摘要：[目的]本研究旨在解析對松枯梢病原菌Sphaeropsis sapinea具有強拮抗活性的生防菌株森吉木霉Trichoderma songyi M75的基因組基本信息。[方法]采用Illumina NovaSeq PE 150為依托的第二代測序技術(shù)對森吉木霉M75菌株進行基因組測序。[結(jié)果]M75菌株全基因組總長34 483 860 bp．GC含量49.50%，與木霉屬真菌特征相吻合。在GO數(shù)據(jù)庫中，森吉木霉M75共注釋了28 494個基因；在KEGG數(shù)據(jù)庫中有8192個基因富集在KEGG中的383條不同的在三級代謝通路中，主要集中表現(xiàn)在代謝途徑通路（848個）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（330個）、抗生素的生物合成（243個）、微生物代謝通路（240個）、氨基酸的生物合成（118個）、碳代謝通路（112個）等相關(guān)的代謝與次生代謝產(chǎn)物合成通路中；共有2 184個基因在KOG數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白功能注釋；在碳水化合物活性酶CAZy數(shù)據(jù)庫中，共注釋了259個糖苷水解酶GHs基因，105個糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，7個多糖裂解酶PLs基因，21個糖類脂解酶CEs基因，54個糖類結(jié)合組件CBMs基因。森吉木霉M75全基因組中共包含41個基因簇，451個基因，多數(shù)與次級代謝產(chǎn)物的合成相關(guān)。[結(jié)論]本研究首次獲得了生防真菌森吉木霉的基因組序列信息，為木霉的遺傳信息、抑菌機制及抑菌物質(zhì)的代謝通路等研究提供了數(shù)據(jù)支持和重要參考。

關(guān)鍵詞：森吉木霉；基因組；基因功能注釋；次級代謝

中圖分類號：S763.15 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0160-09

在我國，由C型松枯梢病原菌松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea （Fr.） Dyko＆B.Sutton）侵染松屬（PinUS）、冷杉屬（Abies）、落葉松屬（Larix）、雪松屬（Cedrus）、云杉屬（Picea）、刺柏屬（Juniperus）、崖柏屬（Thuja）和黃杉屬（Pseudotsuga）8個屬約60種針葉植物的嫩梢、針葉、芽和球果等多個部位引起的病害稱為松枯梢?。ㄓ置缮铱莶。Ｆ涞湫桶Y狀為松球殼孢菌侵染頂芽，導(dǎo)致頂芽受害，新梢萎蔫彎曲無法正常生長，新生的針葉顏色逐步變枯黃，發(fā)展成枯梢。松枯梢病已是目前世界范圍內(nèi)針葉樹上最常見和分布最廣的重要病害之一。

為了防治松枯梢病，現(xiàn)代營林措施高度依賴化學(xué)農(nóng)藥，通常大量使用殺菌劑和熏蒸劑，導(dǎo)致化學(xué)物質(zhì)在土壤中逐年富集，對環(huán)境產(chǎn)生巨大的負面影響，此外，化學(xué)藥劑的長期重復(fù)使用也會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。這促使人們尋求減少或消除使用農(nóng)藥的有害生物控制新策略，即將生防菌劑與低劑量的化學(xué)藥劑相結(jié)合使用，可有效控制植物病害且對環(huán)境危害較小。

已有眾多研究表明，木霉屬（Trichoderma）中豐富的真菌物種是可以用來當做生物防治劑開發(fā)的有益真菌種類，這種類群的真菌可以產(chǎn)生各種抗生素和拮抗作用酶等，同時可以通過誘導(dǎo)提高植物系統(tǒng)抗性以及對植物病原真菌的寄生作用來抑制病害的發(fā)生并降低危害，它們的代謝多樣性和強大的資源競爭力，使木霉屬中的很多有益真菌被開發(fā)制作為商業(yè)生物肥料和生物防控制劑。

2008年Martinez D等人首次對里氏木霉（Trichoderma reesei E.G. Simmons）展開基因組測序，里氏木霉由此成為第一個完成全基因組測序的木霉屬真菌，此后，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展以及測序成本的逐年降低，研究人員相繼公布了深綠木霉（Trichoderma atroviride P．Karst.）和綠木霉（Trichoderma virens（J．H．Mill．，Giddens& A.A. Foster） Arx）的基因組信息，哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）和蓋斯姆木霉（Trichoderma gamsii Samuels&Druzhin）也于2015和2016年相繼完成測序。此后，更多的木霉屬真菌相繼完成測序，獲得全基因組水平的基因信息，這標志著針對木霉屬的研究正逐漸進入全基因組時代，而關(guān)注木霉屬真菌基因表達層面的研究也為木霉基因功能的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

