關鍵詞：豬糞堆肥；膨潤土；腐植酸；重金屬鈍化；微生物

畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖發(fā)展過程中，巨大的糞便量對環(huán)境造成嚴峻考驗，是導致農(nóng)業(yè)面源污染的重要因素。據(jù)統(tǒng)計，我國糞肥資源量每年可達40億t，豬糞產(chǎn)量占比36.71%；約有40%的畜禽糞便未得到高質量處理和利用，近60%的豬糞資源被浪費。豬糞是一種含有粗蛋白、纖維和半纖維等物質的有機復合產(chǎn)物，可作為補充氮源和緩釋氮源，替代化肥為土壤補充肥力、改善有機質礦化條件。但未經(jīng)處理的豬糞有惡臭，病原體和重金屬含量較高，直接施用會造成空氣、水體和土壤污染等環(huán)境問題。

好氧堆肥是一種兼具成本效益和生態(tài)友好的可持續(xù)廢棄物處置方法，但傳統(tǒng)的好氧堆肥技術處理效率低，不能有效降低堆肥中重金屬的含量及其生物有效性。研究表明，克服常規(guī)堆肥技術局限性的有效方法是使用添加劑。膨潤土是一種含有2：1晶體結構，以蒙脫石為主要成分的無機非金屬礦物，其結構單元由Si-0四面體和Al-04 （OH）2八面體組成。由于同晶替代作用，膨潤土層間負電荷增多，吸附的K+、Na+、Ca2+等抗衡離子通過與重金屬陽離子的交換作用，使膨潤土成為重金屬的高效吸附劑。何增明等研究發(fā)現(xiàn)，在豬糞堆肥中添加2.5%的膨潤土后，殘渣態(tài)Zn增幅達158.6%，表明膨潤土是最佳的Zn鈍化劑。在堆肥中適量加入膨潤土可以多方面改善堆肥質量，包括提高堆肥過程中的微生物活性和高溫階段的溫度等；此外，膨潤土的親水表面與糞肥的疏水表面結合，可以加速木質纖維素的降解，縮短生產(chǎn)成熟堆肥所需的時間。腐植酸是一種天然芳香聚合物，由各種含氧官能團交聯(lián)的脂肪族或芳香族單元骨架組成，具有豐富的羧基、酚羥基、甲氧基、酰氨基等功能基團，可以為金屬氧化物與重金屬離子的絡合反應提供更多的活性位點。薛錦輝等將腐植酸添加在豬糞和玉米秸稈堆肥中，發(fā)現(xiàn)腐植酸提高了堆肥腐殖化程度，促進重金屬有效態(tài)向穩(wěn)定態(tài)轉化，對Cu、Zn的鈍化率分別達到58.72%、17.95%。微生物也是控制重金屬形態(tài)轉變的關鍵因子。除水分、養(yǎng)分等堆肥基質對微生物群落演替的直接影響外，添加劑對細菌群落也具有同等重要的調控作用。Hao等研究發(fā)現(xiàn)，添加10%的蒙脫石顯著改變了雞糞堆肥中的細菌群落，通過增強細菌和重金屬組分間的相關性，使Cu和Zn的生物有效性分別降低81.2%和15.6%。趙旭等通過在牛糞堆肥中添加腐植酸煤，發(fā)現(xiàn)堆肥中微生物多樣性提高，微生物群落的平均Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別提高了2.32%-6.06%和23.21%-30.48%。

目前，大多數(shù)研究仍集中于膨潤土和腐植酸在堆肥中的單一使用，而對有機無機相結合進行重金屬鈍化的研究較少。本研究將膨潤土和腐植酸與豬糞共堆肥，通過單獨添加及兩者不同比例混合添加的方式，探究其對堆肥中重金屬Zn、Cu形態(tài)變化的影響以及微生物的響應機制，以期篩選出最佳鈍化比例，為畜禽糞便資源化利用和堆肥工藝改進提供理論依據(jù)和技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的豬糞和木屑收集于山東省泰安市當?shù)仞B(yǎng)豬場和木材加工廠，膨潤土和腐植酸分別購自中國南陽宏發(fā)膨潤土公司和中國唐山大陳種苗培育中心。原料的主要特性如表1所示。

