[摘要] 目的 探討Toll 樣受體（TLR） 和白細胞介素-17 （IL-17） 基因的遺傳多態(tài)性及與口腔扁平苔蘚（OLP）的相關性。方法 選取病例組（OLP 組） 患者與對照組（未患OLP 人群） 外周血提取的DNA為研究對象，選取TLR與IL-17 上的7 個單核苷酸多態(tài)性（SNP） 位點，分別是TLR3 中的rs5743312、TLR2 中的rs121917864 和IL-17A 中的5 個SNP 位點（rs4711998、rs3819024、rs8193036、rs3748067 和rs17878530）。 采用高分辨率熔解曲線分析法進行外周血細胞PCR產(chǎn)物基因多態(tài)性檢測，并與DNA測序結(jié)果比對。統(tǒng)計分析SNP 位點與OLP 發(fā)生的相關性。結(jié)果 rs5743312 （TLR3）、rs3819024 （IL-17A） 與OLP 的發(fā)生相關，并有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。 其余5 個SNP 位點未檢測出與OLP 相關。結(jié)論 rs5743312 （TLR3） 和rs3819024（IL-17A） 可能與OLP 的易感性相關。

[關鍵詞] 單核苷酸多態(tài)性； 高分辨率熔解曲線分析； 口腔扁平苔蘚； 易感性

[中圖分類號] R781.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024016

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP） 是一種慢性炎癥性口腔黏膜疾病，也是一種免疫相關性疾病。其癌變率為0.4%～2.0%，世界衛(wèi)生組織將其歸類為癌前病變。臨床表現(xiàn)包括從無癥狀的白色角化性病變到疼痛性糜爛和潰瘍，主要包括3種臨床形式：網(wǎng)狀型、糜爛型和萎縮型[1]。 其病因和發(fā)病機制尚不清楚，但大量研究[2]表明遺傳和免疫因素在OLP的發(fā)生發(fā)展中占重要地位。復雜性狀疾病的發(fā)病，如心血管疾病、腫瘤、自身性免疫疾病等，由多個基因位點共同參與，且與環(huán)境因素相互作用，共同決定疾病的表型。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是人類基因組中發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳變異類型之一[3]。平均而言，每隔1 000個堿基對（base pair，bp） 即可發(fā)現(xiàn)一個SNP， 人群中發(fā)生頻率超過1%[4]。 多項研究[5-8]表明，編碼免疫相關組分的SNP對OLP表型、發(fā)生、發(fā)展和預后有重要影響。 此外，疾病易感性還與種族有關。

免疫因子在OLP發(fā)病機制中具有重要作用。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR） 參與細胞特異性和非特異性免疫， 活化的TLR通過誘導抗微生物防御系統(tǒng)產(chǎn)生白細胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）和趨化因子來調(diào)節(jié)免疫平衡[9]。 已有研究[10-14]表明，TLR3信號通路參與了OLP及口腔癌的發(fā)生。TLR3 基因位于4 號染色體長臂（4q35 區(qū)域），TLR3 rs5743312 位于外顯子區(qū)域。 TLR3rs5743312 C/T和TLR3 rs5743315 A/C多態(tài)性引起的氨基酸變化可導致TLR3受體胞外區(qū)域的變化，影響TLR信號轉(zhuǎn)導和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，可能增加口腔黏膜疾病的風險[15] 。IL-17是一種促炎因子，可誘導其他細胞因子和趨化因子的表達，介導炎癥細胞的募集、浸潤和組織損傷。 IL-17的多態(tài)性與牙周炎、炎癥性腸病、類風濕關節(jié)炎和其他疾病的易感性相關。 此外，IL-17在口腔鱗狀細胞癌[16]的發(fā)病機制中起重要作用。 rs3819024位于IL-17A基因的啟動子區(qū)，SNP的改變可能導致基因轉(zhuǎn)錄活性的改變，從而導致相關疾病的發(fā)生發(fā)展[17]。本實驗研究TLR相關因子和IL-17基因中的SNP，探討其在OLP易感性中的作用。

