小正確后，使用 2 μL第一輪PCR 產(chǎn)物模板進(jìn)行第二輪半巢式 PCR，擴(kuò)增條件：94 ℃ 30 s，55～58℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，1%瓊脂凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，膠回收后克隆至pMD19-T載體，質(zhì)粒送上海生工股份有限公司測(cè)序，獲得抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列?？贵wIgG的可變區(qū)DNA序列測(cè)通后，即5′端的引物序列確定后，抗體恒定區(qū)的序列在通過(guò)一代測(cè)序進(jìn)一步測(cè)通，并由南京金斯瑞生物公司合成。最后在GenBank進(jìn)行序列比對(duì)分析并拼接全長(zhǎng)序列，由南京金斯瑞生物公司合成在pCDNA-3.1載體，將含有配對(duì)重鏈和輕鏈的質(zhì)粒，以2∶1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，制備E2蛋白特異性單克隆抗體。

1.7 肽段合成及E2蛋白B細(xì)胞線(xiàn)性表位篩選

將E2蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列按照15個(gè)氨基酸為一個(gè)線(xiàn)性B細(xì)胞表位截短，相鄰肽段相互重疊10個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)的肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，按照肽段包被試劑盒（TaKaRa MK100）說(shuō)明書(shū)操作流程，用“1.6”中表達(dá)的E2單克隆抗體篩選能與其反應(yīng)匹配的表位序列。

1.8 豬瘟E2單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立

包被：1×PBS緩沖液梯度稀釋E2蛋白，濃度為 200、100、50、25 ng·孔-1， 每孔100 μL加入96孔ELISA板，4℃靜置過(guò)夜，次日棄去孔內(nèi)液體，1×PBST緩沖液洗板3次，拍干；封閉：用1×PBST配制5%脫脂奶粉作為封閉液，每孔200 μL，37 ℃溫箱封閉2 h，棄去孔內(nèi)溶液，拍干，置于37 ℃溫箱烘干30 min；加樣：先在血清稀釋板上稀釋血清，用血清稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清，稀釋比例為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16，將稀釋好的質(zhì)控血清以50 μL·孔-1轉(zhuǎn)入上述包被的ELISA板中；同時(shí)，每孔各加入50 μL HRP標(biāo)記的E2單克隆抗體（1∶5 000），37℃孵育30 min后，用1×PBST緩沖液洗板3次，拍干；最后，加入100 μL TMB底物溶液，置于37℃反應(yīng)10 min；TMB底物溶液反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm數(shù)值。

1.9 敏感性及特異性評(píng)價(jià)

豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清（質(zhì)控血清），臨床陰性血清樣本（80份），豬瘟E2亞單位疫苗免疫血清樣本（160份），豬瘟C株活疫苗免疫血清樣本（30份），由蘭州獸醫(yī)研究所制備并保存。按照“1.8”所述ELISA方法檢測(cè)臨床樣本，評(píng)估單克隆抗體的敏感性及特異性，臨床血清樣本OD450 nm值均以阻斷率（PI）計(jì)算，計(jì)算公式為：PI=（OD450 nm 陰性-OD450 nm樣本）×100% / OD450 nm 陰性。

1.10 臨床樣本檢測(cè)及符合率評(píng)估

豬瘟E2 Ab ELISA試劑盒（IDEXX）購(gòu)自愛(ài)德士公司，臨床血清樣本（100份）由作者所在課題組收集。分別用進(jìn)口商品化試劑盒及“1.8”中所述單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA同時(shí)檢測(cè)臨床血清樣本，比較整體符合率及評(píng)估該方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié) 果

2．1 E2蛋白表達(dá)鑒定及生物素標(biāo)記

收集SF9細(xì)胞上清，如圖1 A 所示，豬瘟E2蛋白大量表達(dá)于培養(yǎng)基上清液，每升含量約為6～8 mg，12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，其分子量大小約為43 ku；其次，用his單抗及E2特異性抗體檢測(cè)純化的E2蛋白，驗(yàn)證其反應(yīng)原性，如圖1 B 和1D所示，E2蛋白具有良好的反應(yīng)活性，能被標(biāo)簽抗體和E2蛋白特異性抗體識(shí)別；同時(shí)，作者使用生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記高純度E2蛋白用于流式分選，如圖1C所示，蛋白標(biāo)記成功，生物素標(biāo)記的E2蛋白能被鏈霉素親和素-HRP識(shí)別。