截至目前，森吉木霉（Trichoderma songyiM．S．Park， Seung Y．Oh＆Y．W．Lim）這一物種還未開展全基因組測序，為填補這一空白，獲得森吉木霉完整的基因序列，本研究以實驗室前期篩選獲得的1株對松球殼孢菌具有較強抑菌活性且抑菌譜廣泛的森吉木霉M75菌株作為研究對象，采用lllumina NovaSeq PE 150為依托的第二代測序技術(shù)對該菌株進行基因組測序，通過基因組組分分析，基因通用功能注釋與效應(yīng)因子注釋，深入研究森吉木霉菌株M75生防功能的內(nèi)在機制，闡述并推測森吉木霉具有高強度抑菌活性的可能原因，擴充生防木霉菌庫，為生防木霉的拮抗機理研究奠定基礎(chǔ)，同時為微生物防治松枯梢病及其他重要林木病害的技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用提供基因組水平上的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：森吉木霉M75由本實驗室分離篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CFCC54490。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體收集

用打孔器打取直徑5 mm的森吉木霉M75菌餅，接入裝有250 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28℃、180 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)96 h，得到森吉木霉M75的發(fā)酵液，收集30 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，4℃下10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，取沉淀，收集菌絲體。

1.2.2 文庫構(gòu)建及庫檢

采用SDS法提取森吉木霉M75菌株樣本基因組DNA，通過凝膠電泳檢測樣本DNA的純度，基于Qubit技術(shù)進行定量分析。選取質(zhì)量檢測合格的DNA，通過Covaris超聲儀將目的DNA打斷成長度約為350 bp的片段。處理完成后的DNA片段，按NEB試劑盒中的方法操作，進行末端修復(fù)、加PolyA尾、純化和擴增處理后，獲得所需文庫。建立好所需文庫后，通過Qubit 2.0熒光計（美國Invit-rogen公司）定量分析，先稀釋到2.0 ng·μL-1，檢測其插入片段，接頭引物長度符合預(yù)期后，為保證文庫質(zhì)量，通過Q-PCR對其有效濃度準確分析。

1.2.3 測序、組裝與組分分析

利用IlluminaNovaSeq PE 150，并按照有效濃度相關(guān)參數(shù)對不同文庫進行測序。使用readfq（v10.0）軟件對采集數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)部分過濾處理，過濾后得到的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。具體操作方法為：去除所含低質(zhì)量堿基中（Mass value在20以下）超過40%的reads，刪掉N堿基在10%及以上的reads，刪掉接頭引物序列重疊部分超過15 bp的reads，同時對可能來自于其他物種的信息進行過濾，除去重復(fù)樣本污染。得到清潔數(shù)據(jù)后，對所獲得的樣本基因組進行組裝，得到反映基因組基本情況的序列文件，并對組裝結(jié)果進行評價。具體處理流程如下：經(jīng)過預(yù)處理后得到Clean Data，使用SOAPdenovo（v2.04），SPAdes（v3.5.0）。ABySS（v1.4.8）組裝軟件進行組裝，使用CISA（http：//sb.nhri.org.tw/CISA/en/CISA）軟件進行整合；而為使組裝的序列更完整，需再次利用測序的雙末端數(shù)據(jù)配對關(guān)系鏈接contigs，同時基于相應(yīng)的覆蓋關(guān)系填充空隙。應(yīng)用Gapcloser（v1.1.2）軟件工具進行數(shù)據(jù)處理，過濾長度低于50 bp的片段。使用Tandem RepeatFinder（v4.04）軟件預(yù)測串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)單元長度及數(shù)目篩選出其中的微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列。具體測序和組裝過程由北京諾禾致源公司完成。

1.2.4 基本功能注釋

使用Diamond軟件（v0.9.10.111）針對編碼基因序列進行不同數(shù)據(jù)庫的功能注釋，包括GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、CAZy（Carbonhydrate-Active Enzymes Data-base）、KOG（Clusters of Orthologous Groupsfor Eukaryotic Complete Genomes）等功能基因數(shù)據(jù)庫。GO注釋采用InterPro（v66.0）軟件完成，KO及Pathway注釋使用KEGG的KAAS（v2.1）自動化注釋系統(tǒng)，KOG注釋使用egg-NOG-mapper（v4.5）完成。相關(guān)基因功能注釋時依據(jù)如下的流程進行：（1）將所預(yù)測基因的蛋白序列與各功能數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進行比較（evalue≤1e-5）；（2）將按默認值（identity≥40%，coverage≥40%）對比對結(jié)果進行過濾，對所獲得的各序列的比對結(jié)果，確定出其中分值最高的進行基因基本功能注釋。