1.2試驗設計

試驗于2022年9-11月在山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院試驗站進行，以豬糞和木屑為堆肥原料，膨潤土和腐植酸為堆肥添加劑，在90L聚氯乙烯反應器中進行為期50d的堆肥試驗。設置空白對照（CK）、膨潤土（BT）、腐植酸（HA）及膨潤土和腐植酸分別按照1：3（BHl）、1：1（BH2）和3：1（BH3）比例混合添加，共6個處理（表2）。添加劑用量為堆體干基的10%，將各處理所需原料充分混合，調整至合適的含水率（60%）和C/N（25）后置于堆肥反應器中。堆肥過程中，保持0.3L·kg-1·h-1的空氣流速，每周手動翻轉堆體，確保堆體氧氣均勻。每天中午記錄堆肥溫度和環(huán)境溫度，于堆肥第0、3、7、12、18、25、32、39、50天采集樣品。取樣時，從堆體頂部、中部和底部各取代表性樣品混合，得到約500 9固體。采集的樣品一部分保存在4℃環(huán)境中，用于測定基本理化性質和重金屬含量；另一部分保存于-80℃低溫環(huán)境中，對其中第3、12、25、50天的樣品進行微生物群落組成分析。

1.3測定指標和方法

將堆肥以1：10固液比浸提后用pH計（PH SJ-3F）和電導率儀（DDS-307A）分別測定pH和電導率（EC）；取上述水浸提液過0.45um濾膜后用總有機碳分析儀測定可溶性有機碳（DOC）含量；采用BCR法提取不同形態(tài)重金屬，提取液中重金屬含量分別用ICP-MS測定，各形態(tài)提取方法見表3。

不同形態(tài)重金屬分配率和鈍化效果根據(jù)式（1）和式（2）計算：

不同形態(tài)重金屬分配率=各形態(tài)重金屬質量分數(shù)／重金屬總質量分數(shù)X100%（1）

鈍化率=（堆肥前重金屬有效形態(tài)一堆肥后重金屬有效形態(tài)）／堆肥前重金屬有效形態(tài)X100%（2）

細菌群落高通量測序：使用EasyPure@ GenomicDNA試劑盒提取堆肥基因組DNA，根據(jù)指定的測序區(qū)域合成帶有條形碼的特異性引物進行擴增。測序區(qū)域338F_806R （338F： ACTCCTACGGGAGGCAG-CAG; 806R： GGACTACHVGGGTWTCTAAT）.PCR試驗采用Pro Taq，20uL反應體系，具體反應參數(shù)：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；再在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物通過QuantiFluor-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行定量，構建Miseq庫，根據(jù)重疊關系拼接PE讀取。使用Trimatic軟件的FLASH版本控制和過濾序列質量，區(qū)分樣本后，在Usearch（7.1版）平臺上進行97%相似水平的OTU聚類分析和物種分類學分析。

1.4數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0進行LSD方差分析，差異顯著性水平設為0.05；采用Origin 2018進行圖形制作，Cano-c05.0進行冗余分析（RDA）；于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的平臺繪制細菌群落組成柱狀圖及相關性熱圖，基于tax-summary-a文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R語言工具繪圖。

2結果與分析

2.1膨潤土和腐植酸對堆肥腐熟度的影響

2.1.1堆肥過程中溫度的變化

由圖1可知，堆肥過程中存在升溫期、高溫期、降溫期以及低溫持續(xù)期4個階段，符合經(jīng)典堆肥溫度變化曲線。堆肥開始后的第1-3天為堆體升溫階段，各處理急劇升溫，最高溫為BH2處理的66.77℃，其余處理最高溫在61.33（BHI）-65.67℃（BT）。堆肥第4-20天為高溫持續(xù)期，CK、BH3處理嗜熱相維持在55℃以上的時間為4d，BH1和BH2各持續(xù)了5d；由于膨潤土的水脹特性以及腐植酸的高腐殖質含量使得堆體維持了較長時間的親熱相，BT和HA處理的嗜熱期分別持續(xù)了11d和9d。在堆肥第35天之后，隨著堆體有機物的消耗，溫度逐漸下降，最終穩(wěn)定在環(huán)境水平。在堆肥降溫階段，各添加劑處理的堆溫均高于CK處理，直至堆肥結束。