2.2 流式分選試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

單B細(xì)胞分選試驗(yàn)流程如圖2所示：首先，收集免疫小鼠脾細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾細(xì)胞；其次，用Biotin標(biāo)記的抗原，anti-Biotin-APC及anti-mouse-IgM-PE抗體進(jìn)行細(xì)胞染色。染色結(jié)束后，使用BD FACS Aira Ⅱ流式分選儀分選抗原特異性細(xì)胞，分選獲得的單B細(xì)胞用單細(xì)胞裂解液裂解后，經(jīng)過(guò)RT-PCR和半巢式PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)DNA序列，然后構(gòu)建到真核表達(dá)載體，序列比對(duì)正確的IgG抗體重鏈質(zhì)粒和輕鏈質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，用于抗體表達(dá)及功能分析。

2.3 E2抗原特異性單B細(xì)胞分選

細(xì)胞染色完成后，使用BD FACS Aira Ⅱ流式分選儀分選E2抗原特異性B細(xì)胞。首先，P1門(mén)圈出淋巴細(xì)胞群；其次，P2門(mén)圈出單一細(xì)胞，排除黏連細(xì)胞體，盡量保證分入孔中的細(xì)胞為單個(gè)B細(xì)胞；同時(shí)，P3門(mén)圈出IgM-PE陰性細(xì)胞群，即篩選出能夠分泌表達(dá)IgG的B細(xì)胞群；最后，用生物素標(biāo)記的E2特異性抗原及anti-biotin-APC，在P4門(mén)圈出E2抗原特異性單個(gè)B細(xì)胞，調(diào)節(jié)Accudrop液滴延遲及96孔PCR板的位置，所有參數(shù)設(shè)置完成后，在單細(xì)胞模式下，分選P4門(mén)B細(xì)胞到96孔PCR板（圖3）。

2.4 單克隆抗體PCR擴(kuò)增及表達(dá)

使用表1～3中所示引物擴(kuò)增抗體重鏈及輕鏈，RT-PCR及Semi-PCR擴(kuò)增程序按照方法“1.6”中所述進(jìn)行。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，如圖4 A所示，在特定位置均有清晰的條帶，抗體重鏈可變區(qū)大小約為500 bp左右，輕鏈可變區(qū)大小約為300 bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，TA克隆至測(cè)序載體，送上海生工股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在BLAST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，然后將正確匹配的重鏈和輕鏈分別構(gòu)建到pCDNA-3.1真核表達(dá)載體。質(zhì)粒構(gòu)建完成后，將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞表達(dá)抗體。如圖4B所示，基于流式單B細(xì)胞分選技術(shù)，作者成功表達(dá)了兩株E2抗原特異性單克隆抗體，即mAb3A9及mAb4F7。此外，進(jìn)一步使用抗體亞型鑒定ELISA試劑盒鑒定兩株單抗的亞型，如圖4C所示，mAb3A9亞型為IgG1、kappa，mAb4F7為IgG2a、lambda亞型。

2.5 E2蛋白線(xiàn)性B細(xì)胞表位鑒定

單抗mAb3A9及mAb4F7純化及HRP標(biāo)記后，用合成的overlap肽段檢測(cè)單克隆抗體的反應(yīng)活性，如圖5A所示，單抗mAb3A9識(shí)別線(xiàn)性表位25GLTTTWKEYSHDLQL39，而mAb4F7識(shí)別線(xiàn)性表位259GNTTVKVHASDERGP273。同時(shí)，用BVDV及BDV陽(yáng)性血清，進(jìn)一步鑒定了線(xiàn)性B細(xì)胞表位的特異性，ELISA結(jié)果顯示，兩株單抗識(shí)別的線(xiàn)性表位不與BVDV及BDV發(fā)生交叉反應(yīng)；然后，作者使用PyMOL 2.5軟件模擬了E2蛋白的3D立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)單抗mAb3A9及mAb4F7所識(shí)別的B細(xì)胞線(xiàn)性表位暴露于E2蛋白表面，與單抗時(shí)反應(yīng)具有良好的可及性（圖5B）。

