摘 要： 旨在探究在巴馬豬中ZBED6基因敲除之后腸道菌群的變化和肌肉表型的關(guān)聯(lián)。本研究以5月齡野生型和ZBED6敲除型廣西巴馬小型豬為研究對(duì)象，按性別和基因型分成3組進(jìn)行比較，分別是野生型公豬比野生型母豬（公WT：母WT）、野生型母豬比敲除型母豬（母WT：母KO）、野生型公豬比敲除型公豬（公WT：公KO），利用16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)分析各腸段微生物組成。結(jié)果表明：1）在巴馬豬中，大腸的菌群多樣性顯著高于小腸；2）與雌性野生型豬相比，雄性野生型豬瘦肉率更高，回腸蘇黎世桿菌屬、盲腸鏈球菌屬、直腸消化鏈球菌屬在雄性野生型豬中顯著富集，回腸乳桿菌屬在雌性野生型豬中顯著富集；3）敲除ZBED6之后，豬的肌肉生長(zhǎng)增加。腸道菌群組成顯示，母豬的回腸中乳桿菌含量顯著下降，盲腸中SMB53的含量顯著上升。敲除ZBED6后，公豬直腸中普雷沃菌屬和瘤胃球菌屬的含量顯著上升，盲腸中SMB53的含量顯著上升。結(jié)果提示，蘇黎世桿菌屬、鏈球菌屬、消化鏈球菌屬和乳桿菌屬在腸道內(nèi)的差異可能會(huì)影響能量代謝從而促進(jìn)雄性野生型豬的肌肉生長(zhǎng)；敲除了ZBED6之后，豬的盲腸中SMB53豐度的顯著增加可能是導(dǎo)致肌肉增多的一個(gè)因素。

關(guān)鍵詞： 巴馬豬；ZBED6；腸道微生物；SMB53

中圖分類號(hào)：S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4302-09

收稿日期：2024-03-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（32202621）

作者簡(jiǎn)介：徐 成（1999-），男，江蘇無錫人，碩士，主要從事畜禽資源分子評(píng)價(jià)研究，E-mail： 1326843913@qq.com

*通信作者：王丹丹，主要從事功能基因挖掘與利用研究，E-mail：wangdd1993@126.com

Changes in Gut Microbiota after ZBED6 Knockout were Analyzed Based on 16S rRNA

Sequencing

XU" Cheng， TIAN" Wenjie， MA" Yuehui， WANG" Shengnan， JIANG" Lin， WANG" Dandan*

（Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the association between changes in gut microbiota and muscle phenotype in ZBED6-knockout Bama pigs. In this study， 5-month-old wild-type and ZBED6-knockout Guangxi Bama mini-pigs were divided into 3 groups based on sex and genotypes： wild-type boars compared with wild-type sows （male WT： female WT）， wild-type sows compared with knock-out sows （female WT： female Ko）， and wild-type boars compared with knock-out boars （male WT： male Ko）. The microbial composition of each intestinal segment was analyzed by high-throughput sequencing of 16S rRNA gene. The results showed that： 1） The community diversity of large intestine in Bama pigs was significantly higher than that of small intestine; 2） Compared with female wild-type pigs， male wild-type pigs have higher lean meat percentage. Turicibacter in ileum， Streptococcus in cecum and Peptostreptococcaceae in rectum were found to be concentrated in male wild-type pigs， while Lactobacillus in ileum was found to be concentrated in female wild-type pigs; 3） After knockout of ZBED6， muscle growth increased in pigs. The content of Lactobacillus in ileum of sows was significantly decreased and SMB53 in cecum was significantly increased. After knockout of ZBDE6， Prevotella and Ruminococcus increased significantly in boar rectum， and SMB53 increased significantly in cecum. The results suggest that the differences in abundance of Turicibacter， Streptococcus， Peptostreptococcaceae and Lactobacillus in the gut may affect energy metabolism and promote muscle growth in male wild-type pigs; After ZBED6 knockout， an increase abundance in SMB53 in the cecum of pigs may be a factor contributing to muscle gain.