自2003年高分辨率熔解曲線分析法（high resolutionmelting curve analysis，HRM） 被引入到基因突變檢測領域內(nèi)，HRM被廣泛應用于SNP的發(fā)現(xiàn)和鑒定方面，是一種高通量、低成本、無污染、易于操作、敏感度高、特異度好的方法[18]。本研究在TLR2、TLR3 和IL-17A 中嘗試了7 個SNP，rs5743312和rs121917864分別在TLR3和TLR2中，其他SNP （rs4711998、rs3819024、rs8193036、rs3748067和rs17878530） 在IL-17A中。rs3819024、rs4711998、rs8193036、rs3748047和rs17878530位于IL-17A基因的啟動子區(qū)，rs121917864位于TLR2的外顯子區(qū)。通過影響蛋白表達水平發(fā)揮其生物學功能，從而增加對疾病的易感性[19-25]。本實驗采用此種方法檢測TLR3與IL-17的SNP位點以及在山西漢族人群中的發(fā)生概率，以期為OLP在人群中大規(guī)模篩查提供思路。

1 材料和方法

所有臨床研究均通過山西醫(yī)科大學機構(gòu)倫理委員會（協(xié)議號2016LL046） 批準。

1.1 患者一般資料

選取2021年1月至2022年6月于山西醫(yī)科大學口腔醫(yī)院確診并治療的OLP患者作為試驗研究對象，試驗分為病例組和對照組（未患OLP人群）。納入標準：1） 符合改良世界衛(wèi)生組織OLP診斷標準[26]；2） 符合《口腔黏膜病學》第4版分型標準；3） 所有患者臨床表現(xiàn)和病理檢查均確診為OLP；4） 所有患者均簽署知情同意書。排除標準：1） 排除苔蘚樣病變、口腔白斑病、口腔念珠菌感染、白色過角化、天皰瘡、白色海綿狀斑痣、口腔黏膜下纖維化、盤狀紅斑狼瘡、天皰瘡及類天皰瘡等其他口腔黏膜疾病和合并有皮膚病損的OLP患者；2） 排除有高血壓、糖尿病、心臟病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、慢性肝炎等全身疾病的患者；3） 排除服用某些藥物及口內(nèi)有局部刺激因素引起苔蘚樣病變的患者；4）排除孕婦和哺乳期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集和DNA提取

清晨空腹采集研究對象外周血2 mL，注入乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 抗凝真空采血管中，搖勻，保存于-20 ℃冰箱備用。采用全血提取試劑盒（北京天根生化技術(shù)有限公司） 提取DNA。

1.2.2 HRM-PCR分型技術(shù)

本研究共選取7個SNP位點進行實驗，分別是rs5743312、rs1219-17864、rs4711998、rs3819024、rs8193036、rs374-8067、rs17878530。對照組中，rs8193036、rs374-8067及rs17878530這3個位點可以分出3種不同的基因型，但OLP病例組中只分出1種基因型， 無法統(tǒng)計；rs121917864位點病例組及對照組均分出2種基因型，無法統(tǒng)計；rs5743312、rs4711998和rs3819024病例組與對照組均分出3種不同的基因型。

利用PubMed中的FASTA函數(shù)，得到rs5743312、rs3819024和rs4711998的上游和下游約300 bp長的堿基序列。 引物設計采用Primer 5.0 （上海生工生化科技有限公司）。PCR反應：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 變性30 s， 53 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸6 s，72 ℃ 延伸7 min， 共擴增35個周期。 采用LightScanner軟件及系統(tǒng)支持軟件Call-IT 2.0進行分析。每個測試樣本的HRM錄入由計算機自動完成。

1.2.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對病例組與對照組人群基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。采用病例-對照研究方法，對病例組與對照組人群基因型及等位基因頻率分布的比較采用卡方檢驗，同時計算相對危險度估計值（odds ratio，OR） 和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。Plt;0.05具有顯著性統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

根據(jù)納入和排除標準共收集83例病例組和87例對照組。病例組包括55例糜爛型，28例非糜爛型。其中男性19例，女性64例，年齡17～78歲，平均年齡47.88歲。具體臨床指標參數(shù)見表1，兩組在性別和年齡方面差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。

2.2 HWE檢驗

采用吻合度檢驗，運用卡方統(tǒng)計量衡量基因型數(shù)目的觀察值與該位點上全部基因型頻率分布，符合HWE檢驗（Pgt;0.05），見表2。

2.3 HRM分型結(jié)果

通過PCR-HRM方法對病例組及對照組上述3個SNP位點PCR產(chǎn)物分析顯示：rs5743312S位點的病例組及健康對照組可分出CC、CT、TT三種基因型，rs4711998和rs3819024這兩個SNP位點的病例組及對照組可分出GG、AA、AG三種基因型，熔解曲線及分型曲線見圖1、2。

