摘要：[目的]本文擬探究烏汶伯克霍爾德氏菌P5和格氏假單胞菌RP22對杉木幼苗生長、基因表達和土壤性質的影響，初步揭示2種溶磷菌促杉木生長機制。[方法]以6個月苗齡的杉木實生苗為試驗材料，將配制好的P5、RP22及P5+ RP22菌劑通過根灌方式施加，每月施加一次，持續(xù)3個月。3個月后對幼苗和土壤進行取樣，測定幼苗的生長生理指標和土壤指標；基于Illumina HiSeq 4000測序平臺對幼苗進行轉錄組分析，并篩選杉木幼苗的促生基因。[結果]與對照組（CK）相比，3種菌劑處理均促進杉木幼苗的生長。3種菌劑對杉木幼苗的促生生理機制包括：PSB提高了杉木幼苗的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白等生理指標及磷含量；同時，增加了土壤有效磷、速效鉀、全磷養(yǎng)分含量。轉錄組結果表明，3種菌劑處理后杉木幼苗的差異表達基因（DEGs）均顯著富集在代謝物合成、苯丙烷生物合成、亞油酸代謝、Q亞麻酸代謝和光合作用通路。對這些通路的深入分析發(fā)現(xiàn)，PAL、COMT、4CL、LOX1_5、AOS、AOC等基因在P5菌劑處理組顯著上調(diào)；PAL、TOGT1、CYP73A、LOX15、psbS、psaF等基因在RP22菌劑處理組顯著上調(diào)；LOX1_5、psb0、petH、psaF等基因在P5+ RP22菌劑處理組顯著上調(diào)，表明3種PSB菌劑對杉木幼苗的促生機制是多個代謝通路相互協(xié)調(diào)的結果。[結論]3種菌劑能通過調(diào)控杉木幼苗的生理、提高土壤養(yǎng)分含量和上調(diào)表達苯丙烷生物合成、亞油酸代謝、光合作用等通路中的基因，從而促進杉木幼苗生長。

關鍵詞：杉木幼苗；溶磷菌；轉錄組；差異表達基因；促生機理

中圖分類號：S714.3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0033-13

磷是植物生長發(fā)育必須的營養(yǎng)元素之一，是構成酶、核酸和磷脂等生物分子的重要成分，還廣泛參與植物光合作用、細胞分裂和能量傳遞等生理代謝活動。植物獲取磷的途徑主要是從土壤吸收無機磷酸鹽，此外，植物還能直接吸收利用一些有機磷（甘油磷酸酯、蔗糖磷酸酯和植素等）。盡管土壤中的總磷儲量較高，但植物可直接吸收利用的磷含量較少。為解決植物生長中磷缺乏問題，通常是使用化學磷肥。然而，隨著化學磷肥的過度使用，遠遠超過了植物的吸收量，造成大量磷過剩并積累在土壤中，對土壤、水體和生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重危害。因此，開發(fā)一種綠色環(huán)保經(jīng)濟的方法來提高植物對磷的利用是非常重要的。

溶磷菌（phosphate-solubilizing bacteria，PSB）是一類能溶解土壤難溶性磷的細菌，同時還有促進植物生長和增強植物抗逆的功能。PSB有多樣的代謝能力，主要通過溶解不溶性無機磷或礦化有機磷來增強土壤中磷的生物有效性，從而滿足植物對磷元素的需求，促進植物生長發(fā)育。PSB的種類較多，目前已知的PSB集中在厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），在屬水平有假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮菌屬（Azotobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等。此外，研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）菌株有很強的促無機磷溶解能力，伯克霍爾德氏菌屬是一類重要的溶磷菌，且普遍發(fā)現(xiàn)于紅壤中。

杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.）Hook.）是我國南方主要的用材林樹種，主要分布在長江流域和秦嶺以南地區(qū)，該地區(qū)具有強烈的淋溶和脫硅富鋁化嚴重，造成大量的鐵鋁沉積，使得土壤中的磷極易被固定，從而有效磷含量較低，制約著杉木的生長發(fā)育。外施磷肥可以在短期內(nèi)解決杉木的磷缺乏，但杉木對磷肥的利用率依然較低，且投入成本過高，不利于可持續(xù)經(jīng)營。因此，發(fā)掘并分離出高效穩(wěn)定的PSB菌株是解決杉木磷限制的重要途經(jīng)，也對杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營具有重要意義。本研究以江西杉木產(chǎn)區(qū)篩選到的兩株PSB（烏汶伯克霍爾德菌P5和格氏假單胞菌RP22）為試驗菌株，評價它們對杉木幼苗生長、生理、基因表達和土壤理化性質的影響，進而初步揭示2種PSB對杉木幼苗的促生機理，為杉木溶磷菌劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗木為6個月苗齡的杉木實生苗，平均苗高9.92 cm，平均地徑1.61 cm。供試土壤的主要成分是泥炭土、黃土、谷殼、木屑和蛭石，且每立方米基質加入3 kg緩釋肥。實驗所需花盆規(guī)格是8.5 cm × 15 cm（寬x高），每個花盆加入1 kg土壤。

供試菌株為本實驗室從杉木人工林土壤中篩選得到的烏汶伯克霍爾德菌P5（Burkholderiaubonensis，專利號：CN202010569001.3）和從杉木根系篩選得到的格氏假單胞菌RP22（Pseu-domonasgrimontii，專利號：CN202010569008.5）.

1.2 試驗設計

2020年8月-2020年11月在江西省中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心樹木園進行，實驗設置如下分組：施加蒸餾水為對照組（CK），施加P5菌劑，施加RP22菌劑和施加P5+ RP22混合菌劑，每個處理各60株杉木幼苗。前期試驗表明菌劑稀釋倍數(shù)在90倍的促生效果較好，故本試驗中兩種菌劑均稀釋90倍后施加于杉木幼苗，將制備好的菌劑按照根灌的方式進行施加，即50 mL菌劑均勻緩慢的施人幼苗根部，對照組（CK）施加等量蒸餾水。試驗共施菌劑3次（2020年8、9、10月下旬），于2020年1 1月下旬對杉木幼苗和土壤進行取樣并測定。

1.3 指標測定

試驗結束后，用游標卡尺和直尺分別測量幼苗地徑和株高；從各處理隨機選取30株平均長勢的杉木幼苗，用清水洗凈并去除表面雜質，濾紙吸干水分，再將其于105℃殺青0.5 h，70℃烘干至質量恒定后測定幼苗生理指標及養(yǎng)分指標；取一部分杉木幼苗置-80℃，進行后續(xù)轉錄組測序。將30個花盆中的土壤倒出并混合均勻，收集1 kg土壤帶回實驗室風干和過篩，用于土壤性質測定。

幼苗指標測定：凱氏定氮法測定全氮，消解—電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）測定全磷和全鉀，丙酮-乙醇浸提法測定葉綠素含量，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，蒽酮比色法測定可溶性糖含量。

土壤指標測定：pH值采用玻璃電極法，堿解氮采用堿解擴散法，有效磷、速效鉀采用碳酸銨浸提一電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）法，全磷和全鉀采用消解-電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）法。

1.4 幼苗轉錄組測序分析

樣品委托北京奧維森科技公司完成杉木幼苗總RNA提取、文庫構建和上機測序。無參轉錄組測序分析如下：提取杉木幼苗葉部的總RNA，對提取的RNA樣品分別進行RNA純度和RNA片段長度檢測。檢測合格的樣品將其富集得到mRNA，隨后進行反轉錄和構建cDNA文庫，最后基于Illumina HiSeq 4 000平臺上機測序。

使用DEGSeq軟件篩選比較組間的差異表達基因（DEGs）并統(tǒng)計分析，設置篩選標準：Ilog2foldchangl＞1&qvalue＜0.005。對篩選到的DEGs使用Goseq軟件進行GO富集分析，并利用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進行富集分析，本研究重點分析促杉木生長的DEGs。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0對處理組和對照組的生長、生理生化指標和土壤養(yǎng)分指標進行方差分析，所有圖均用Origin2018表制作。