Key words： Bama pig; ZBED6; gut microbes; SMB53

*Corresponding author： WANG Dandan， E-mail：wangdd1993@126.com

豬是最重要的肉食來源之一，約4 000萬年前，豬科動(dòng)物在歐洲被發(fā)現(xiàn)，家豬是由野豬多點(diǎn)馴化起源而來的［1］。肌肉一直是家畜育種最重要的性狀，腸道微生物的組成與多樣性有助于維持肌肉的正常生長(zhǎng)和代謝能力。腸道微生物群可以影響骨骼肌的病理生理學(xué)，調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)沉積和肌肉功能，這種機(jī)制被稱為腸-肌軸［2-3］。如普雷沃菌屬（Prevotella）、丁酸單胞菌（Butyricimonas）和阿克曼菌屬（Akkermansia）等菌屬均影響肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育［4-6］。

榮昌豬和約克夏豬腸道微生物存在顯著差異。與大白豬相比，榮昌豬的瘦肉率更高。將2種豬的腸道微生物通過糞菌移植方式傳遞給無菌小鼠后，受體小鼠表現(xiàn)出與供體豬相似的代謝表型。與移植約克夏豬糞便的小鼠相比，移植榮昌豬糞便的小鼠體脂重具有增加的趨勢(shì)，肌肉中的慢肌纖維比例提高，腓腸肌肌纖維直徑和橫截面積具有減小的趨勢(shì)［7］。在兩項(xiàng)與衰老相關(guān)的肌肉力量損失的試驗(yàn)中，研究人員給年輕的小鼠補(bǔ)充植物乳桿菌TWK10，不僅可以增強(qiáng)了年輕小鼠的肌肉力量，而且阻止了老年小鼠與衰老相關(guān)的肌肉力量損失［8］。另外一個(gè)試驗(yàn)中作者添加了副干酪乳桿菌PS23，可以減緩小鼠衰老導(dǎo)致的肌肉質(zhì)量和力量的喪失，維持肌肉中較高水平的活性氧和線粒體水平［9］。在過去幾十年，由于對(duì)家豬瘦肉性狀進(jìn)行強(qiáng)烈的選擇，最終使得家豬的肌肉量增加和脂肪沉積減少。ZBED6（zinc finger BED domain-containing protein 6）， 作為IGF2的轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過抑制IGF2的表達(dá)抑制肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。ZBED6最初被發(fā)現(xiàn)在歐洲野豬、皮特蘭豬和大白豬之間的雜交中［10］。IGF2中一個(gè)單堿基突變消除了與ZBED6的結(jié)合，從而影響了豬肌肉生長(zhǎng)、脂肪沉積和心臟大?。辉谶M(jìn)化過程中，ZBED6基因的2個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域在26種胎盤哺乳動(dòng)物中顯示出接近 100%的氨基酸保守性，證明ZBED6具有重要的功能［11-14］。Younis等［15］構(gòu)建了敲除ZBED6小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除ZBED6后IGF2的表達(dá)增高導(dǎo)致了肌肉的增多；Liu等［16］檢查了ZBED6單敲除小鼠的肌肉表型，發(fā)現(xiàn)敲除后提高了小鼠的瘦肉重、瘦肉率和肌纖維面積，表明ZBED6有劑量依賴效應(yīng)；Wang等［17］利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得ZBED6敲除巴馬豬模型，與小鼠的表型一致，ZBED6敲除巴馬豬肌肉含量增大，瘦肉率增多。近年來，ZBED6還被發(fā)現(xiàn)和胰島功能、心肌發(fā)育等有關(guān)［18-19］。但是ZBED6是否能介導(dǎo)豬腸道微生物的改變和肌肉表型的關(guān)聯(lián)還不得而知。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ZBED6-KO巴馬小型豬由本團(tuán)隊(duì)前期通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得，目前飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所附屬養(yǎng)豬場(chǎng)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，這些豬可以自由地獲得商業(yè)豬飼料和水。選取野生型5月齡公豬3頭、ZBED6敲除型5月齡公豬3頭、野生型5月齡母豬5頭和ZBED6敲除型5月齡母豬7頭共18頭，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行安樂死和屠宰，瘦肉從左側(cè)屠體解剖和稱重。瘦肉率由左側(cè)胴體瘦肉重與胴體重的比值決定。收集豬小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結(jié)腸、直腸）組織進(jìn)行取樣，一份樣品先于液氮中速凍，后將樣品置于-80 ℃長(zhǎng)期保存?；蚯贸i的制備如前文所述［17］。

