【摘要】 目的 探討miR-24對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導下的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）自噬的影響及其相關機制，為進一步闡明miR-24在動脈粥樣硬化（AS）中的作用提供理論依據(jù)。

方法 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-24的表達；應用蛋白免疫印跡法（western blot）和qRT-PCR法檢測Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt的蛋白和mRNA表達水平；應用透射電子顯微鏡技術檢測細胞的自噬小體生成情況；應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、細胞劃痕法、Caspase-3比色法和Hoechst 33258染色法分別檢測細胞活性、遷移和凋亡情況。

結果 應用ox-LDL誘導HUVECs后，發(fā)現(xiàn)HUVECs中miR-24的表達顯著降低（P＜0.05）。miR-24過表達可明顯抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬（P＜0.05），而miR-24低表達則會增加ox-LDL誘導的HUVECs自噬（P＜0.05）。miR-24過表達可顯著降低Beclin-1的表達水平，上調LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的水平（P＜0.05），同時，miR-24過表達可顯著促進p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達（P＜0.05）。此外，miR-24過表達顯著抑制HUVECs的活力和遷移，增加Caspase-3活性并促進其凋亡（P＜0.05）。

結論 miR-24的過表達可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而降低ox-LDL誘導的HUVECs的自噬水平并促進其凋亡，miR-24可能成為AS的潛在治療新靶點。

【關鍵詞】 氧化低密度脂蛋白；人臍靜脈內皮細胞；PI3K/Akt/mTOR信號通路；miR-24；自噬；凋亡

中圖分類號：R36.1+2；R544 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.09.002

Study on the regulation of ox-LDL induced autophagy mechanism in HUVECs by miR-24 based on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

YANG Peng， YANG Zengyan， ZHAI Yang， ZHOU Weiqian， LUO Xuelan， OU Hesheng▲

（Department of Science and Technology， Guangxi International Zhuang Medical Hospital， Nanning 530201， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-24 on autophagy in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） induced by oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL） and its related mechanism， so as to provide a theoretical basis for further elucidating the role of miR-24 in atherosclerosis （AS）.

Methods Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miR-24; western blot and qRT-PCR were applied to detect the protein and mRNA expression levels of Beclin-1， LC3Ⅰ/LC3Ⅱ， p-mTOR， p-PI3K， and p-Akt; transmission electron microscopy was used to measure the formation of autophagosomes in cells; MTT assay， cell scratch assay， Caspase-3 colorimetric assay， and Hoechst 33258 staining were used to assess cell viability， migration， and apoptosis， respectively.

Results After inducing HUVECs with ox-LDL， it was found that the expression of miR-24 in HUVECs was significantly reduced （P<0.05）. Overexpression of miR-24 significantly inhibited autophagy induced by ox-LDL in HUVECs （P<0.05）， while downregulation of miR-24 increased autophagy induced by ox-LDL in it （P<0.05）. The overexpression of miR-24 could significantly reduce the expression levels of Beclin-1 and upregulate the levels of LC3Ⅰ/LC3Ⅱ（P<0.05）. At the same time， the overexpression of miR-24 could significantly promote the expressions of p-PI3K， p-Akt， and p-mTOR （P<0.05）. Furthermore， overexpression of miR-24 significantly inhibited the viability and migration of HUVECs， increased the activity of Caspase-3， and promoted apoptosis （P<0.05）.

Conclusion Overexpression of miR-24 can activate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway， reduce the level of autophagy induced by ox-LDL in HUVECs， and promote apoptosis， which miR-24 may become a potential new therapeutic target for AS.