2.1.2堆肥過程中pH和EC的變化

堆肥過程中各處理的pH變化基本一致（圖2a），均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。堆肥初始時，各處理pH均值在7.12左右。堆肥進行至第25天時，各處理pH值均顯著升高（Plt;0.05），BT處理顯著高于CK處理，HA和BH3處理與CK無顯著差異，BH1和BH2處理顯著低于CK處理。堆肥結束后，BT處理pH值達到7.41，顯著高于其余各處理（Plt;0.05），而HA處理pH值為7.24，在各處理中最低。

EC代表可溶性鹽含量，其過高或過低均不利于堆肥產(chǎn)品施用后植物的生長。如圖2b所示，EC值在堆肥期間整體呈現(xiàn)逐步上升的趨勢。HA處理中EC波動范圍在3.19-3.80mS·cm-1，高于其余處理。堆肥結束后，除BH2外的各處理EC值均較CK顯著升高。BHI處理的EC值達到3.98mS·cm-1，顯著高于CK處理0.47mS·cm-1：BH2處理的EC值為3.04mS·cm-1，較CK顯著降低0.47mS·cm-1，較BH1顯著降低0.94mS·cm-1（Plt;0.05）。

2.1.3堆肥過程中DOC的變化

各處理的DOC含量在堆肥過程中呈現(xiàn)一致趨勢，均隨著堆肥時間的推進逐漸減少（圖3）。堆肥進行至第12天時，CK處理的DOC含量較堆肥開始時有所上升，其余處理均下降，下降幅度表現(xiàn)為BTgt;BH2gt;BH3gt;BHIgt;HA。堆肥至第25天時，各處理DOC降解率進一步增加。混合添加處理BH1、BH2和BH3的DOC含量較堆肥初始時分別顯著下降11.63%、18.52%和20.90%（Plt;0.05）。堆肥結束后，與初始堆肥相比，CK處理的DOC含量顯著降低122.47mg·kg-1（Plt;0.05），降解率達到28.06%；BT處理的DOC降解率達到24.55%. HA處理DOC含量下降121.95mg·kg-1，降解率達到25.68%?；旌咸砑犹幚鞡H1、BH2和BH3的DOC降解率分別達到39.96%、22.64%和40.52%。

2.2膨潤土和腐植酸對堆肥中重金屬Cu、Zn的影響

2.2.1對重金屬Cu的鈍化效果

豬糞中Cu的生物有效態(tài)（可交換態(tài)和可還原態(tài)）占比較低，且經(jīng)過堆肥發(fā)酵后均有所下降（圖4a）。CK處理堆后的Cu生物有效態(tài)占比較堆前降低4.53個百分點，單獨添加處理BT和HA的Cu生物有效態(tài)降幅較CK分別顯著升高6.46個和0.98個百分點（Plt;0.05）?；旌咸砑犹幚鞡HI、BH2和BH3堆后的有效態(tài)占比較堆前分別降低9.00、5.80個和12.17個百分點，降幅均顯著高于CK處理（Plt;0.05）。堆肥結束后，BT、HA和BHI處理的殘渣態(tài)Cu占比分別提高9.11、4.07個和3.52個百分點。BH2和BH3處理的殘渣態(tài)占比較堆前下降，但可氧化態(tài)Cu占比較堆前分別升高7.71個和30.51個百分點。

添加劑的加入顯著提高了Cu的鈍化率（圖4b），膨潤土和腐植酸混合添加對Cu的鈍化率均超過70%。BH1、BH2和BH3處理的重金屬Cu鈍化率分別達到73.58%、70.57%和79.84%，較CK分別顯著升高41.55、38.54個和47.80個百分點（Plt;0.05）。BT和HA單獨添加處理對重金屬Cu的鈍化率較低，分別為59.91%、45.99%，但較CK分別顯著升高27.88、13.96個百分點（Plt;0.05）。