2 結果與分析

2.1 對杉木幼苗生長、生理的影響

由圖1可知，施加P5和RP22菌劑對杉木幼苗的促進效果不同。與CK相比，2種菌劑顯著影響杉木幼苗的地徑和株高，對照組（CK）的地徑增量是1.07 cm，P5處理的地徑增量是1.44 cm，RP22處理和P5+RP22處理的地徑增量分別為1.18 cm和1.23 cm；3種處理均提高了杉木幼苗的株高增量，表現(xiàn)為RP22處理＞P5處理＞P5+RP22處理＞CK。

由圖2可知，與CK相比，P5處理和P5+RP22處理的全氮和全鉀含量均顯著增加，P5處理分別增加12.69%和48.15%，P5+RP22處理分別增加23.44%和23.11%，而RP22處理下的全氮、全鉀含量與CK無顯著差異；3種處理在全磷含量上均是顯著促進作用，P5處理提高32.47%，RP22處理提高21 .29%，P5+RP22處理提高26.03%。3種處理的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均顯著高于CK，其中P5處理的效果最好，分別增加33.04%和47.68%；RP22處理分別增加32.14%和47.92%；P5+RP22處理分別增加20.55%和38.13%。葉綠素含量，與CK相比，P5+RP22處理的影響顯著，增加22.01%；RP22處理顯著增加13.33%，而P5處理無顯著差異。

2.2 對土壤性質的影響

由圖3可知，與CK相比，3種處理的有效磷和速效鉀含量均顯著增加，P5處理分別增加9.72%和6.14%，RP22處理分別增加20.46%和17.72%，P5+RP22處理分別增加11.76%和18.54%；堿解氮含量RP22處理和P5+RP22處理顯著增加，分別增加6.19%和7.51%；全鉀含量僅有P5+RP22處理顯著增加，增加了9.51%；而3種處理對土壤pH和全磷無顯著影響。

2.3 差異表達基因的GO和KEGG分析

分析處理組與對照組杉木幼苗的轉錄數(shù)據(jù)，篩選差異表達基因（DEGs）并進行GO及KEGG代謝途徑分析。P5 vs CK的DEGs是1 370個（上調(diào)754個／下調(diào)616個），RP22 vs CK的DEGs是623個（上調(diào)326個／下調(diào)297個），P5+RP22 vs CK的DEGs有732個（上調(diào)424個／下調(diào)308個）。

GO分析：由圖4A可知，P5 vs CK中顯著富集到分子功能的DEGs數(shù)量最多，其次是生物過程，最后為細胞成分。分子功能中富集最多的4個類別是催化活性、氧化還原酶活性、陽離子結合和金屬離子結合，生物過程中富集最多的4個類別是氧化還原過程、分解代謝過程、細胞分解代謝過程和小分子生物合成過程，細胞成分中富集到最多的類別是細胞外區(qū)。圖4B顯示，分子功能上，RP22 vs CK中顯著富集的4個類別是催化活性、氧化還原酶活性、四吡咯結合和血紅素結合；生物過程上，顯著富集的4個類別是細胞壁組織或生物形成、藥物分解代謝過程、外部封裝結構組織和細胞壁組織；細胞成分上，顯著富集的類別是細胞外區(qū)。P5+RP22vsCK的GO富集分析結果（圖4C）顯示，分子功能顯著富集的前6個類別是催化活性、氧化還原酶活性、陽離子結合、金屬離子結合、輔因子結合和四吡咯結合；

生物過程上，顯著富集的前6個類別是氧化還原過程、分解代謝過程、細胞分解代謝過程、藥物代謝過程、光合作用和藥物分解代謝過程；細胞成分中顯著富集的前4個類別是細胞外區(qū)、類囊體、光合膜和類囊體部分。

KEGG富集分析結果（圖5）顯示，施加P5菌劑后差異基因顯著富集（p＜0.05）在亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、次生代謝物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、二萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）、α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）；施加RP22菌劑后差異基因顯著富集（p＜0.05）在黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇的生物合成（Flavone and flavonolbiosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）、次生代謝物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）；施加P5+RP22菌劑后差異基因顯著富集（p＜0.05）在黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、次生代謝物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）.苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）.光合作用-天線蛋白（Photosynthesis - antennaproteins）、光合作用（Photosynthesis）、黃酮和黃酮醇的生物合成（Flavone and flavonolbiosynthesis）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylateand dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threoninemetabolism）。