2.6 構(gòu)建豬瘟E2單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA

按照方法“1.8”中所述，構(gòu)建豬瘟E2蛋白單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)體系。采用棋盤(pán)滴定法梯度稀釋抗原，豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清，如圖6A所示，以mAb3A9-HRP為指示抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系，即mAb3A9-bELISA，在血清稀釋度為1∶2，肽段包被濃度為50 ng·孔-1的條件下，具有較高的信噪比（N/P值=14.9）；同樣地，如圖6B所示，以mAb3A9-HRP為指示抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系，即mAb4F7-bELISA，在血清稀釋度為1∶2，肽段包被濃度為100 ng·孔-1的條件下，具有較高的信噪比（N/P值=16.5）。

2.7 評(píng)估單抗的診斷敏感性和特異性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證mAb3A9及mAb4F7的特異性和敏感性，選取免疫背景清晰的血清樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中，陰性血清樣本80份，部分樣本為口蹄疫陽(yáng)性、豬圓環(huán)病毒陽(yáng)性及豬流行性腹瀉病毒陽(yáng)性，這些血清樣本用于評(píng)估單抗的特異性；E2亞單位疫苗免疫14、28、35和42 d的豬血清樣本160份；C株疫苗免疫14、28、35和42 d的豬血清樣本30份，這些具有不同的抗體滴度血清樣本，用于評(píng)估單抗的敏感性。如圖7A所示，在最佳檢測(cè)條件下，ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為37.67%時(shí)，mAb3A9-bELISA的敏感性為97.49%，特異性為96.08%；同樣地，如圖7B所示，當(dāng)臨界值為36.05%時(shí)，mAb4F7-bELISA的敏感性為95.97%，特異性為94.38%。上述結(jié)果表明，基于單B細(xì)胞分選技術(shù)制備的單抗mAb3A9和mAb4F7均具有優(yōu)異的敏感性及特異性，完全可應(yīng)用于豬瘟的臨床診斷。

2.8 臨床血清樣本檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

首先，使用愛(ài)德士ELISA試劑盒檢測(cè)100份臨床血清樣本，根據(jù)商品化試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)，其中36分血清樣本（阻斷率均lt;30%）為陰性血清，60份血清樣本（阻斷率gt; 40%）為陽(yáng)性血清，另外4份血清樣本阻斷率介于30%～40%，不計(jì)入符合率統(tǒng)計(jì)；其次，使用mAb3A9-ELISA及mAb4F7-ELISA檢測(cè)96份血清樣本，結(jié)果顯示：mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA的總符合率分別為93.75%、90.62%，結(jié)果表明：與愛(ài)德士試劑盒比較，基于兩株單抗分別建立的ELISA檢測(cè)方法具有良好的整體符合率（見(jiàn)表4）。

3 討 論

豬瘟主要是通過(guò)口鼻直接接觸，間接接觸污染的飼料等傳播，或經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播［13-14］，根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)，可將豬瘟分為急性豬瘟、慢性豬瘟以及持續(xù)性感染豬瘟。根據(jù)CSFV 5′UTR、E2、NS5B部分序列的差異分析，CSFV毒株可分為3個(gè)基因型及11個(gè)亞基因型［15］。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，基因1、2和3型 CSFV毒株均在世界范圍內(nèi)廣泛流行；其中，基因2型毒株因其較高的遺傳多樣性，成為豬瘟流行毒株。由于豬瘟病毒具有高度的傳染性和致病性，豬群感染后可見(jiàn)系統(tǒng)性病理特征，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［16-17］。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法來(lái)評(píng)估豬瘟E2亞單位疫苗和C株疫苗的免疫效果，能夠促進(jìn)我國(guó)部分地區(qū)豬瘟疫情的防控。首先，作者構(gòu)建了豬瘟E2抗原桿狀病毒表達(dá)載體，通過(guò)昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)懸浮表達(dá)了分泌型E2蛋白，每升培養(yǎng)基可高效表達(dá)6～8 mg蛋白；其次，12% SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（圖1），桿狀表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的E2抗原蛋白分子量大小約43 ku，不僅具有完整的糖基化修飾，且該抗原的反應(yīng)原性及免疫原性均優(yōu)于原核表達(dá)系統(tǒng)。