1.2.5 效應(yīng)因子注釋

效應(yīng)因子注釋主要包括樣品全基因組中的分泌蛋白和次級代謝基因簇。在研究過程中通過SignaIP（v6.0）和TMHMM（v2.Oc）等軟件工具對其進行預(yù)測，檢測全基因組序列中是否含有信號肽等與分泌蛋白相關(guān)的生物信號或結(jié)構(gòu)，并對所分析的蛋白序列是否為分泌蛋白進行全面預(yù)測。采用antiSMASH程序（v6.1.1）對基因組進行次級代謝基因簇預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 組裝結(jié)果統(tǒng)計

森吉木霉M75全基因組總長度為34 483 860bp，大小約34.5 MB，GC平均含量（鳥嘌呤和胞嘧啶與全部堿基的摩爾百分比）為49.50%，共預(yù)測到9 315個編碼基因，編碼區(qū)的總長度為15 352 435 bp，約1.50 MB，占全基因組總長的44.52%．統(tǒng)計分析確定出其中編碼基因長度1 648 bp。散在重復(fù)序列共2 674個，總長度198 068 bp，在全基因組中占比0.57%；小衛(wèi)星DNA 2 768個，總長度118 514 bp，占比為0.3%；微衛(wèi)星DNA 388個，總長度16 186 bp，所占比例0.05%。詳見表1。

2.2 基本功能注釋

2.2.1 GO數(shù)據(jù)庫注釋

GO數(shù)據(jù)庫分析所得結(jié)果如圖1所示：分析此圖結(jié)果可知相應(yīng)的細胞組分共包括10類，其中細胞（cell）和細胞組分（cellpart）相關(guān)基因最多，分別注釋了2 511個。分子功能共包含12類，其中催化活性（catalyticactivity）相關(guān)基因最多，注釋了3 511個，其次為結(jié)合（binding）相關(guān)基因3 411個，相對較少的是伴金屬活性（metallochaperone activity）4個、電子載體活性（electron carrier activity）1個、通道調(diào)節(jié)劑活性（channel regulator activity）3個。生物過程共包含25類，基因注釋最多的功能為細胞過程（cellular process）3 527個、細胞代謝（metabotic process）3 560個，而節(jié)律過程（thythmic process）注釋1個、氮素利用（hitrogen utilization）注釋1個、細胞殺傷（cellkilling）注釋3個、生長（gro注釋wth）2個、免疫系統(tǒng)過程（immune system process）注釋2個，這些功能涉及到的基因較少。

2.2.2 KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫注釋

在森吉木霉M75的代謝通路中，基因覆蓋率最高的類型是新陳代謝（metabolism），在新陳代謝二級分類單元下，全球地圖概覽（gloabal and overviewmaps）基因最多，注釋了927個，碳水化合物代謝（ca巾ohydrate metabolism）319個，氨基酸、脂類和能量代謝（Amino acids，lipids，andenergy metabolism）共596個；其他二級分類單元下，運輸和分解代謝（transport and catabolism）277個，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）238個，翻譯（translation） 301個，折疊分類和降解（folding，sorting and degradation）221個（圖2）。根據(jù)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋中的富集分析可知（表2），在三級代謝通路中，森吉木霉M75全基因組中8 192個基因富集在KEGG中的383條不同的代謝通路中，其中，代謝途徑通路（metabolic pathways）共注釋848個基因、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（biosynthesis ofsecondary metabolites）注釋330個基因、微生物代謝通路（microbial metabolism in diverseenvironments）240個、碳代謝通路（carbonmetabolism）112個。

2.2.3 碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫注釋

森吉木霉M75菌株在CAZy數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果表明，在森吉木霉M75的全基因組序列中，有259個與碳水化合物相關(guān)聯(lián)的糖苷水解酶GHs基因，30個氧化還原酶AAs基因，105個糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，54個糖類結(jié)合組件CBMs基因，7個多糖裂解酶PLs基因，21個糖類脂解酶CEs基因（圖3）。

2.2.4 KOG數(shù)據(jù)庫注釋

如圖4所示，在森吉木霉M75全基因組中，共有2 184個基因在KOG數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白功能注釋，蛋白質(zhì)功能共分為24個類型，主要集中表現(xiàn)在一般通用功能預(yù)測（general function prediction only）241個、翻譯后的修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)及伴侶蛋白（posttranslational modification，protein turnover，chaperones） 211個、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成（translation，ribosomal structure andbiogenesis） 202個、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（energyproduction and conversion） 191個、氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝（amino acid transport and metabolism）171個。在防御機制（defense mechanisms）注釋8個、核結(jié)構(gòu)（nuclear structure）6個、細胞運動（cell motility）1個，功能注釋較少。