【Keywords】 oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）; human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; miR-24; autophagy; apoptosis

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）的病理過程十分復雜，血管內皮細胞（vascular endothelial cells， VECs）損傷、自噬功能障礙和miRNA的異常表達等多種因素都參與了AS的發(fā)生發(fā)展過程［1-2］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL）是一種促AS發(fā)展的關鍵因子［3］，其可導致VECs損傷、內皮細胞自噬功能障礙和凋亡，這有助于促進AS的發(fā)生發(fā)展［4］。

自噬是一種維護細胞內環(huán)境和組織穩(wěn)態(tài)的機制。在某些應激條件下，細胞需要降解胞內不必要的蛋白質和細胞器來維持自身生存及穩(wěn)態(tài)，這一過程可通過自噬來實現(xiàn)。當VECs損傷后，可誘發(fā)自噬以保護細胞，而當自噬誘發(fā)失敗或被抑制時，內皮的完整性被破壞而促進局部脂質沉積，導致AS、斑塊不穩(wěn)定、急性血管閉塞甚至猝死［5］。自噬調節(jié)機制復雜，目前被認為與多條信號通路有關，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路是典型的自噬信號傳導途徑，該通路可能參與AS自噬的誘導［6-7］，但其具體的分子機制還需進一步探索。AS的發(fā)生還受到基因表達的調控，在基因的轉錄過程中，microRNAs（miRNAs）的差異性表達與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究表明，部分miRNAs可通過影響VECs的增殖、遷移、自噬和凋亡來促進AS的進展［8］，如位于人類9號染色體上的miR-24，其成熟序列在心血管疾病中起著至關重要的作用［9］。在前期的研究中，已發(fā)現(xiàn)miR-24可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞（humanumbilical vein endothelial cell， HUVECs）自噬及增殖［10］。因此，本研究為進一步探討miR-24與HUVECs自噬之間的相關分子機制及其是否對AS有潛在作用，將采用ox-LDL誘導HUVECs自噬并體外模擬AS模型，以PI3K/Akt/mTOR為切入點探究miR-24調控HUVECs自噬的相關分子機制，進一步探討miR-24通過調控自噬在AS中的潛在價值，為AS提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與ox-LDL誘導HUVECs

HUVECs購自中國科學院細胞庫，用含15%新生胎牛血清（15% FBS）的DMEM培養(yǎng)液，加入青霉素100 IU/mL和鏈霉素0.1 mg/mL，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實驗HUVECs分別用0、25、50、100和200 g/mL濃度的ox-LDL處理0、6、12、24和48小時，檢測miR-24在ox-LDL誘導的HUVECs中表達情況。

1.2 細胞轉染

委托上海吉凱基因化學技術有限公司，設計合成并得到miR-24高表達、anti-miR-24和miR-NC三種載體質粒，見表1。取對數(shù)生長期細胞，分別以每孔5×104個細胞接種到6孔板，正常靜置培養(yǎng)24 h，按照轉染試劑說明書要求，將以上3種質粒分別轉染至HUVECs中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，加入10 μg/mL嘌呤霉素進行_{6sQQ26LA1K0cH66ynfgkDTh+0xWh2F+Sx7YY7msOMdI=}篩選。

1.3 qRT-PCR檢測miR-24及其他基因mRNA的表達

按TRLzol試劑說明提取HUVECs總RNA，然后使用miRNA反轉錄試劑盒合成互補DNA，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑（Qiagen）進行qPCR分析。miRNA和mRNA的表達以U6或GAPDH為內參，并采用2-△△Ct進行數(shù)據(jù)分析處理。本實驗中使用的引物序列見表2。

1.4 MTT法檢測HUVECs的活性

將HUVECs以5×103個/孔的密度接種到96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后向每個孔中加入MTT試劑10 L，繼續(xù)孵育4小時，然后除去上清液，再加入150 L DMSO，振蕩10 s，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀（Model-450）測定490 nm波長下的吸光度（A490nm），通過測試孔的吸光度減去空白孔的光密度表示細胞的存活/增殖。

1.5 劃痕試驗檢測HUVECs的遷移

將HUVECs以5×104個/孔的密度接種到24孔板上并孵育至融合（每組3次重復），隨后用槍頭垂直于培養(yǎng)板底部劃“一”字痕，PBS洗去被劃下的細胞，再加入無血清培養(yǎng)基，在劃痕后0和24小時的時間點對HUVECs進行拍照。計算公式為：細胞遷移率（%）=（A0-An）/A0×100，其中A0代表初始劃痕面積，An代表時間計量點處劃痕面積。

