摘 要： 旨在觀察竹鼠源阿卡斑病毒（AKAV）對山羊的致病性，本研究以竹鼠源阿卡斑病毒GXLCH16-70株分別經(jīng)顱內(nèi)、皮下和靜脈感染山羊，觀察山羊臨床癥狀、病毒血癥、剖檢病變、組織病理和病原組織器官分布等指征。結(jié)果顯示，顱內(nèi)接種組山羊攻毒第4～9天后，出現(xiàn)間歇性痙攣、抽搐等神經(jīng)癥狀；皮下和靜脈接種組的山羊于接毒第3～8天出現(xiàn)腹瀉、眼角分泌物增多等癥狀；接種GXLCH16-70的所有山羊于感染第2～10天均出現(xiàn)病毒血癥，感染第8天后均產(chǎn)生AKAV中和抗體，且一直持續(xù)到第21天。顱內(nèi)組剖檢可見大腦非化膿性腦脊髓炎，肺充血出血、脾邊緣有出血點等病理變化。病理組織學(xué)檢查顯示，顱內(nèi)組呈現(xiàn)為腦膜和皮質(zhì)血管周圍見有多層膠質(zhì)細胞等炎性細胞浸潤，形成“血管套”樣結(jié)構(gòu)。熒光定量RT-PCR對腦組織、脊髓等樣品進行的病原檢測結(jié)果顯示，顱內(nèi)組幾乎在大腦的所有區(qū)域都檢測到AKAV-S RNA片段；同時，靜脈組和皮下組在部分腦組織和脊髓中也能檢測到病原。結(jié)果表明，新型竹鼠源AKAV GXLCH16-70株經(jīng)人工感染可導(dǎo)致山羊全身多器官和組織系統(tǒng)性病變，并且可引起山羊腦脊髓炎。

關(guān)鍵詞： 竹鼠；阿卡斑病毒；山羊；致病性；顱內(nèi)接種

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4553-09

收稿日期：2023-12-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32160830）；廣西基本科研業(yè)務(wù)費（桂科專項20-4）；廣西基本科研業(yè)務(wù)費（桂科專項21-7）

作者簡介：秦樹英（1991-），女，廣西桂林人，碩士生，主要從事動物傳染病與分子病毒學(xué)研究

*通信作者：吳健敏，主要從事動物傳染病與分子免疫學(xué)研究，E-mail：wu-jm20@163.com；覃紹敏，主要從事動物疫病防控技術(shù)研究工作，E-mail：qin_shaomin@126.com

Pathogenicity of a Newly Akabane Virus on Goats from Bamboo Rat

QIN" Shuying， LIU" Jinfeng， MA" Ling， XU" Lishi， YANG" Lei， CHEN" Fenglian， WEI" Shanshan，

LU" Chenyang， LIN" Jun， WEI" Jue， QIN" Shaomin*， WU Jianmin*

（Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Key Laboratory of China（Guangxi）-

ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control，Ministryof Agriculture and Rural Affairs of China，

Guangxi Veterinary Research Institute， Nanning 530001， China）

Abstract：" In order to determine the pathogenicity of Akabane virus （AKAV） from bamboo rat in goats， GXLCH16-70 strain was used to infect goats via intracranial（IC）， intravenous （IV）and subcutaneous （SC） inoculation. The clinical manifestations， viremia， pathological changes， histopathology， and pathogenic distribution in tissue or organ of goats were observed. The 4th to 9th day post infection （dpi）， goats in the IC group showed obvious neurological symptoms such as intermittent spasm， convulsion， while goats in the IV and SC groups showed symptoms as such diarrhea and increased secretions in the eyes at the 3rd to 8th dpi. All goats infected by GXLCH16-70 developed viremia at the 2nd to 10th dpi， and produced AKAV neutralizing antibodies at the 8th dpi. The antibodies continued to exist up to the 21st dpi. Autopsy in the intracranial group showed non-suppurative encephalomyelitis of the brain， pulmonary congestion and hemorrhage， marginal hemorrhagic spots of the spleen and other pathological changes. Histopathological examinations on the IC group showed the multiple layers of inflammatory cells infiltrating to the meninges and cortical blood vessels， forming a \"vascular sheath\" like structure. Pathogen detection by fluorescence quantitative RT-PCR （qRT-PCR） showed that AKAV-S RNA fragments were detected in almost all regions of the brain in the IC group， and in some brain tissue and spinal cord in the IV group and SC group. The results showed that AKAV GXLCH16-70 strain from bamboo rat causes systemic lesions of multiple organs and tissues of goats and induce encephalomyelitis.

