關(guān)鍵詞：鎘；腐植酸負(fù)載納米零價鐵；水稻；代謝組學(xué)；差異代謝物

水稻是我國重要的糧食作物，農(nóng)田土壤重金屬污染會嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因農(nóng)田重金屬污染減產(chǎn)的糧食超過1200萬t，造成直接經(jīng)濟(jì)損失200多億元。其中，鎘（Cd）作為農(nóng)田土壤中主要的重金屬污染物之一，其點位超標(biāo)率為7.0%。Cd在農(nóng)田土壤一植物系統(tǒng)中的遷移、轉(zhuǎn)化行為極為活躍，不僅會嚴(yán)重影響土壤結(jié)構(gòu)與功能，還可富集于水稻、小麥等糧食作物籽粒中，并經(jīng)食物鏈作用于人體肝臟、腎臟及運動系統(tǒng)等，對人類健康造成潛在威脅。因此，改善農(nóng)田土壤環(huán)境、保障糧食安全生產(chǎn)，不僅是環(huán)境科學(xué)發(fā)展的重要方向之一，也是提升農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全的重要需求。

近年來，納米技術(shù)的發(fā)展為污染農(nóng)田土壤的快速、綠色修復(fù)提供了新機遇。其中，納米零價鐵（Na-noscale zero-valent iron，nZVI）因具有比表面積大、表面活性高及還原活性強等優(yōu)勢，在解決土壤重金屬污染問題上顯示出了良好的應(yīng)用潛力。一方面，nZVI可通過鈍化作用，降低土壤中鉻（Cr）、鉛（Pb）及Cd等重金屬污染物的生物可利用性，削弱有毒物質(zhì)向食物鏈遷移能力，在重金屬污染土壤的修復(fù)中起著核心作用。另一方面，nZVI可促進(jìn)水稻根表鐵膜形成，限制Cd向植物內(nèi)部遷移。值得注意的是，nZVI作為一種潛在的納米肥料，可促進(jìn)水稻分蘗、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)合成，從而提高水稻產(chǎn)量。盡管nZVI在重金屬污染農(nóng)田土壤修復(fù)中彰顯了良好的應(yīng)用前景，然而受范德華力、高表面能和磁性作用影響，添加到環(huán)境中的nZVI顆粒易發(fā)生團(tuán)聚或氧化，這嚴(yán)重限制了其在現(xiàn)實土壤污染修復(fù)中的推廣應(yīng)用。因而，nZVI的改性研究受到了國內(nèi)外研究者的持續(xù)關(guān)注。

腐植酸（HA）作為一種天然有機聚合物，含有大量的活性官能團(tuán)，兼具來源廣泛、環(huán)境風(fēng)險低等特點，已成功應(yīng)用于包括nZVI、硫化亞鐵等在內(nèi)的多種鐵基納米材料的改性過程。HA改性鐵基納米材料的分散性、穩(wěn)定性及其在多孔介質(zhì)中的遷移能力均有顯著提升，且在污染物修復(fù)過程中展現(xiàn)了更高的反應(yīng)活性。Tan等證明經(jīng)HA包覆后納米硫化亞鐵水合粒徑減小，且該材料可通過吸附、還原及共沉淀作用，實現(xiàn)對含Cr（Ⅵ）廢水的高效修復(fù)。然而相關(guān)研究主要集中于HA改性鐵基納米材料對環(huán)境介質(zhì)中重金屬修復(fù)及生物有效性的影響，對于其如何影響污染修復(fù)過程中水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)合成尚不得而知。

代謝組學(xué)旨在對生物細(xì)胞在特定時期內(nèi)小分子代謝物質(zhì)（相對分子質(zhì)量小于1000）進(jìn)行定量和定性分析，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域。代謝組學(xué)技術(shù)不僅有助于識別差異代謝物、辨別作物品種，還可通過篩選差異代謝通路揭示作物抵抗逆境的調(diào)控機制。Lan等利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗組織可通過上調(diào)氨基酸、有機酸等組分緩解Cd污染脅迫。然而，目前對于土壤Cd污染修復(fù)研究較少關(guān)注到nZVI及其改性材料對水稻籽粒代謝過程的影響，有關(guān)污染農(nóng)田土壤修復(fù)過程中籽粒的分子響應(yīng)機制尚不清晰。為此，本研究采用吸附絡(luò)合一液相還原法制得一種HA改性nZVI材料（nZVI@HA），結(jié)合水稻盆栽實驗，利用代謝組學(xué)技術(shù)，探明nZVI及其改性材料對于Cd污染土壤修復(fù)過程中水稻產(chǎn)量、籽粒中Cd賦存水平及營養(yǎng)物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的影響。