2.3 效應(yīng)因子注釋

2.3.1 分泌蛋白預(yù)測

測序結(jié)果顯示森吉木霉M75具有信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白個數(shù)為872個，具有跨膜結(jié)構(gòu)的1 798個，分泌蛋白703個。

2.3.2 次級代謝基因簇分析

預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計如圖5所示：森吉木霉M75全基因組中共包含41個基因簇，共451個基因。其中，TIPKS型基因簇13個，包含135個基因，N RPS-like型10個，包含127個基因，NRPS型基因簇6個，包含75個基因，萜烯類terpene基因簇8個，包含43個基因，NRPS，TIPKS型3個，包含48個基因，NRPS，NRPS-like，TIPKS型1個，包含23個基因。

3 討論

木霉屬真菌由于其對各種生態(tài)條件及生存環(huán)境的高度適應(yīng)性和寄生拮抗等功能，在當今農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中被廣泛用作商業(yè)生物殺菌劑。除此之外，木霉能成功作為生物防治劑還歸因于這些真菌能夠產(chǎn)生較多的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物如細胞壁水解酶可以破壞寄主植物細胞壁，這些次生代謝產(chǎn)物的合成與各種基因的調(diào)控息息相關(guān)，因此從基因組層面探究木霉的代謝途徑及生物功能，成為全面開發(fā)利用木霉屬真菌的必要手段。

本研究基于新一代測序技術(shù)對森吉木霉M75菌株完成了基因組測序，與哈茨木霉、綠木霉、深綠木霉等木霉屬中的近緣物種相比，他們的基因組大小較為接近，都約為35 MB左右。其中，森吉木霉M75在GO數(shù)據(jù)庫中獲得注釋的基因數(shù)目高達28 294個，遠高于哈茨木霉Th-33的6 238個，碳水化合物酶相關(guān)的糖苷水解酶基因259個，高于子囊菌綱中發(fā)現(xiàn)的GHs的平均數(shù)量211個；糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因105個，與里氏木霉的103個相差不大，略高于平均水平96個；糖類脂解酶CEs基因21個，也略高于平均水平16個，多糖裂解酶PLs基因7個，低于平均水平18個。在次級代謝基因簇中，森吉木霉M75具有8個萜烯類terpenes基因簇。Croteau等人在對萜烯類物質(zhì)進行研究時發(fā)現(xiàn)，萜烯是一大類具有高度多樣化功能的次生代謝產(chǎn)物，對植物病原菌具有一定的抵御能力。而TPS基因簇恰恰就是控制萜烯類物質(zhì)合成的次級代謝基因簇，這表明森吉木霉M75菌株強大的代謝合成能力可能與萜烯類基因簇的控制有關(guān)，這或許是生防菌株森吉木霉M75具有強抑菌活性的原因。本研究結(jié)果首次解析了森吉木霉全基因組信息，獲得了大量與次級代謝相關(guān)的功能基因，有助于全面了解木霉的生防機制，同時為更深層次進行木霉屬真菌的功能基因研究奠定理論基礎(chǔ)并提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

本研究獲得了森吉木霉M75的基因組序列，全基因組總長34 483 860 bp，GC含量49.50%，與木霉屬真菌特征相吻合。在GO數(shù)據(jù)庫共注釋了28 494個基因；在KEGG數(shù)據(jù)庫中，森吉木霉M75全基因組中8 192個基因富集在KEGG中的383條不同的在三級代謝通路中，主要集中表現(xiàn)在代謝途徑（848個）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（330個）、抗生素的生物合成（243個）、微生物代謝通路（240個）、氨基酸的生物合成（118個）、碳代謝通路（112個）等與代謝或代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的通路中；共有2 184個基因在KOG數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白功能注釋；在碳水化合物活性酶CAZy數(shù)據(jù)庫中，共注釋了259個糖苷水解酶GHs基因，105個糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，7個多糖裂解酶PLs基因，21個糖類脂解酶CEs基因，54個糖類結(jié)合組件CBMs基因；森吉木霉M75全基因組中共包含41個基因簇，451個基因，多數(shù)與次級代謝產(chǎn)物的合成相關(guān)，存在較大開發(fā)潛力。

（責(zé)任編輯：崔貝）

基金項目：北京市公園管理中心科技課題（ZX2024012）；國家重點研發(fā)計劃課題（2018YFC1200402）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31270682）