2.2.2對重金屬Zn的鈍化效果

豬糞中Zn的可交換態(tài)占比較高，在堆肥過程中占比下降（圖Sa）。堆肥結束后，CK、BT、HA處理的可交換態(tài)Zn占比較堆前分別下降33.06、50.66個和42.66個百分點，膨潤土和腐植酸混合添加的BHI、BH2和BH3處理的可交換態(tài)Zn占比較堆前也有所下降。重金屬Zn的殘渣態(tài)含量在堆肥過程中變化較小，但活性較小的可氧化態(tài)占比隨著堆肥過程的推進逐漸上升。與堆前相比，BT和HA處理的可氧化態(tài)Zn占比上升了19.35個和27.11個百分點，混合添加的BH1、BH2、BH3處理分別上升22.12、25.75個和29.74個百分點。各處理堆體中可氧化態(tài)Zn的增幅均顯著高于CK，其中BH3處理增幅最大，較CK顯著升高19.36個百分點（Plt;0.05）。

CK處理的Zn鈍化率為13.89%，各添加劑處理下堆體重金屬Zn的鈍化效果均優(yōu)于CK（圖Sb）。其中，BT和HA處理對重金屬Zn的鈍化率達到25.25%和38.47%，較CK升高11.36個和24.58個百分點。混合添加膨潤土和腐植酸的BHI、BH2和BH3處理對重金屬Zn的鈍化率分別達到29.45%、38.65%和36.97%，較CK升高15.56、24.77個和23.09個百分點。

2.2.3堆肥理化性質與重金屬形態(tài)間的冗余分析

在重金屬Cu形態(tài)占比和堆肥理化性質間的RDA中（圖6），所選參數(shù)累積解釋度為94.29%。C/N是堆肥過程中影響重金屬Cu形態(tài)變化的主要因素，其解釋度達12.60%，貢獻率達59.70%。通過RDA排序圖發(fā)現(xiàn)，溫度、C/N和DOC與可交換態(tài)和可還原態(tài)Cu占比呈正相關關系，與可氧化態(tài)以及殘渣態(tài)Cu占比呈負相關關系，C/N與不同形態(tài)Cu之間的相關性均達到顯著水平（P= 0.042）。pH與可交換態(tài)Cu占比呈負相關關系，與可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cu占比呈正相關關系，但未達顯著水平。

重金屬Zn形態(tài)占比和堆肥理化性質間的冗余分析顯示，RDA所選參數(shù)累積解釋度為99.66%（圖7）。其中，T（P=0.002）和C/N （P=0.026）與可交換態(tài)Zn占比呈顯著正相關關系，與可氧化態(tài)、可還原態(tài)以及殘渣態(tài)Zn占比呈顯著負相關關系。DOC與可交換態(tài)Zn占比呈正相關關系，與其他形態(tài)占比呈負相關關系；而pH和EC與可交換態(tài)Zn占比呈負相關關系，與可氧化態(tài)Zn占比呈正相關關系。DOC、pH和EC與重金屬Zn形態(tài)占比之間的相關性均未達到顯著水平。