1材料與方法

1.1土壤采集與分析

受試土壤采自浙江省紹興市柯橋區(qū)任家畈村稻田0～20cm表層土（29°57' 40\"N，120°30' 34\"E）。土樣經(jīng)風(fēng)干過篩后備用。受試土壤pH為6.35、有機質(zhì)含量為65.93g·kg-1，堿解氮、有效磷和有效鉀含量分別為211.77．31.03mg·kg-1和150.63mg·kg-1。

1.2試劑及儀器

硫酸亞鐵（FeS04，AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）、硼氫化鈉（NaBH4，含量≥96%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氯化鎘（CdCl2，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、硝酸（HN03，GR，晶瑞電子材料股份有限公司）、過氧化氫（H202，GR，永華化學(xué)股份有限公司），代謝組分析所用有機溶劑均為色譜級。

火焰原子吸收光譜（VARIAN公司）、有機元素分析儀艾力蒙塔貿(mào)易（上海）有限公司、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS，賽默飛）、超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜（UHPLC-Q Exactive HF-X，賽默飛）、掃描電鏡（SEM，荷蘭FEI公司）。

1.3材料的合成與表征

以商品化腐植酸鉀為原料，通過酸析法獲得HA，采用液相還原法制得nZVI，并在此基礎(chǔ)上通過改進(jìn)合成nZVI@HA。具體操作方法如下：配制FeS04與HA混合溶液，攪拌12h后，在氮氣條件下泵入NaBH4溶液，經(jīng)攪拌、離心、真空干燥獲得nZVI@HA。利用SEM對HA、nZVI及nZVI@HA進(jìn)行形貌結(jié)構(gòu)表征。所得材料經(jīng)微波消解后，總鐵含量以火焰原子吸收光譜測定。利用有機元素分析儀測定各材料中C、N、H和S的含量。

1.4盆栽實驗

以浙粳100為受試生物，利用水稻盆栽實驗，比較研究Cd污染土壤中，nZVI、HA單一／聯(lián)合處理以及nZVI@HA作用下水稻產(chǎn)量及籽粒代謝物組成結(jié)構(gòu)。各組Cd含量為20mg·kg-1，考慮到nZVI@HA中鐵含量為58.5%，各處理設(shè)置如下：空白組、nZVI@HA處理組（1000mg·kg-1）、單一nZVI處理組（585mg·kg-1）、單一HA處理組（415mg·kg-1）、nZVI和HA聯(lián)合處理組（585mg·kg-1 nZVI+415mg·kg-1 HA），分別記為CK、nZVI@HA、nZVI、HA、nZVI+HA。nZVI等修復(fù)材料通過與潔凈土壤逐級稀釋均勻分散于土壤中，以達(dá)到實驗設(shè)置的含量；Cd2+以CdC12溶液的形式注入到土壤中后攪拌均勻。老化處理參照王萌等的方法，土壤靜置平衡兩周后再種植水稻，各處理含干土質(zhì)量為3.5kg，實驗設(shè)置3個平行，每個平行包含3株水稻作物。實驗期間保持盆栽液面高于土壤1-3cm。于灌漿期收集水稻籽粒，籽粒經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于代謝組學(xué)分析；于140d收割水稻記錄籽粒質(zhì)量后進(jìn)行籽粒Cd含量測定。

1.5水稻籽粒Cd含量測定

水稻籽粒中Cd含量的測定方法參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定》（GB 5009.15_2014）。成熟期籽粒冷凍干燥之后脫殼、研磨，稱取0.5g于消解管中，增設(shè)兩個空白試劑以及標(biāo)準(zhǔn)Cd大米[GBW（E）100358]進(jìn)行質(zhì)量控制，加入5mL HN03以及2mLH202，利用微波消解儀進(jìn)行消解，經(jīng)趕酸、定容后使用ICP-MS測定Cd含量，質(zhì)控樣品平均回收率為92.9%。