1.6 Caspase-3活性測定檢測HUVECs的凋亡

按照說明書上的步驟，將細胞裂解液與酶特異性底物（100 uM）在37 ℃下孵育4小時，然后使用酶標儀在405 nm處測量吸光度。

1.7 Hoechst 33258染色法檢測HUVECs的凋亡

將細胞以5×104個/孔的密度接種到12孔板中。培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后，用冷PBS沖洗細胞2次，然后用4%多聚甲醛溶液將貼壁細胞在4 ℃中固定10 min，隨后再次用冷PBS沖洗2遍，接著加入Hoechst 33258試劑（0.2 mM），并在室溫避光下培養(yǎng)10 min，應用熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化。細胞核固縮或碎裂成致密顆粒狀，呈亮藍色熒光的細胞為凋亡細胞。

1.8 透射電子顯微鏡法觀察各組HUVECs的自噬小體

將細胞漂洗后置于2.5%戊二醛溶液中，避光并置于4 ℃冰箱中固定過夜。次日用PBS漂洗3次后，鋨酸溶液固定2 h。重復用PBS溶液漂洗3次，丙酮梯度脫水，純樹脂滲透過夜，環(huán)氧樹脂包埋，烘箱聚合。超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，使用透射電子顯微鏡（H-7650）觀察并拍照。

1.9 western blot法檢測Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt的蛋白表達

將實驗細胞裂解取上清液，用BCA標準曲線蛋白定量，分別取各組30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電泳后轉移至PVDF膜上。封閉后加入一抗孵育置于4 ℃冰箱過夜，次日用TBST沖洗3次，然后加入熒光二抗孵育1 h后反復沖洗3次。用雙色熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶的灰度值，以β-actin為內參，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。實驗重復3次，取平均值。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組內兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗，實驗獨立重復三次。

2 結 果

2.1 miR-24在ox-LDL誘導的HUVECs中表達降低

為探討miR-24在ox-LDL誘導的HUVECs中表達的水平，本研究采用qRT-PCR檢測miR-24的表達。如圖1A和1B所示，miR-24在ox-LDL誘導的HUVECs中的表達呈時間和劑量依賴性下調，用100 g/mL的ox-LDL干預HUVECs 24 h后，miR-24表達水平下調約50%（P＜0.05），提示ox-LDL可明顯降低HUVECs中miR-24表達水平，miR-24的降低可能與ox-LDL誘導HUVECs損傷有關。

2.2 ox-LDL可誘導HUVECs自噬

為研究ox-LDL誘導HUVECs自噬的情況，本研究用100 g/mL的ox-LDL干預 HUVECs 6 h建立自噬模型。通過透射電鏡法觀察建模前后自噬小體生成情況，結果顯示與正常對照組比較，ox-LDL組中HUVECs的細胞質中含有更多具有雙膜結構的自噬小體和含細胞器的空泡型自噬溶酶體（圖2A）。此外，通過western blot和qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能顯著上調自噬標志基因Beclin-1的表達水平，并下調LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的水平（P＜0.05）。見圖2B和2C。以上結果表明，用100 g/mL的ox-LDL干預 HUVECs 6 h可誘導HUVECs自噬。

2.3 miR-24的過表達可抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬

為了研究miR-24對ox-LDL誘導自噬的調控作用，本研究構建高表達miR-24質粒、anti-miR-24質粒和miR-NC質粒，并分別轉染至經(jīng)ox-LDL誘導過的HUVECs中，采用qRT-PCR方法檢測轉染效率（圖3B），與陰性對照組（miR-NC）和ox-LDL組比較vvjB2cPuCvjd5Aes4kQAHg==，miR-24組中的miR-24表達水平顯著升高（P＜0.05），anti-miR-24組中的miR-24表達水平顯著降低（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組中的miR-24表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。此外，F(xiàn)AM熒光標記表明（圖3A），HUVECs中的質粒轉染率達90%以上。這些結果表明，高表達miR-24質粒、anti-miR-24質粒和miR-NC質粒均成功轉染至ox-LDL誘導的HUVECs中。通過western blot和qRT-PCR法檢測各組Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達水平，結果顯示（圖3C和3D）：與miR-NC組比較，miR-24高表達組的Beclin-1蛋白和mRNA表達水平顯著降低，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），anti-miR-24組的Beclin-1蛋白和mRNA表達水平顯著升高，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白和mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），提示miR-24可抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬。為了進一步證明miR-24對ox-LDL誘導的HUVECs自噬的調控作用，我們通過透射電鏡觀察各組自噬小體的生成情況（圖3E），與miR-NC組相比，miR-24高表達組細胞質中可見數(shù)個散在于細胞質中的雙層膜結構的自噬小體及內含細胞器的空泡狀自噬溶酶體，而anti-miR-24組細胞質中可見較多的自噬小體，進一步證明miR-24可抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬。