1.2 DNA 抽提與PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與Illumina Miseq 測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City， CA， USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST （Promega， USA）進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina， San D-iego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)步驟： 1）連接“Y”字形接頭; 2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段; 3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集; 4）氫氧化鈉變性， 產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控與物種注釋

分析過程主要是用Qiime2軟件完成的。用qiime tools import 插件，將原始序列fastq文件，導(dǎo)入為可進(jìn)行QIIME2后續(xù)處理的文件格式。然后運(yùn)用QIIME2 dada2插件進(jìn)行質(zhì)控，修剪，去噪，拼接，以及去除嵌合體后，得到了最終的特征序列表格。接著，運(yùn)用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對(duì)到預(yù)先訓(xùn)練好的13_8版本99%相似度的GREENGENES數(shù)據(jù)庫(kù)（根據(jù)338F/806R引物對(duì)將數(shù)據(jù)庫(kù)修剪到V3-V4的區(qū)域），得到了物種的分類信息表。之后用QIIME2 feature-table插件剔除了所有污染性的線粒體和葉綠體序列［20-22］。

1.5 差異分析

ANCOM、ANOVA、Kruskal Wallis、LEfSe和DEseq2等方法被用于鑒定分組和樣本間豐度有差異的細(xì)菌［23］。

1.6 多樣性分析

使用QIIME2 core-diversity插件計(jì)算多樣性矩陣。特征序列水平Alpha多樣性指數(shù)包括observed OTUs、 Chao1、香農(nóng)指數(shù)和Faith’s phylogenetics diversity指數(shù)被用于評(píng)估樣本本身的多樣性程度。Beta多樣性指數(shù)包括Bray Curtis， unweighted UniFrac and weighted UniFrac指數(shù)被用于評(píng)估樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異性，并隨后用PCoA和NMDS 圖來進(jìn)行展示。應(yīng)用R軟件包“mixOmics”，偏最小二乘判別分析（PLS-DA）作為一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，被用于揭示微生物群落與樣品類別之間的關(guān)系模型來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)［24-25］。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

本研究通過16S rRNA的V3-V4測(cè)序評(píng)估了十二指腸（SE）、空腸（KC）、回腸（HC）、盲腸（MC）、結(jié)腸（JC）和直腸（ZC）共6個(gè)腸段中的腸道微生物群結(jié)構(gòu)。在108個(gè)樣本中檢測(cè)到的6 373 728個(gè)讀數(shù)被DADA2軟件注釋為6 518個(gè)OTUs。對(duì)6個(gè)腸段注釋到的微生物進(jìn)行交集分析，結(jié)果顯示有25個(gè)OTUs在6個(gè)腸段中都有豐度（圖1）。

2.2 Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析

Chao1指數(shù)可反映樣品微生物的豐富度，估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，Shannon指數(shù)可反映樣品微生物的多樣性。結(jié)果與OTU數(shù)量一致，大腸群落多樣性顯著高于小腸（圖2A、B）。PCA分析是基于屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析，進(jìn)化中聚類相近的物種距離越近。結(jié)果表明，大腸（盲腸、結(jié)腸、直腸）微生物聚類效果類似，小腸（十二直腸、空腸、回腸）微生物聚類效果類似（圖2C）。使用R對(duì)基于UniFrac距離矩陣分別進(jìn)行NMDS分析，通過二維排序圖描述群落樣本的結(jié)構(gòu)分布，NMDS分析也得出類似的結(jié)論（圖 2D）。