2.4 DNA測序結(jié)果

DNA測序結(jié)果見圖3，與PCR-HRM基因分型結(jié)果吻合。

2.5 統(tǒng)計學結(jié)果

rs5743312 （TLR3）、rs4711998 （IL-17A） 和rs3819024 （IL-17A） SNP位點與OLP關聯(lián)分析見表3、4。經(jīng)卡方檢驗得出的統(tǒng)計學結(jié)果顯示：rs5743312與rs3819024的等位基因頻率和基因型分析在病例組與對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。

3 討論

以往研究[27]發(fā)現(xiàn)rs5743312是口腔鱗狀細胞癌的標志。與野生型（CC） 基因型[28]相比，rs574-3312（Cgt;T） 多態(tài)性使癌癥風險增加了1.11倍。本試驗中，在病例組和對照組的TLR3 rs5743312中均檢測到CC、CT和TT基因型。rs5743312等位基因分析顯示，C為主要等位基因，病例組和對照組的發(fā)生率分別為68.1%和31.9%，G為次要等位基因。統(tǒng)計結(jié)果顯示，在OLP中TT型占15.7%，CT型和CC型占84.3%，對照組分別為10.6%和89.4%。將CT型與CC型合并為一組時，基因型頻率比較結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計學意義[χ2=4.411，P=0.036，OR=3.046，95% CI （1.035，8.965） ]。病例組和對照組的等位基因頻率組間差異也有統(tǒng)計學意義[χ2=6.846，P=0.009，OR=1.931，95% CI （1.175，3.174） ]，表明T等位基因是OLP的危險因素。

IL-17A在生發(fā)中心的形成和自身抗體的產(chǎn)生中起著關鍵作用。局部病灶和外周血中的Th1、Th17細胞可能與OLP的發(fā)病機制有關，IL-17可能是OLP中重要的促炎細胞因子[29-30]。關于IL-17Ars3819024和rs4711998的研究多集中于癌癥和炎癥等方面。IL-17A rs3819024 （A/G） 和rs4711998（A/G） 多態(tài)性可能是中國人群哮喘易感性的潛在危險因素[31]，rs3819024 （A/G） 多態(tài)性還可能與賁門腺癌的發(fā)生相關，但同時又降低了類風濕性關節(jié)炎的風險[22]。IL-17A rs4711998多態(tài)性提高了胃癌發(fā)病率，同時又降低了食管癌的發(fā)病率。本研究中， rs3819024 和rs4711998 分別檢測到GG、AA和AG三種基因型。等位基因分析顯示，OLP病例和對照組的rs3819024等位基因頻率以A為主，分別為68.1%和48.9%。 rs4711998的主等位基因A分別為60.2%和64.9%。rs3819024基因分型分析顯示，6%的OLP患者存在GG型，94%的OLP患者存在AA型和AG型；相比之下，這一比例在對照組中分別為28.7%和71.3% （見表4）。AA型和AG型合并為一組時，基因型頻率比較結(jié)果顯示，兩組間差異有統(tǒng)計學意義[χ2=15.076，Plt;0.001，OR=6.29，95% CI （0.058，0.439） ]。兩組的等位基因頻率也有統(tǒng)計學差異[χ2=12.91， Plt;0.001，OR=0.448，95% CI （0.288，0.697） ]。因此，等位基因G是OLP發(fā)病機制中的保護因子。rs4711998基因分型統(tǒng)計結(jié)果顯示，OLP病例組GG型占19.3%，AA 和AG 型占80.8%； 對照組分別為12.6% 和87.4%。AA型和AG型合并為一組時，基因型頻率比較結(jié)果顯示兩組間差異無統(tǒng)計學意義，提示這種多態(tài)性可能與OLP的發(fā)病無關。

在對照組中鑒定出rs8193036 （IL-17A）、rs3748067 （IL-17A） 和rs17878530 （IL-17A） 有3種不同的基因型，但在OLP組中只鑒定出1種基因型。在rs121917864 （TLR2） 中鑒定出2種基因型。這些結(jié)果的出現(xiàn)，可能原因是樣本量不夠，也可能是因為一個基因在人群中的比例太低，無法成功分型，后續(xù)試驗將擴大樣本量，繼續(xù)深入探究。

基于SNP在基因組中大量存在，本試驗僅代表探究SNP與OLP發(fā)病相關性的開始。未來將擴大樣本量來識別新的SNP位點，將HRM技術(shù)應用于OLP的大規(guī)模篩查和預防，進一步探究TLR基因和IL-17基因在OLP發(fā)病中的分子機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（ 本文編輯 吳愛華 ）

[基金項目] 山西省基礎研究計劃項目（202103021223235）