Key words： bamboo rat; Akabane virus; goats; pathogenicity; intracranial （IC） inoculation

*Corresponding authors：WU Jianmin， E-mail： wu-jm20@163.com; QIN Shaomin， E-mail： qin_shaomin@126.com

阿卡斑?。ˋkabane disease）又稱赤羽病，是由阿卡斑病毒（Akabane virus， AKAV） 引起的以牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、木乃伊胎、新生胎兒發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦綜合癥為特征的一種蟲媒性傳染病［1-3］。成年牛、羊以隱性感染為主，但日本、韓國均有成年牛、羊感染AKAV后出現(xiàn)腦脊髓炎的報道［4-5］。目前AKAV已經(jīng)廣泛分布于澳洲、東南亞、中東和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)［6］，我國在23個省市自治區(qū)牛羊血清樣品中均檢測到AKAV抗體［7］。最近吉林、內(nèi)蒙等地區(qū)患牛出現(xiàn)牛犢出生后站立不穩(wěn)、四肢關(guān)節(jié)彎曲呈蜷縮狀，脊柱和頭部變形等癥狀，已確診為AKAV感染［8］。本團隊從自然環(huán)境下引起大規(guī)模成年竹鼠死亡的病例中分離得到一株竹鼠源AKAV，經(jīng)鑒定為新型竹鼠源AKAV［9］，隨后在我國云南、廣東、四川、海南等地相繼在牛、蠓蟲、中華按蚊和致倦庫蚊等動物中發(fā)現(xiàn)與廣西發(fā)現(xiàn)的新型 AKAV序列相似性較高的毒株，推測新型 AKAV 目前已經(jīng)在一定范圍內(nèi)流行［10］。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)竹鼠源GXLCH16-70毒株無論是對竹鼠或成年小白鼠都顯示了極強的致病性［9］，但該病毒株是否會跨宿主傳播，引起牛羊感染，目前尚不清楚。本研究選取6月齡青年山羊，通過不同途徑人工感染竹鼠源GXLCH16-70毒株，觀察山羊臨床表現(xiàn)、檢測山羊的病毒血癥情況、剖檢病變、組織病理和病原組織器官分布等疾病指征，并初步評估該病毒對山羊的致病性情況。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

AKAV抗體阻斷ELISA試劑盒購自法國ID-VET公司；病毒RNA提取試劑盒（CW0586）購自北京康為世紀生物科技有限公司；核酸抽提試劑盒MiniBEST Universal RNA Ex-traction Kit 9767、PrimeScriptTM RT Master Mix（RR036Q）、Premix Taq（RR003Q）、SYBR Premix Ex Taq II （RR820A）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 實驗動物來源

8只6月齡青年山羊均購自廣西大化縣春興村生靈養(yǎng)殖合作社，AKAV抗原與抗體檢測均為陰性。此外檢測布魯氏菌病抗體為陰性。

1.1.3 主要儀器設(shè)備" 二級生物安全柜購自ESCO公司，超低溫冰箱購自SANYO公司，微量移液器購自德國艾本德股份公司，熒光定量PCR儀（Accurate 96型）購自大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司，常溫離心機購自Sigma公司，恒溫水浴鍋購自美國Grant公司，低溫離心機購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，酶聯(lián)免疫分析儀（Magellan for INFINITE F50，V2 SP1）購自 TIANCHE 公司。

1.2 方法

1.2.1 山羊攻毒及樣品收集

選8只AKAV抗原抗體雙陰性的6月齡健康山羊，分為4組，每組2只，其中3組分別為顱內(nèi)接種、靜脈接種、皮下接種攻毒試驗組，第4組為陰性對照組。顱內(nèi)接種（intracerebral injection，IC）組山羊深度麻醉后，在頭骨右側(cè)鉆孔至約5 mm的深度，將含量為1×106 TCID50的AKAV病毒注入大腦額葉［11-12］；靜脈接種（intravenous injection，IV）組通過頸靜脈接種含量為5×106 TCID50病毒；皮下接種（subcutaneous injection，SC）組在山羊頸后部皮下接種含量為5×106 TCID50病毒，對照組通過靜脈接種5 mL的DMEM液。接種后，每天觀察山羊的臨床變化，特別是神經(jīng)癥狀。接種（攻毒當天記為第0天，0 dpi）后每2 d采集一次血樣（5 mL），直至第21天（21 dpi）評估病毒血癥和血清抗體變化情況。

分離外周血檢測病毒血癥。21 dpi在深度麻醉下殺死山羊。進行尸檢，采集腦、脊髓、淋巴結(jié)和脾臟標本進行病理學(xué)、病理學(xué)組織和病毒學(xué)分析。