2.3 分類組成分析

在門和屬分類水平上對(duì)樣品進(jìn)行分類學(xué)統(tǒng)計(jì)。巴馬豬大腸細(xì)菌門以厚壁菌門（盲腸81%，結(jié)腸83%，直腸76%）和擬桿菌門（盲腸9%，結(jié)腸7%，直腸12%）為優(yōu)勢(shì)物種，變形菌門（盲腸6%，結(jié)腸3%，直腸1%）次之。在小腸中，厚壁菌門和變形菌門占優(yōu)勢(shì)，其中厚壁菌門（十二指腸占79%，空腸占69%，回腸占91%）的富集程度最高，變形菌門（十二指腸占9%，空腸占3%，回腸占5%）的富集程度相對(duì)較高。但是，擬桿菌只表現(xiàn)出相對(duì)豐度（十二指腸2%，空腸5%，回腸0%）（圖3A）。在屬水平上，乳酸桿菌在大腸和小腸中的相對(duì)豐度分別為24% 和59% ；毛螺旋菌在大腸和小腸中的相對(duì)豐度分別為16%和1%；瘤胃球菌在大腸和小腸中的相對(duì)豐度中分別為9%和0.3% （圖3B）。

2.4 野生型巴馬豬公母表型差異和菌群組成的關(guān)系

從解剖的表型來看，野生型公豬的肌肉占比顯著高于野生型母豬（圖4 A、B）。將所有樣品分成三組進(jìn)行比較，找出與表型相關(guān)聯(lián)的差異菌群。三組分別是（公WT：母WT）、（公WT：公KO）、（母WT：母KO）。對(duì)野生型公母豬菌群分類組成進(jìn)行差異分析，檢測(cè)到8個(gè)微生物至少在一個(gè)腸段中顯著差異（但是只有4個(gè)是豐度比較高的）；它們分別是蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcaceae）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。如圖4C所示，蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）在公豬回腸中高豐度，乳桿菌屬（Lactobacillus）在公豬回腸低豐度。鏈球菌屬（Streptococcus）和消化鏈球菌屬（Peptostreptococcaceae）在公豬盲腸、直腸中高豐度。

2.5 基因敲除之后巴馬豬表型差異和菌群組成的關(guān)系

敲除ZBED6后，肌肉生長(zhǎng)增加（圖5A、D）［17］。雌性WT豬和雌性KO豬之間有5種不同的OTU，但只有乳桿菌（Lactobacillus）和SMB53顯示高豐度。細(xì)菌組成顯示，乳桿菌（Lactobacillus）在雌性WT豬回腸中富集，而SMB53在雌性KO豬的盲腸中富集（圖5B、C）。雄性WT豬和KO豬之間有8種不同的OTU，但只有普雷沃菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和SMB53顯示較高的豐度。普雷沃菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在直腸中富集（圖5E、F），SMB53在KO豬盲腸中富集（圖5G）。

3 討 論

哺乳動(dòng)物的腸道是一個(gè)密集的、動(dòng)態(tài)的、高度復(fù)雜的微生物群落，不同的菌群結(jié)構(gòu)能直接或間接的影響表型。在本研究中，利用前期構(gòu)建的敲除ZBED6巴馬小型豬模型，對(duì)其不同腸段進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序。結(jié)果表明，與人類和小鼠一樣，巴馬小型豬的腸道微生物群也以厚壁菌門和擬桿菌門為主［26］。與野生型母豬相比，公豬瘦肉率較高，其中蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）在野生型公豬回腸中顯示高豐度。蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）是一種革蘭陽性厭氧菌，能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸［27］。在嚙齒類動(dòng)物小腸和人類糞便微生物群中，蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）可達(dá)到20%［28］和0.5%［29］的相對(duì)豐度。一項(xiàng)研究運(yùn)動(dòng)與腸道菌群相關(guān)性的試驗(yàn)對(duì)C57BL/6J小鼠腸道微生物組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在隨意輪流運(yùn)動(dòng)6周后，直腸和糞便中的蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）減少［30］。