2.3膨潤土和腐植酸對堆肥細菌群落的影響

2.3.1膨潤土和腐植酸對細菌群落組成相對豐度變化的影響

由圖8可見，細菌群落門水平以厚壁菌門（Fir-micutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacte-roidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和綠彎菌門（Chloroflexi）為堆肥過程中的主要優(yōu)勢菌門。厚壁菌門隨著堆肥時間的延長，在群落中的相對豐度逐漸降低。添加腐植酸的HA、BH1、BH2和BH3處理在堆肥第12天時，厚壁菌門的相對豐度均顯著高于CK和BT處理（Plt;0.05）。擬桿菌門和變形菌門相對豐度均在堆肥后期逐漸增大，變化趨勢較相似。堆肥結束后，單獨添加的BT和HA處理的擬桿菌門相對豐度分別為32.46%和28.57%，而混合添加的BH1和BH2處理其相對豐度分別為23.16%和31.19%。BH3處理的擬桿菌門相對豐度達到35.50%，較CK處理顯著升高（Plt;0.05）。在堆肥初期，混合添加的BH2和BH3處理的放線菌門相對豐度占比較高，其余處理的相對豐度占比較低，但各處理間無顯著差異。綠彎菌門相對豐度在堆肥前期占比較小（lt;1%），在堆肥后期逐漸增多，堆肥結束時相對豐度上升至最高。

綱水平下（圖9），各處理的優(yōu)勢菌綱為梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、芽孢桿菌綱（Ba-cilli）、變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌綱（Actinobacteria）。優(yōu)勢菌綱在堆肥過程中的變化范圍分別為：梭菌綱1.96%-49.95%、擬桿菌綱0.71%-62.06%、芽孢桿菌綱1.38%-38.38%、變形菌綱1.84%-23.62%、放線菌綱6.52%-21.13%。梭菌綱和芽孢桿菌綱在嗜熱期相對豐度較高，在成熟期逐漸下降。在堆肥進行至第12天時，BH2處理的梭菌綱相對豐度占比最高，為49.47%，BH3處理的梭菌綱相對豐度達到30.55%，僅次于BH2處理，但都顯著高于CK和單獨添加處理（Plt;0.05）。擬桿菌綱相對豐度在堆肥中后期逐漸上升并達到最高，BT處理在堆肥第25天時擬桿菌綱相對豐度最高，達到62.06%。堆肥結束后，各處理擬桿菌綱相對豐度分別為CK 18.70%、BT32.43%、HA 28.48%、BH1 23.10%、BH2 31.12%、BH335.46%。同擬桿菌門一致，BH3處理的擬桿菌綱相對豐度占比最高，顯著高于CK處理。堆肥初始時，BH3處理的放線菌綱相對豐度達到20.37%，與BH2處理的21.13%無顯著差異，但較同時期的CK處理顯著升高13 .46個百分點（Plt;0.05）。

2.3.2重金屬形態(tài)與細菌群落優(yōu)勢菌門間的相關性分析

細菌群落的多樣性和堆肥中重金屬活性對堆體內(nèi)重金屬的鈍化具有間接促進作用（圖10）。重金屬Zn的形態(tài)變化與細菌優(yōu)勢菌門關聯(lián)緊密，其中，可交換態(tài)Zn與除厚壁菌門外的絕大部分細菌菌門相對豐度均呈顯著負相關關系；可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Zn與之均呈顯著正相關關系（Plt;0.05）?？山粨Q態(tài)Cu與大部分優(yōu)勢菌門呈顯著負相關關系（Plt;0.05），而可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cu與之呈正相關關系，但相關性未達顯著水平。

3討論

好氧堆肥中，pH和EC是評價堆肥腐熟的重要指標。pH影響酶的活性，其變化過程主要與微生物好氧代謝過程中有機氮的礦化作用有關。堆肥進行至第25天時，pH值顯著升高，這是因為隨著堆肥進程過半，有機物質不斷礦化分解，微生物代謝活躍致使含水率急劇下降造成的。EC的高低決定著堆肥產(chǎn)品是否會對植物生長造成毒害作用，但隨著有機質的降解以及水分的減少、可溶性鹽含量增多，EC值顯著升高。膨潤土和腐植酸的加入為堆肥引入了新的離子，使得添加劑處理的EC值均高于CK處理，這與Jiang等的研究結果一致。堆肥結束時各處理pH值穩(wěn)定在7.24-7.41范圍，EC值均低于4.0 mS·cm-1，均滿足堆肥腐熟標準。DOC是一類既含游離氨基酸、糖類等低分子量物質，又含酶、多酚和腐植酸等各類大分子的復雜混合物質。在堆肥過程中DOC含量不斷下降，表明隨著腐殖化作用的增強，大量DOC被微生物吸收利用以合成自身重要組成部分。研究結果顯示，BH3處理的DOC降解率最高，表明7.5%膨潤土和2.5%腐植酸混合添加更有利于堆肥腐熟。