1.2.2 病毒血清中和抗體試驗

分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、21 dpi早上9：00頸靜脈采血分離血清，根據(jù)參考文獻［13］測定抗AKAV的中和抗體水平。首先將待測血清在56 ℃水浴中滅活30 min，然后按2倍稀釋將血清稀釋至1∶128，然后分別將不同稀釋倍數(shù)的血清與200 TCID50·0.1 mL-1的GXLCH16-70病毒等量混合，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱作用1 h，再分別加入鋪有單層Vero細胞的96孔板中，3～5 d后觀察細胞病變情況，抗體滴度為保護細胞不出現(xiàn)病變的最高稀釋度的倒數(shù)，當抗體滴度≥2 （log2）時，則認為血清為陽性［12-13］。

1.2.3 血清抗體ELISA試驗

使用阿卡斑病毒競爭酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（法國ID-VET）檢測上述采集的血清樣品中AKAV特異性抗體情況。參考文獻［11-12］計算樣品的抑制百分比（percent inhibition， PI）=［1-（OD樣品/OD陰性對照平均）］×100，如果PI值≥70，則認為測試血清樣本抗體陽性。

1.2.4 實時熒光定量PCR

采集山羊的外周血和組織樣品，組織樣品包括大腦（頂葉、額葉、顳葉、枕葉）、小腦、中腦；延髓和頸部脊髓、胸髓、腰髓、脾和淋巴結(jié)。抽提樣品的總RNA，然后按參考文獻［10］的方法使用SYBR Green II染料法檢測各種組織樣品中的AKAV的表達水平。

1.2.5 組織病理切片分析

無菌采集病變組織樣品，用10%福爾馬林固定，送洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司進行組織病理學(xué)觀察與分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀

2.1.1 臨床表現(xiàn)

接種后連續(xù)21 d每天觀察羊精神、飲食、運動、排便、排尿等情況，結(jié)果顯示：顱內(nèi)攻毒組山羊在4 dpi 出現(xiàn)體溫升高、拒食，4～9 dpi出現(xiàn)間歇性痙攣，抽搐；13 dpi出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀（圖1A），體重明顯下降，由攻毒前的19 kg降至17.3 kg，下降了8.95%。IV組和SC組山羊在3～8 dpi后出現(xiàn)糞便稀糊不成形、眼睛分泌物增多等癥狀。對照組山羊體溫、精神、采食均正常。

2.1.2 體溫監(jiān)測

通過連續(xù)監(jiān)測攻毒后4組山羊的體溫情況，可知攻毒后IC組的2只山羊在4～9 dpi，出現(xiàn)發(fā)熱、體溫增高，體溫在40.25～41 ℃左右（正常山羊體溫為38～40 ℃），IV、SC組和對照組山羊體溫正常（圖1B）。

2.2 血清學(xué)檢測

血清中和試驗結(jié)果顯示：攻毒前，4組山羊的抗體檢測均為陰性，2～6 dpi 試驗組山羊的中和抗體滴度均低于2 （log2），8 dpi時SC和IV組的抗體均轉(zhuǎn)陽，而IC組1只山羊抗體轉(zhuǎn)陽，1只為抗體陰性；10 dpi時攻毒組山羊中和抗體均為陽性，且隨時間呈增長趨勢，在21 dpi時3個攻毒組的6只山羊的中和抗體在4.5～7.3 （log2） 的范圍內(nèi)，其中IV組的中和抗體滴度最高，在21 dpi時，IV組的一只山羊中和抗體滴度可達7.3 （log2），試驗期間，對照組的山羊抗體一直為陰性，抗體滴度均低于2（log2） （圖2A）。

在競爭ELISA試驗中，8 dpi，IC和SC組的山羊血清抗體均呈陽性（PIgt;70），10 dpi 時IV組山羊血清抗體均轉(zhuǎn)陽，10～21 dpi，3個攻毒組山羊AKAV抗體均為陽性，PI均高于80，試驗期間，對照組的AKAV抗體一直為陰性 （圖2B）

2．3 病原檢測

2.3.1 血液中病原檢測

通過連續(xù)采集山羊頸靜脈血液進行竹鼠源AKAV-S基因的qRT-PCR檢測［10］，結(jié)果可知：IV組山羊最早可在2 dpi 時檢測到病毒，而IC組和SC組均在4 dpi 才能檢出，3個攻毒組在4～8 dpi均能在血液中檢出AKAV，且6 dpi時IC和SC組山羊的血液中病毒含量最高，隨后逐漸下降，12 dpi時3個攻毒組血液病原檢測均轉(zhuǎn)為陰性（見圖3A）。試驗期間，對照組山羊血液AKAV檢測一直為陰性。