此外，豬只進(jìn)食生馬鈴薯淀粉會(huì)增加大腸內(nèi)的蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）［31］。說明蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）可能會(huì)影響采食進(jìn)而影響肌肉表型。因此推測(cè)，與野生型母豬相比，公豬可能是由于腸道高豐度的蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）表現(xiàn)出更高的瘦肉率。乳桿菌（Lactobacillus）在調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫、維持細(xì)菌穩(wěn)態(tài)和身體健康、輔助消化、提高生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)速度等方面的有重要作用［32-33］。有研究表明乳桿菌（Lactobacillus）能顧通過腸道-肌肉軸調(diào)節(jié)與年齡相關(guān)的肌肉損傷的發(fā)生和進(jìn)展［34］。乳桿菌（Lactobacillus）在回腸中富集，與野生型母豬相比，野生型公豬中的乳桿菌（Lactobacillus）顯著減少；敲除型母豬中的乳桿菌（Lactobacillus）顯著減少，表明乳桿菌（Lactobacillus）的減少對(duì)應(yīng)著肌肉量的增加，暗示乳桿菌（Lactobacillus）可能通過改變代謝從而影響肌肉表型。敲除ZBED6之后，公豬直腸中普雷沃菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）豐度增加，這兩種菌通常作為膳食纖維的降解者［35］，普雷沃菌屬（Prevotella）可增強(qiáng)多糖的發(fā)酵，是阿拉伯木聚糖和低聚果糖中丙酸短鏈脂肪酸的高級(jí)生產(chǎn)者［36］，公豬直腸中的高豐度可能增強(qiáng)肌肉對(duì)糖類的吸收。SMB53作為野生型公母豬和敲除型公母豬共有的差異菌，顯著富集于小腸。SMB53屬于梭菌科，這個(gè)家族的大多數(shù)成員有能力消耗腸道黏液和植物來源的糖類如葡萄糖［37-38］。在豬成長(zhǎng)過程中，SMB53先增加后減少［39］，在一項(xiàng)豬基因組和腸道微生物關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)MALRD1基因的內(nèi)含子區(qū)域有一個(gè)SNP和SMB53有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，MALRD1基因參與膽汁酸合成調(diào)控，能夠修飾腸道微生物，ZBED6作為轉(zhuǎn)錄因子，也可能存在修飾腸道微生物的可能［40］。也有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)2型糖尿病小鼠盲腸中SMB53富集，與糖脂肪代謝密不可分［41］。在一項(xiàng)減重手術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，SMB53和體重減輕呈正相關(guān)［42］。總之，本研究表明，ZBED6不僅僅作為轉(zhuǎn)錄因子，從體內(nèi)調(diào)控肌肉和脂肪的改變，同時(shí)也影響著腸道菌群，為轉(zhuǎn)基因育種提供了新思路。

4 結(jié) 論

本研究采用微生物16S rRNA基因高通量測(cè)序，對(duì)野生型廣西巴馬小型豬和ZBED6敲除型廣西巴馬小型豬的腸道微生物的組成變化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敲除ZBED6后，母豬的回腸中乳桿菌（Lactobacillus）含量下降，盲腸中SMB53的含量上升；敲除ZBED6后，公豬的直腸中普雷沃菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）的含量上升，盲腸中SMB53的含量上升。敲除了ZBED6之后，增加了公母豬的盲腸中SMB53的豐度，可能是導(dǎo)致肌肉增多的一個(gè)因素。本研究將瘦肉型轉(zhuǎn)基因豬和腸道微生物相關(guān)聯(lián)，為優(yōu)質(zhì)性狀的選育提供了參考。

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（編輯 郭云雁）