1.6水稻籽粒代謝組學(xué)分析

稱?。?0+5）mg灌漿期籽粒，加入400uL含有0.02mg·mL-1 L-2-氯苯丙氨酸的甲醇提取液。樣品經(jīng)研磨、超聲30min（5℃，40 kHz）、靜置30min（-20℃）、離心15min（4℃，13000g）后，移取上清液至棕色液相小瓶中，待測。

利用UHPLC-Q Exactive HF-X平臺進(jìn)行代謝物質(zhì)分析。詳細(xì)儀器條件如下：色譜柱為AcoUITYUPLC HSS T3（100mmx2.1mm i.d.， 1.8um; Waters.美國）；流動相A為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸），進(jìn)樣量為3uL．柱溫為40℃。利用正負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號，其中正模式及負(fù)模式噴霧電壓均為3500V，掃描范圍為70～1050m/z，鞘氣及輔助氣流速分別為50arb和13arb，鞘氣和輔助氣均為氮氣，毛細(xì)管溫度為425℃，S-Lens電壓為50V，碰撞能為20、40、60 eV，F(xiàn)ull MS及MS2分辨率分別為60000和7500。

1.7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用SPSS 27.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)正態(tài)性以q-q plot和Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性以Levene檢驗，并對非正態(tài)、非齊性數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。對滿足正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD進(jìn)行檢驗。利用ProgenesisQI（WatersCorporation，Milford，美國）軟件進(jìn)行代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析，以HMDB Version 5.0（https：//www．hmdb．ca/）、METLIN（https：//metlin．scnpps．edu/）數(shù)據(jù)庫及美吉自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物鑒定匹配。

2結(jié)果與討論

2.1材料的表征

對HA、nZVI及改性后的nZVI@HA進(jìn)行形貌結(jié)構(gòu)分析、有機元素分析及總鐵含量測定。如圖1所示，HA在掃描電鏡下呈不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)，nZVI為球形且高度聚合的鏈條狀，nZVI@HA的電鏡照片顯示球形的nZVI分散于塊狀的HA表面。元素分析及總鐵含量測定結(jié)果顯示，HA中C、Fe、N、H、S的含量分別為50.9%、0.8%、1.1%、3.2%、2.1%，nZVI中上述元素含量分別為0.3%、84.4%、0、0.3%、0.1%，nZVI@HA中各元素含量分別為16.4%、58.5%、0.4%、1.1%、0.2%。上述結(jié)果表明nZVI@HA材料制備成功。

2.2不同修復(fù)材料對Cd污染土壤上水稻生產(chǎn)的影響

不同處理條件下水稻產(chǎn)量及籽粒Cd含量如圖2所示，CK組水稻產(chǎn)量為4.24g·株-1，nZVI、HA和nZVI+HA組水稻產(chǎn)量分別為5.29、6.67g·株-1和7.57g·株-1。Guha等的研究證實，nZVI可通過改善根系代謝、提升水稻光合速率、增加水稻葉片光合色素含量等途徑，促進(jìn)Cd污染土壤上水稻產(chǎn)量的提升。張洪江等也發(fā)現(xiàn)Cd污染土壤中施加含HA的肥料有助于水稻產(chǎn)量的提升。值得注意的是，nZVI@HA組水稻產(chǎn)量最高，達(dá)到7.95g·株-1；且nZVI@HA處理組水稻籽粒Cd含量為0.155mg·kg-1，顯著低于CK（0.776mg·kg-1）、nZVI（0.442mg·kg-1）、HA（0.596mg·kg-1）及nZVI+HA處理組（0.392mg·kg-1）。該結(jié)果表明，nZVI@HA在顯著抑制水稻籽粒中Cd累積的同時還可以促進(jìn)水稻籽粒產(chǎn)量的提升。然而，現(xiàn)有研究主要報道了nZVI等修復(fù)材料對農(nóng)田土壤中重金屬遷移、轉(zhuǎn)化機制及生物有效性的影響，對于nZVI及其改性材料如何影響污染修復(fù)過程中水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)合成尚不得而知。闡明nZVI及其改性材料對農(nóng)田Cd污染土壤修復(fù)過程中水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的影響，有助于揭示農(nóng)田Cd污染土壤修復(fù)過程中修復(fù)材料對水稻籽粒代謝物質(zhì)的種類、含量及代謝通路的影響。