2.4 促生相關代謝通路篩選及分析

在眾多顯著富集的通路中，次生代謝物生物合成、亞油酸代謝和苯丙烷生物合成是3個比較組中共同顯著富集的通路。此外，不同菌劑處理均有特異代謝通路。

由表1-3可知，在苯丙烷生物合成通路，P5vs CK組中PAL、COMT、4CL、HCT、CCR基因均顯著上調(diào)，RP22 vs CK組中PAL、TOGT1、CYP73A、E2.1.1.104、E1.11.1.7基因均顯著上調(diào)，P5+RP22vs CK組中E2.1.1.104、E3.2.1.21、E1 .11.1.7基因均顯著上調(diào)表達。在亞油酸代謝通路，LOX1 5基因在3個比較組中均顯著上調(diào)，此外P5+RP22 vs CK組中TGL4基因也顯著上調(diào)。在植物激素信號轉導通路，P5 vs CK組中SAUR、AUX1、PP2C、ABF、JAZ、MYC2基因均上調(diào)，RP22 vs CK組中ARR-B、PP2C、PR1基因均上調(diào)，P5+RP22 vs CK組中PP2C基因上調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)3個比較組均有獨特的代謝通路，P5 vs CK組中Q亞油酸代謝的AOS、AOC、OPR、OPCL1、AOCX1基因均顯著上調(diào)；RP22 vsCK組中光合作用的psbS、psaF基因上調(diào)，光合作用-天線蛋白的LHCB1基因上調(diào)；P5+RP22vsCK組中光合作用的psbO、psbQ、psbR、psbW、petE、petF、petH、psaF、psaG、psaN、psaO、atpG基因均是上調(diào)，光合作用-天線蛋白的LHCA2、LHCA3、LHCA4、LHCB1、LHCB4基因均是上調(diào)。

3 討論

3.1 3種PSB菌劑促杉木生長的生理生化機制

溶磷菌能促使土壤難溶性磷向可溶性磷轉化，通常也對植物生長起到促進作用。龐麗和錢婷研究發(fā)現(xiàn)接種PSB均顯著提高馬尾松和樟樹的苗高及地徑。本試驗結果與其一致，3種菌劑處理均顯著提高杉木幼苗株高和地徑，可能的原因是溶磷菌改善了杉木幼苗根系的微生態(tài)環(huán)境。

溶磷菌的一系列生命活動能改善土壤養(yǎng)分狀況，提高土壤養(yǎng)分及植株生長所需養(yǎng)分的供應量，進而促進植物生長。此外，溶磷菌也通過分泌有機酸、溶磷、固氮、釋放鉀等方式來促進植物生長。王同研究發(fā)現(xiàn)對花生接種PSB能hS+JxXgqTwYFC3y4Z8n+1A==顯著提高土壤有效磷含量，促進花生地下部生長發(fā)育及花生品質。本研究結果與其相似，與對照組相比，接種PSB提高了土壤有效磷含量，從而增加植物對磷的吸收；此外，接種PSB增加了土壤的全氮含量和速效鉀含量，進而促進杉木生長。

磷在植物生長代謝過程中起關鍵作用，王譽瑤的研究證明對玉米接種PSB會顯著提高玉米的全磷含量，并顯著促進玉米生長。本研究結果與其保持一致，3種菌劑處理均顯著提高杉木幼苗的全磷含量。本研究中3種菌劑處理均提高土壤養(yǎng)分含量的供應，改善杉木對養(yǎng)分的吸收，從而促其生長，這與對杉木養(yǎng)分含量的測定結果保持一致。

可溶性糖和可溶性蛋白含量能反映植物的代謝情況，葉綠素含量是衡量植物光合作用的主要表征指標。蕭利珠研究發(fā)現(xiàn)對山核桃幼苗接種PSB顯著增加了可溶性糖和可溶性蛋白含量，陳曉琳研究發(fā)現(xiàn)接種高效PSB顯著提高花櫚木苗木的葉綠素含量。本研究得到相似的結果，3種菌劑均顯著提高杉木幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量、葉綠素含量。可能的原因是接種PSB后，改善和提高杉木根系生長環(huán)境及對營養(yǎng)元素吸收，增加了葉綠素含量并提高植株的代謝，促使可溶性糖和可溶性蛋白在葉片中積累。