2.3.2 組織病原檢出情況

在組織病原學(xué)檢測中，在IC組山羊的病毒檢出率最高，在腦組織幾乎所有區(qū)域都檢測到了AKAV的RNA，包括大腦（頂葉、額葉、顳葉、枕葉）、小腦、中腦；同時在延髓、頸髓、脾和淋巴結(jié)中也能檢出病毒，其中一只IC組的山羊能在腦橋和肺臟中檢出少量AKAV病原；IV組山羊在大腦枕葉、頂葉、頸髓和胸髓、腰髓、脾中檢出；SC組山羊檢出率較低，僅在大腦額葉、頂葉和腰髓中檢出，其中一只SC組山羊在淋巴結(jié)中檢測到AKAV病原，另外一只未能檢出。不同攻毒途徑各組織臟器的病原檢出率差異較大。

攻毒后第21天，IC、IV及SC組均能在腦、脊髓檢測到病毒。雖然IV組和SC組山羊攻毒夠未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但在病原學(xué)檢測中可知，病毒可通過靜脈和皮下均能傳播至大腦，在大腦和神經(jīng)脊髓中定殖。

2.4 組織病理變化情況

21 dpi時，4組試驗山羊均麻醉解剖，IC組發(fā)" 現(xiàn)：大腦水腫，顱內(nèi)有少量淺黃色積液，肺淤血、局部有出血（圖4），脾邊緣有少量出血點。IV和SC組僅肺淤血，局部有出血點。IV組和SC組的山羊組織剖檢未見明顯的病變，對照組剖檢無明顯病變。

組織病理切片可見（圖5）IC組山羊腦頂葉的大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，膠質(zhì)細胞浸潤，腦膜和皮質(zhì)細胞浸潤，腦膜和皮質(zhì)血管周圍見多層膠質(zhì)細胞等炎性細胞浸潤，形成“血管套”樣結(jié)構(gòu)。肺臟肺泡腔內(nèi)大量均質(zhì)紅染的漿液性滲出物、紅細胞及含鐵血黃素沉淀。脾局部血管周圍及肝竇內(nèi)有中性粒細胞等炎性細胞浸潤。IV組和SC組感染后未觀察到明顯的組織病理學(xué)變化，IC組山羊的組織病理學(xué)檢查顯示顱內(nèi)感染比其他途徑更具神經(jīng)毒性，能觀察到明顯的病理變化主要是中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

3 討 論

竹鼠源AKAV GXLCH16-70株是本團隊2016年從發(fā)病死亡竹鼠組織上分離得到的病毒，前期研究表明該病毒能引起成年竹鼠和小白鼠死亡，并且引起竹鼠顫抖、轉(zhuǎn)圈、后肢麻痹及拖行，后通過測序鑒定該病毒屬于Ia基因型AKAV?；诓《镜南到y(tǒng)發(fā)育樹分析表明，竹鼠源AKAV分離株與引起牛腦脊髓炎的日本KM-1/Br/06和KS2/Mo/06株和韓國AKAV-7株親緣關(guān)系密切［9，11-13］ ，與基因II型OBE-1分離株的親緣關(guān)系較遠。目前研究表明Ia型的AKAV毒株對動物的神經(jīng)毒力顯著高于基因II型毒株［14-15］，Zan等［16］2020年從內(nèi)蒙古分離到一株牛源Ib型的AKAV LK07，通過乳鼠動物感染模型可知，該病毒顱內(nèi)接種小鼠死亡率為100%，其他接種途徑則無明顯變化，可見AKAV對動物的致病性除了與病毒株基因型有關(guān)，還與接種途徑密切相關(guān)。本研究通過對青年山羊顱內(nèi)、靜脈和皮下這3種接種途徑接種竹鼠源AKAV GXLCH16-70毒株后，觀察山羊的臨床癥狀、血清學(xué)和組織病理學(xué)情況來評估其致病性，結(jié)果表明竹鼠源AKAV感染青年山羊能引起山羊發(fā)生病毒血癥和腦脊髓炎。

根據(jù)VNT和競爭 ELISA檢測可知：不同攻毒組的山羊AKAV抗體均在8～10 dpi時轉(zhuǎn)陽，這與目前報道的牛、羊源阿卡斑病毒的特點一致。Jeong等［11］研究發(fā)現(xiàn)山羊通過不同接種途徑感染AKAV-7后，血清抗體在從6～8 dpi轉(zhuǎn)陽，隨后中和抗體滴度穩(wěn)步上升，直到試驗結(jié)束（14 dpi），所有動物的VNT滴度都很高（gt;9 log2）。本研究中竹鼠源AKAVGXLCH16-70株感染山羊后，IC、IV和SC組山羊中和抗體水平差異不大，其中IV組的中和抗體滴度最高，在21 dpi時滴度為7.3 （log2），通過IC、IV和SC接種山羊后刺激產(chǎn)生的中和抗體水平均低于牛源AKAV-7。