2.3代謝物多元統(tǒng)計分析

主成分分析（PCA）是一種無監(jiān)督分析，通過對復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，將復(fù)雜數(shù)據(jù)簡單化并揭示其結(jié)構(gòu)關(guān)系。如圖3a所示，第一主成分解釋率為31.0%，第二主成分解釋率為14.7%，第三主成分解釋率為11.2%，主成分累計解釋率為56.9%，能在一定程度上反映各組水稻籽粒代謝物存在的差異。CK、HA與nZVI@HA、nZVI、nZVI+HA組在第一主成分上發(fā)生分離，其原因可能是CK組與HA組未添加Feo，導(dǎo)致CK和HA處理組水稻籽粒代謝物組成結(jié)構(gòu)與nZVI@HA、nZVI和nZVI+HA處理組差異較大。偏最小二乘法回歸分析（PIS-DA）是一種有監(jiān)督分析，可通過忽略組內(nèi)誤差，突出組間誤差。圖3b顯示組內(nèi)樣品更加緊密，組間樣本呈明顯分離，未出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，說明模型適用性好。nZVI@HA、nZVI和nZVI+HA組在第二主成分發(fā)生明顯分離，其原因可能在于3組含F(xiàn)eo處理對于水稻籽粒代謝物組成及含量的影響差異較大。累計解釋率R2X及R2Y分別為0.699和0.983，Q2為0.797，置換檢驗結(jié)果均低于原始數(shù)據(jù)點（圖3c），且回歸線呈現(xiàn)向上的趨勢，說明模型具有良好的解釋度以及預(yù)測度。置換檢驗的結(jié)果顯示回歸線截距小于0.05，說明模型未發(fā)生過擬合，模型擬合結(jié)果可靠。

2.4差異代謝物篩選

為探究不同修復(fù)材料對Cd污染土壤上水稻籽粒代謝物組成的影響，以VIPgt;1、Plt;0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將nZVI@HA、nZVI、HA、nZVI+HA組分別與CK組作比較，篩選差異代謝物。如圖4a所示，nZVI@HACK組差異代謝物最多（高達(dá)436個，其中218個上調(diào)、218個下調(diào)），表明nZVI@HA對Cd土壤修復(fù)過程中水稻籽粒代謝物組成的影響最大；nZVI CK組差異代謝物次之（344個），其中265個上調(diào)，79個下調(diào)；nZVI+HA CK組差異代謝物較少（278個），其中131個上調(diào)，147個下調(diào)；HA CK組差異代謝物最少（120個），其中92個上調(diào)，28個下調(diào)。差異代謝物分類如圖4b所示，這些差異代謝物主要分為脂質(zhì)和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環(huán)化合物、有機氧化合物、苯丙烷類和聚酮、苯環(huán)型化合物等。其中脂類不僅可作為水稻籽粒的營養(yǎng)成分，且對抵抗逆境脅迫起到積極作用。同時，有機酸是植物體內(nèi)重要的金屬配體，可與進(jìn)入水稻體內(nèi)的重金屬發(fā)生絡(luò)合或螯合作用，從而降低重金屬的毒害作用。

2.5共有及HA處理特有差異代謝物分析

以各處理組CK組的差異代謝物組成代謝集，各代謝集共有及特有差異代謝物如圖5所示。研究結(jié)果表明，4組代謝集中含有9種共有差異代謝物，其中酵母氨酸（糖精）等6種化合物在nZVI@HA、nZVI、HA及nZVI+HA處理組中均顯著上調(diào)，癸烯?；鈮A（HMDB0241069）等3種化合物顯著下調(diào)。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫匹配，共得到賴氨酸降解（map00310）、賴氨酸生物合成（map00300）及核苷酸代謝（map01232）等11條代謝途徑。然而，以Plt;0.05且影響因子gt;0.1為篩選條件，無法富集到關(guān)鍵代謝通路。該現(xiàn)象說明，Cd污染土壤修復(fù)過程中，nZVI@HA、nZVI、HA及nZVI+HA處理對水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)合成及代謝的影響存在差異，無法通過相同的分子響應(yīng)機制闡釋不同處理條件下水稻產(chǎn)量及品質(zhì)提升的原因。這一結(jié)果與PCA分析一致，可能是由于含F(xiàn)eo處理組（即nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理組）與HA處理組水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)差異較大，無法富集到共有的關(guān)鍵代謝路徑。HA CK、nZVI+HA CK及nZVI@HACK代謝集（即含HA處理）共有10個差異代謝物，其中1個為HA處理特有差異代謝物。該代謝物無法富集到代謝通路，表明HA處理對水稻籽粒代謝物種類及含量影響較小。