隨著單克隆抗體技術(shù)不斷發(fā)展，以抗體為關(guān)鍵生物活性分子的研究普遍應(yīng)用于人類(lèi)傳染病、腫瘤等疾病的治療等相關(guān)研究［18-20］。在動(dòng)物疾病預(yù)防控制領(lǐng)域，單克隆抗體也有重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，在監(jiān)測(cè)中和抗體消長(zhǎng)規(guī)律，評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，優(yōu)化免疫接種程序及抗原檢測(cè)等方面，單克隆抗體發(fā)揮了不可或缺的作用［21］。從免疫系統(tǒng)角度出發(fā)，機(jī)體在接受抗原刺激后，能夠分化出大量特異性針對(duì)不同抗原的B細(xì)胞?；诳寺∵x擇理論，每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性的抗體。基于單個(gè) B 細(xì)胞制備單克隆抗體的技術(shù)，能夠有效避免復(fù)雜的亞克隆篩選，克隆細(xì)胞系染色體丟失等問(wèn)題。然而，該方法也存在一些固有的缺陷；值得注意的是，在進(jìn)行半巢式PCR分別擴(kuò)增IgG重鏈和輕鏈時(shí)，首先要通過(guò)RACE擴(kuò)增分析E2抗原特異性抗體的可變區(qū)引物序列；其次，B細(xì)胞分選到96孔PCR板后，應(yīng)立即進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，防止B細(xì)胞離體后抗體mRNA降解。

基于流式單B細(xì)胞分選技術(shù)，本研究成功制備了兩株不同亞型的E2單克隆抗體，并通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，確定了該技術(shù)路線(xiàn)在單克隆抗體制備方法中的可行性。其次，通過(guò)表位鑒定及E2蛋白3D結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，單抗mAb3A9（IgG1，kappa）識(shí)別線(xiàn)性表位25GLTTTWK-EYSHDLQL39，而mAb4F7（IgG2a，lambda）識(shí)別線(xiàn)性表位259GNTTVKVHASDERGP273，單抗鑒定的B細(xì)胞線(xiàn)性表位均暴露于E2抗原結(jié)構(gòu)表面，與單抗體識(shí)別時(shí)均展現(xiàn)出良好的可及性和反應(yīng)活性。此外，基于上述單克隆抗體，作者構(gòu)建了mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA，用于評(píng)估單抗的診斷性能。通過(guò)檢測(cè)豬瘟E2亞單位疫苗、C株免疫及陰性血清樣本，并結(jié)合ROC曲線(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析（圖7），發(fā)現(xiàn)單抗mAb3A9和mAb4F7具有優(yōu)異的敏感性及特異性，完全可應(yīng)用于體外診斷。

為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可靠性，作者進(jìn)一步分析了臨床樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：與豬瘟IDEXX試劑盒相比，mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA的整體符合率分別為93.75%、90.62%，表明基于單克隆抗體建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法不僅在操作上更加簡(jiǎn)便，而且在臨床應(yīng)用中具有更高的性?xún)r(jià)比。綜上所述，本研究新篩選的E2線(xiàn)性表位及基于單B細(xì)胞分選技術(shù)制備的單抗隆抗體，為豬瘟疫苗設(shè)計(jì)及臨床診斷提供了新的視角。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用流式單B細(xì)胞分選技術(shù)成功制備了兩株針對(duì)豬瘟病毒E2蛋白的不同亞型的單克隆抗體，并建立了相應(yīng)的單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于評(píng)估豬瘟E2亞單位疫苗及C株弱毒疫苗的免疫效力，結(jié)果顯示，兩株單抗均體現(xiàn)出優(yōu)異的敏感性和特異性，完全可應(yīng)用于臨床診斷，該技術(shù)成果為我國(guó)豬瘟的逐步凈化提供了有利的技術(shù)支撐。

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（編輯 白永平）