阿卡斑病毒接毒脊椎動物后，病毒在接種處或附近發(fā)生復(fù)制，導(dǎo)致病毒血癥的發(fā)生。病毒血癥從接毒后第2天開始出現(xiàn)，持續(xù)期較短［3］。本研究中竹鼠源AKAV GXLCH16-70株感染山羊后2～10 d可檢測到短暫的病毒血癥，隨后病毒從血液中迅速清除。IV組最先在2 dpi中檢出，這可能是由于IV組是直接將AKAV病毒接種到頸靜脈中，所以IV組病毒血癥檢出最早，且檢出病毒含量高。同時作者也能通過IC組和SC組病毒血癥檢出時間，推測出顱內(nèi)和皮下感染后病毒到達血液中能夠檢出的時間大約為4 dpi。

本研究中，IC攻毒組山羊出現(xiàn)體溫升高、拒食、消瘦及間歇性痙攣、抽搐等神經(jīng)癥狀；剖檢后可見大腦水腫，顱內(nèi)有少量淺黃色積液，肺局部出血，脾臟邊緣有出血點，與竹鼠源AKAV GXLCH16-70 攻毒竹鼠和成年小白鼠的癥狀相似［9］；組織病理學(xué)檢查顯示顱內(nèi)感染比其他途徑更具神經(jīng)毒性，能觀察到明顯的病理變化，主要是中性粒細胞等炎性細胞浸潤，大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，膠質(zhì)細胞浸潤，腦膜和皮質(zhì)細胞浸潤，腦膜和皮質(zhì)血管周圍見多層膠質(zhì)細胞等炎性細胞浸潤，形成“血管套”樣結(jié)構(gòu)，這些病理情況與韓國AKAV-7病毒攻毒奶牛的病理結(jié)果一致［12］，但與韓國Lee等［17］ 2000年對5頭奶牛攻毒試驗結(jié)果不一致。本攻毒試驗引起的病變部位主要集中在山羊大腦的頂葉、額葉和延髓，腦橋和小腦病變不明顯，韓國Lee等［17］奶牛攻毒試驗發(fā)現(xiàn)病變主要集中在腦橋和延髓，在中腦中觀察到類似的輕微或微小的變化，但在大腦和小腦皮層中很少觀察到明顯病理變化。Takenaka-Uema等［15］ 研究表明AKAV對動物的致病性可能與毒株的異源神經(jīng)侵襲性和神經(jīng)毒力有關(guān)，證實了AKAV在小鼠中可誘導(dǎo)血腦屏障分解，進而侵入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，同時病毒還可能通過血管滲透、或沿外周神經(jīng)通路（比如嗅覺通路等）進入到大腦中［18-19］，這也進一步解答了不同攻毒途徑下AKAV病毒都能突破血腦屏障在腦組織和脊髓中檢出。

qRT-PCR檢測顯示，無論何種接種途徑感染竹鼠源AKAV，病毒在腦組織的病毒載量均高于脊椎、脾和淋巴結(jié)（圖3B）。同時在攻毒組山羊的組織中，IC組山羊的組織病毒檢出率最高，為66.67%（12/18）包括大腦、小腦、中腦、延髓及頸部脊髓、脾等，其次是IV組，病毒檢出率33.33%（6/18）；SC組山羊的病毒檢出率僅為22.22%（4/18）。這也證實了竹鼠源AKAV對山羊的致病性與接種方式有關(guān)，將病毒直接注射到IC組的大腦額葉中，導(dǎo)致神經(jīng)元中的直接病毒感染，并引起嚴重的神經(jīng)癥狀，因此IC攻毒山羊表現(xiàn)出更明顯的病理變化［20］。IV和SC組山羊雖然沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但qRT-PCR檢測結(jié)果表明接種竹鼠源AKAV后，病毒可通過各種途徑擴散到大腦、脊髓和免疫器官，這也進一步說明竹鼠源AKAV可通過靜脈和皮下達到大腦，在大腦和神經(jīng)脊髓中定殖。

4 結(jié) 論

新型竹鼠源阿卡斑病毒 GXLCH16-70株人工感染可導(dǎo)致山羊全身多器官和組織系統(tǒng)性病變，并且可引起山羊腦脊髓炎。

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（編輯 白永平）