膨潤土和腐植酸以自身多孔、高吸附和高交換性以及具備多種活性官能團等特性對重金屬的形態(tài)變化產(chǎn)生顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于CK處理，膨潤土和腐植酸的添加顯著提高了重金屬Cu和Zn的鈍化率，且混合添加效果優(yōu)于單獨添加。其中，BH3處理對重金屬Cu和Zn的鈍化率分別為79.84%和36.97%，鈍化效果最佳。研究表明，添加劑對重金屬的鈍化不僅以物理吸附為主，對堆肥腐熟度的影響也是決定重金屬生物有效性的重要因子。鈍化效果最佳的BH3處理的DOC降解率也最高，達到40.52%。通過理化性質和重金屬形態(tài)間的冗余分析可知，DOC與可交換態(tài)Cu、Zn呈正相關關系，與殘渣態(tài)和氧化態(tài)呈負相關關系。Xue等指出，DOC具有低分子量和高官能團特性，易與重金屬形成可溶可流動的金屬配合物，隨著DOC含量的減少，重金屬生物可利用態(tài)減少，穩(wěn)定態(tài)配比增多。研究發(fā)現(xiàn)，膨潤土和腐植酸對Cu的鈍化效果優(yōu)于Zn，這是因為重金屬Zn是兩性金屬，具有活性強、不穩(wěn)定等特點，不易被鈍化。且在同一發(fā)酵系統(tǒng)中，重金屬Zn與Cu存在競爭，腐植酸等大分子物質會率先與Cu緊密絡合，而Zn主要與小分子量物質結合，且結合不穩(wěn)定，易在有機物分解過程中再次游離。

堆肥是微生物分解有機質并引起理化參數(shù)動態(tài)變化的生化過程，添加劑的添加量及其異質性會直接或間接地影響微生物的活性和多樣性，導致有機物降解程度、腐殖質含量等有所不同，從而對重金屬形態(tài)調控存在差異。膨潤土和腐植酸憑借自身多孔性質，為堆體創(chuàng)造了疏松富氧的環(huán)境，使得參與降解纖維素、半纖維素和木質纖維素的厚壁菌門、梭菌綱和芽孢桿菌綱等關鍵微生物大量繁殖；碳水化合物、酰胺化合物和蛋白質等有機物被分解為簡單有機物并聚合成吸附能力更強的芳香環(huán)類、烯烴類腐殖質，以調控重金屬向較為穩(wěn)定的可氧化態(tài)和殘渣態(tài)轉化。因此，重金屬形態(tài)和細菌優(yōu)勢菌門的相關性分析顯示，部分微生物與重金屬形態(tài)間存在顯著相關性。BH3處理的Cu、Zn可交換態(tài)降幅高于其余處理，這是由于BH3處理顯著促進了擬桿菌門和擬桿菌綱的相對豐度升高。在擬桿菌門和擬桿菌綱的作用下，堆體木質纖維素被有效分解成負價脂肪酸，并與金屬陽離子結合成化合物。

4結論

（1）7.5%膨潤土和2.5%腐植酸混合添加處理中可溶性有機碳的降解率達40.52%，更有利于堆肥腐熟。

（2）膨潤土和腐植酸的加入對堆肥重金屬Cu和Zn均有顯著鈍化作用。混合添加處理的鈍化效果優(yōu)于單獨添加，對重金屬Cu的鈍化效果優(yōu)于重金屬Zn?；旌咸砑?.5%膨潤土和2.5%腐植酸對重金屬Cu和Zn的鈍化率分別達到79.84%和36.97%，為最佳鈍化比例。

（3）混合添加7.5%膨潤土和2.5%腐植酸使堆體中參與碳氮轉化的厚壁菌門，參與纖維素降解的擬桿菌門、擬桿菌綱，以及抑制病原微生物的放線菌綱等細菌物種的相對豐度顯著升高。