2.4 miR-24通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬

為了進一步探討miR-24抑制ox-LDL誘導HUVECs自噬的潛在機制，本研究采用western blot和qRT-PCR檢測與PI3K/Akt/mTOR通路相關的蛋白和mRNA的表達。結果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，ox-LDL明顯降低了磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白和mRNA的表達（P＜0.05），見圖4A和4B。與miR-NC組相比，miR-24高表達組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白和mRNA的表達顯著上調（P＜0.05），而anti-miR-24組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白和mRNA的表達顯著下調（P＜0.05），見圖4C和4D，提示過表達miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬。

2.5 miR-24可降低HUVECs活性和遷移能力并誘導HUVECs凋亡

本研究采用MTT檢測HUVECs增殖情況（圖5A），與正常對照組比較，ox-LDL組HUVECs增殖明顯受到抑制（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組比較無明顯變化（P>0.05）。與陰性對照組相比，miR-24高表達組的HUVECs增殖受到抑制（P＜0.05），anti-miR-24組的HUVECs增殖增加（P＜0.05）。本研究采用劃痕試驗進一步檢測miR-24對HUVECs遷移能力的影響（圖5C和5E），與正常對照組相比，ox-LDL組HUVECs遷移能力明顯受到抑制（P＜0.05），陰性對照組與ox-LDL組比較無明顯變化（P>0.05）。與陰性對照組相比，miR-24高表達組HUVECs的遷移能力受到抑制（P＜0.05），而anti-miR-24組細胞的遷移能力得到了提高（P＜0.05）。

為證實miR-24是否參與調控HUVECs的凋亡，本研究采用Caspase-3比色法和Hoechst 33258染色法檢測分析HUVECs凋亡的變化。Caspase-3比色法結果顯示（圖5B）：與正常對照組相比，ox-LDL組的Caspase-3活性明顯增加（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-24高表達組的Caspase-3的活性更強（P＜0.05），而anti-miR-24組的Caspase-3活性明顯降低（P＜0.05）。Hoechst 33258雙染色結果顯示（圖5D和5F）：正常對照組HUVECs的細胞核形態(tài)正常，結構清晰，呈彌散均勻的淺藍色熒光，未發(fā)生凋亡，而與正常對照組相比，ox-LDL組的HUVECs的細胞核固縮或碎裂成致密顆粒狀，呈亮藍色熒光，凋亡現(xiàn)象明顯（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-24過表達能顯著促進ox-LDL誘導的HUVECs凋亡（P＜0.05），而anti-miR-24能顯著減弱ox-LDL誘導的HUVECs凋亡（P＜0.05）。以上結果提示，miR-24的過表達能降低HUVECs的增殖和遷移能力并促進其凋亡，而下調miR-24水平則會增加HUVECs增殖和遷移能力并抑制其凋亡。

3 討 論

本項目通過研究miR-24調控HUVECs自噬的潛在分子機制，進一步探討miR-24通過調控自噬在AS中的潛在價值，主要有以下兩個發(fā)現(xiàn)：（1）過表達miR-24可明顯抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬并抑制HUVECs的增殖和遷移能力，進而發(fā)揮其在 AS 中的作用。（2）過表達miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路從而降低HUVECs自噬水平并促進其凋亡。