2.6 Feo處理特有差異代謝物及路徑分析

為探明nZVI及其改性材料對Cd污染農(nóng)田土壤上水稻籽粒分子調(diào)控機制的影響，詳細(xì)考察了nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理組（即含F(xiàn)eo處理）的差異代謝物組成。代謝集分析結(jié)果顯示，nZVI@HA CK、nZVICK及nZVI+HA CK組代謝集共有93個差異代謝物，其中84個為Fe0處理特有差異代謝物（39種上調(diào)、45種下調(diào)）。KEGG通路富集顯示，3種Feo處理特有差異代謝物共參與20條代謝路徑，其中僅有倍他林生物合成（map00965）、精氨酸和脯氨酸代謝（map00330）2條顯著富集代謝通路（Plt;0.05且影響因子gt;0.1）（圖6a）；同時注釋到的4種關(guān)鍵差異代謝物（脯氨酸、亞精胺、多巴胺、亞茶堿）均在nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理下顯著上調(diào)。該結(jié)果表明，3種Feo處理均可通過促進(jìn)其他次生代謝物合成及氨基酸代謝等方式，提升Cd污染土壤上水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)。已有研究證實脯氨酸、亞精胺及多巴胺等化合物在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如脯氨酸不僅具有滲透壓調(diào)節(jié)及重金屬螯合能力，還可以顯著降低Cd、Zn等重金屬污染對植物體內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及硝酸還原酶的脅迫。此外，亞精胺在緩解重金屬氧化脅迫的同時，還作為一種關(guān)鍵的植物生長促進(jìn)因子，促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和營養(yǎng)物質(zhì)合成。

2.7 nZVI@HA處理特有差異代謝物及路徑分析

各代謝集特有差異代謝物顯示：nZVI@HA CK組（166個）gt;nZVI CK組（87個）gt;nZVI+HA CK組（66個）=HA CK組（66個）。該結(jié)果與差異代謝物鑒定結(jié)果趨勢類似，表明nZVI@HA對于水稻產(chǎn)量及品質(zhì)的提升作用不只是nZVI和HA的相加作用，而且nZVI@HA材料還可通過獨有方式作用于Cd污染土壤修復(fù)過程中水稻籽粒營養(yǎng)物質(zhì)合成及代謝。nZVI@HACK組代謝集中166種特有差異代謝物共參與了水稻籽粒43條代謝途徑，其中包含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（map00250），核苷酸代謝（map01232），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（map00260）．甘油磷脂代謝（map00564）4條關(guān)鍵代謝通路（Plt;0.05且影響因子gt;0.1）（圖6b）。如表1所示，4條關(guān)鍵代謝通路中分別屬于氨基酸代謝、核苷酸代謝及脂質(zhì)代謝過程。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明，nZVI@HA可通過顯著上調(diào)L-天門冬氨酸、L-絲氨酸、腺苷琥珀酸、腺苷酸基丁二酸、5’-單磷酸腺苷以及尿苷-5’-單磷酸6種特有差異代謝物，參與水稻籽粒關(guān)鍵代謝路徑。其中，L-天門冬氨酸及L-絲氨酸作為水稻籽粒發(fā)育過程中的關(guān)鍵代謝物，與稻米品質(zhì)息息相關(guān)。研究結(jié)果表明，nZ-VI@HA通過這4條代謝通路促進(jìn)關(guān)鍵代謝物的合成，是Cd污染土壤修復(fù)過程中水稻產(chǎn)量及品質(zhì)提升的關(guān)鍵生物過程。

3結(jié)論

（1）nZVI及nZVI@HA材料均可顯著降低水稻籽粒中Cd含量，并明顯提升水稻產(chǎn)量。尤其是在nZVI@HA作用下，水稻產(chǎn)量顯著提升至空白組的188%、籽粒Cd含量降至0.155mg·kg-1，低于國家大米Cd限量標(biāo)準(zhǔn)（0.2mg·kg-1， GB2762-2022）.

（2）KEGG富集結(jié)果顯示，nZVI及nZVI@HA材料均可顯著上調(diào)倍他林生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝途徑。

（3）nZVI@HA可特異性地作用于水稻籽粒丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，核苷酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及甘油磷脂代謝途徑，進(jìn)而實現(xiàn)Cd污染農(nóng)田土壤上水稻產(chǎn)量及品質(zhì)的提升。