3.2 3種PSB菌劑促杉木生長的分子機制

本研究中，苯丙烷生物合成和亞油酸代謝通路是3種菌劑處理組均顯著富集到的通路。苯丙烷生物合成通路中會產(chǎn)生木質素、花青素、黃酮等次生代謝物，這些代謝物質對植物生長發(fā)育具有重要作用。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷生物合成的關鍵酶，其活性通常用來衡量植物的抗病能力，本研究發(fā)現(xiàn)編碼該酶的APL基因在P5處理組和RP22處理組上調(diào)表達。因此，推測P5菌株和RP22菌株通過促進苯丙氨酸解氨酶的合成，從而促進苯丙烷生物合成通路中次生代謝物的合成，增強了杉木幼苗的抗逆能力，進而促進了幼苗的生長。亞油酸代謝途徑中的代謝物能調(diào)控細胞膜的流動性和通透性，影響細胞膜蛋白的性質及膜上信號分子的活性，進而影響植物體內(nèi)的生理生化反應。本研究中，該通路關鍵酶的編碼基因LOX/ 5在3個處理組中均上調(diào)表達，故推測3種處理均通過影響亞油酸代謝，改變了細胞膜的流動性及通透性，間接促進了杉木幼苗的生長。相似的結果在小麥上得到證實，小麥接種Bacillus sp.wp-6后差異表達基因顯著富集在苯丙烷生物合成、亞油酸代謝、α亞油酸代謝和碳代謝通路。

茉莉酸是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)生長發(fā)育的一種植物激素，能提高植物抗逆性及對環(huán)境的適應。α-亞麻酸代謝是P5處理組的特異通路，且α-亞麻酸代謝與茉莉酸（JA）生物合成密切相關，該通路的AOS、AOC、OPR、OPCL1、AOCX1基因全是上調(diào)表達。表明P5菌劑還通過影響α-亞麻酸代謝，間接影響茉莉酸的生物合成，最終促進了幼苗生長。

光合作用是植物生長發(fā)育最重要的代謝途徑，楊雪研究發(fā)現(xiàn)接種解淀粉芽孢桿菌DGL1，燕麥的光系統(tǒng)1和11基因顯著上調(diào)表達。本研究得到相似結果，RP22 vs CK組中psbS、psaF、LHCB1基因上調(diào)，P5+RP22 vs CK組中psb0、psbW、petE、psaF、psaG、atpG、LHCA2、LHCA3、LHCB4等基因均上調(diào)表達。表明RP22菌劑促使光合作用相關基因上調(diào)表達，從而增強杉木幼苗的光合作用，最終促進幼苗生長。

2種菌劑及復合菌劑對杉木生長情況和杉木的基因表達存在差異，這可能是兩種菌株的生理特性、定殖能力和菌種間的互作特性所造成。3種菌劑處理除了共同影響的代謝通路，各自還有特異通路。P5菌劑會影響亞油酸代謝，而RP22和復合菌劑能夠使得光合作用相關基因上調(diào)表達，表明兩種菌劑對杉木促生機理存在差異，有待進一步研究。

4 結論

3種PSB菌劑均顯著促進杉木幼苗的生長，顯著提高杉木幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量及磷的吸收，同時顯著增加土壤有效養(yǎng)分（有效磷和速效鉀）。轉錄組分析表明促進杉木幼苗生長的代謝通路主要是次生代謝物生物合成、苯丙烷生物合成、植物激素信號轉導等通路，且促生基因為APL、LOX/5、psaF、LHCB1等基因。本研究結合生理生化指標和轉錄組數(shù)據(jù)，從生理生化和分子水平揭示3種PSB菌劑的促生機制，進而深入理解P5和RP22菌株促杉木幼苗生長的作用機制。

（責任編輯：張研）

基金項目：林業(yè)和草原科技成果國家級推廣項目“高效多功能菌劑在杉木大田育苗中的推廣應用”（2023133101）