AS是導致血管疾病死亡的主要原因之一［11］。ox-LDL是一種促AS發(fā)展的關鍵因子，可誘導VECs損傷進而導致AS的發(fā)生［12］。AS的重要特征之一為VECs的凋亡，其機制為通過ox-LDL降低Caspase-3活性而促進VECs的凋亡［13］。本研究中，XUJ4Epn+iav3/j7vsNzXkg==我們通過ox-LDL誘導HUVECs模擬體外AS模型，發(fā)現(xiàn)ox-LDL能顯著降低HUVECs的活力，并增強Caspase-3的活性而促進HUVECs凋亡。還有其他研究表明，細胞的自噬在脂質代謝中發(fā)揮著重要的作用［14］，其異?？蓪е录毎x紊亂而加速AS的發(fā)生［15］。在自噬過程中，一種以細胞質形式的LC3（LC3-Ⅰ）會被偶聯(lián)形成LC3-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)物（LC3-Ⅱ）募集到自噬體膜中，而此過程中LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此可作為自噬體的標記蛋白［16］。Beclin-1是磷脂酰肌醇-3-激酶復合物的組成部分，參與自噬體的形成［17］，因此這兩種蛋白質可以被看作是自噬活性的標志。ZHANG等［18］揭示了ox-LDL通過LC3/beclin-1途徑激活HUVECs自噬。同樣，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，ox-LDL能上調自噬標志基因Beclin-1的表達水平，并下調LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的表達水平，進而誘發(fā)HUVECs自噬（圖2），這些結果表明ox-LDL通過LC3/Beclin1途徑激活HUVECs的自噬。

此外，近年來越來越多的研究［19-21］表明，miRNAs參與細胞自噬和凋亡的調節(jié)，并在AS的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路恢復自噬通量來緩解ox-LDL誘導的HUVECs損傷［22］。miR-106b則通過靶向PTEN并可能激活PI3K/AKT信號通路，抑制了AS中內皮細胞的凋亡［23］。以上研究提示，miRNAs在HUVECs自噬和凋亡過程中扮演著重要角色，并與AS的發(fā)生發(fā)展關系密切。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-24能夠顯著抑制HUVECs的增殖和遷移［10］，在本研究中，我們首先在HUVECs中轉染過表達miR-24的質粒，再用ox-LDL誘導HUVECs，通過MTT實驗和Hoechst 33258染色檢測發(fā)現(xiàn)，miR-24的過表達會增加ox-LDL誘導的HUVECs凋亡（圖5A、5D、5F）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-24過表達可增加Caspase-3活性（圖5B）并下調Beclin-1的蛋白表達，同時上調LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的蛋白表達（圖3C）。這些結果表明，miR-24能夠加劇ox-LDL誘導的HUVEC的損傷，而這與其調節(jié)HUVECs的自噬和凋亡有關。而在自噬信號通路中，PI3K/Akt/mTOR信號通路最具有代表性，它在細胞存活、增殖、凋亡和自噬等多種細胞功能中扮演著重要的角色［24-26］。LI等［27］研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路調節(jié)巨噬細胞自噬，促進巨噬細胞向M2表型的極化，可減少動脈粥樣硬化斑塊損傷，改善血脂代謝和炎癥水平。FENG等［28］報道可通過抑制PI3K來調節(jié)巨噬細胞中的AKT/mTOR和NF-κB信號通路的激活，減少炎癥及與之相關的淋巴管生成，從而對動脈粥樣硬化展現(xiàn)出全面的保護效果。這些研究表明PI3K/Akt/mTOR信號通路與細胞自噬和凋亡關系緊密。我們的研究結果顯示，miR-24能夠顯著促進p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達，這表明miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制ox-LDL誘導的HUVEC自噬并加劇細胞凋亡。

在本研究中，我們僅僅對miR-24在體外細胞實驗中的調控作用及機制進行了初步探索，對于如何更好地揭示miR-24、自噬和細胞凋亡之間的關系仍需通過動物實驗進行更深層次的驗證。

綜上所述，本研究結果表明了miR-24可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路以抑制ox-LDL誘導的自噬，并促進HUVECs凋亡，這可能加重血管內皮細胞損傷，促進AS的發(fā)生發(fā)展。但是它們之間是否存在靶向調控關系還需要進一步的實驗驗證，隨著進一步的體內驗證和傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化，外源性anti-miR-24有望成為治療AS的一種有前景的分子藥物。

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（收稿日期：2024-05-08 修回日期：2024-08-22）