摘 要：本試驗(yàn)以鴨梨為試材，通過揭示鴨梨正常葉片和黃化葉片在活性鐵、全鐵、葉綠素、檸檬酸等物質(zhì)的含量、Fe3+還原酶活性以及FRO2和CS2基因相對(duì)表達(dá)量的差異，并采用嫁接鴨梨黃葉病枝條到杜梨砧木的方法觀察鴨梨葉片黃化發(fā)生情況，旨在為制訂有效的防治措施提供依據(jù)。結(jié)果表明：與正常葉片相比，黃化葉片的活性鐵含量明顯降低，全鐵含量無(wú)明顯差異，葉綠素含量明顯降低，F(xiàn)e3+還原酶活性、檸檬酸含量升高，F(xiàn)RO2、CS2基因相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，B、P元素含量均上升，Mn、Ca、K元素含量均下降；與嫁接正常枝條鴨梨苗相比，嫁接黃化枝條鴨梨苗葉色恢復(fù)正常，葉片活性鐵、葉綠素、檸檬酸含量和Fe3+還原酶活性無(wú)明顯變化，除Mn、Cu元素含量外，其它營(yíng)養(yǎng)元素?zé)o明顯變化。

關(guān)鍵詞：梨；缺鐵黃化；嫁接；防治

中圖分類號(hào)：S436.612.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.03.004

我國(guó)是世界上梨種植栽培面積最大，產(chǎn)量最多的國(guó)家[1]，而鴨梨是河北省梨的主要栽培品種，常用于出口[2]。由缺鐵引起的黃葉病是梨產(chǎn)區(qū)存在的重要生理病害之一，在生產(chǎn)上發(fā)生比較普遍[3]。黃葉病對(duì)梨樹的生長(zhǎng)發(fā)育和梨的果實(shí)品質(zhì)均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[4]。

為了能系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)梨黃葉病的發(fā)生機(jī)理及防治方法，加強(qiáng)梨缺鐵黃葉病的研究顯得尤為重要。本試驗(yàn)以鴨梨為試材，對(duì)鴨梨正常葉片和黃化葉片中的活性鐵、全鐵及其他營(yíng)養(yǎng)元素、葉綠素、檸檬酸等物質(zhì)含量，F(xiàn)e3+還原酶以及FRO2、CS2基因相對(duì)表達(dá)量的差異進(jìn)行分析，采用嫁接鴨梨黃葉病枝條的方法觀察其葉片黃化的發(fā)生情況，旨在為制訂有效的防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 田間試驗(yàn)：供試材料為六年生黃葉病鴨梨；嫁接試驗(yàn)：供試材料為嫁接鴨梨正常枝條和黃化枝條的嫁接苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 田間試驗(yàn)：選取具有黃化葉片和正常葉片的黃葉病鴨梨，5株為一小區(qū)，重復(fù)3次。每間隔30 d，從每株鴨梨新梢上部隨機(jī)采取各10片正常葉片和黃化葉片帶回實(shí)驗(yàn)室留存?zhèn)溆?；嫁接試?yàn)：分別將鴨梨正常枝條和黃化枝條嫁接到杜梨砧木上，常規(guī)管理，觀察葉片黃化發(fā)生情況。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法 黃化指數(shù)調(diào)查：參照徐連生[5]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)計(jì)算；葉綠素含量測(cè)定：參照蘇律[6]的方法；葉片F(xiàn)e3+還原酶活性測(cè)定：參照葉凌霄[7]的方法；檸檬酸含量測(cè)定：參照徐玉濤[8]的方法；活性鐵含量測(cè)定：參照Takkar[9] 的方法；全鐵及其它元素含量測(cè)定：參照司躍騰[7]的方法；實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)TIANGEN的RNAprep Pure Plant Kit使用說明書提取RNA，根據(jù)TIANGEN的FastQuant RT Kit（with gDNA）的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以持家基因 -actin作為內(nèi)參基因，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平上鐵吸收轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平，根據(jù)已獲得的鐵吸收代謝基因序列，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，實(shí)施熒光定量PCR在Mastercycler ep realplex4實(shí)施熒光定量PCR儀（Eppendorf，Germany）上進(jìn)行，熒光染料使用TRAN公司的TransStart Top Green qPCR SuperMix，計(jì)算方法為 Ct法，熒光定量引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃化葉片與正常葉片的對(duì)比分析

2.1.1 活性鐵和全鐵含量 由表2可以看出，5-9月，鴨梨正常葉片中活性鐵含量均高于黃化葉片，說明葉片活性鐵含量可能是影響葉片黃化的一個(gè)重要因素。此外，黃化葉片和正常葉片的全鐵含量均明顯高于活性鐵含量，全鐵含量無(wú)明顯差異。

2.1.2 葉綠素含量 如表3所示，5-9月，正常葉片葉綠素含量分別是黃化葉片的2.27、1.67、1.84、1.71、1.60倍，在每個(gè)時(shí)期黃化葉片的葉綠素含量均明顯低于正常葉片，與葉片黃化癥狀相符。

2.1.3 Fe3+還原酶活性 如圖1所示，5月和8月，黃化葉片的Fe3+還原酶活性明顯高于正常葉片，分別是正常葉片的1.37、2.00倍。而6月、7月、9月，黃化葉片的Fe3+還原酶活性低于正常葉片。

2.1.4 檸檬酸含量 如表4所示，5-8月，黃化葉片的檸檬酸含量高于正常葉片，黃化葉片的檸檬酸含量分別是正常葉片的1.03、1.42、1.21、1.13倍。

2.1.5 其他營(yíng)養(yǎng)元素含量 如圖2所示，微量元素方面，整個(gè)生長(zhǎng)期正常葉片Mn含量明顯高于黃化葉片，生長(zhǎng)前期正常葉片Cu含量低于黃化葉片，生長(zhǎng)后期差異不明顯；整個(gè)生長(zhǎng)期正常葉片B含量明顯低于黃化葉片；生長(zhǎng)前期正常葉片Zn含量低于黃化葉片，生長(zhǎng)后期正常葉片Zn含量明顯高于黃化葉片。中量元素方面，整個(gè)生長(zhǎng)期正常葉片Ca含量明顯高于黃化葉片；除了8月，Mg含量無(wú)明顯差異。大量元素方面，整個(gè)生長(zhǎng)期正常葉片K含量明顯高于黃化葉片，P元素含量低于黃化葉片。

2.1.5 FRO2和CS2基因相對(duì)表達(dá)量 由圖3-A可知，與正常葉片相比，黃化葉片F(xiàn)RO2基因相對(duì)表達(dá)量在每個(gè)時(shí)期均明顯上調(diào)，分別是正常葉片的3.89、1.93、1.72、2.40、2.33倍；由圖3-B所示，正常葉片和黃化葉片CS2基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似，均是先降低再升高，黃化葉片的CS2基因相對(duì)表達(dá)量一直明顯高于正常葉片。

2.2 枝條嫁接對(duì)葉片黃化發(fā)生情況的影響

2.2.1 葉片黃化情況 如圖4所示，在前3周，嫁接黃化枝條鴨梨苗的黃化指數(shù)略低于嫁接正常枝條鴨梨苗，自3周開始，嫁接黃化枝條鴨梨苗的黃化指數(shù)略微上升，在整個(gè)處理期間，嫁接黃化枝條鴨梨苗與嫁接正常枝條鴨梨苗黃化指數(shù)無(wú)明顯差異。

2.2.2 活性鐵和全鐵含量 如表5所示，嫁接正常枝條和黃化枝條鴨梨苗葉片活性鐵含量差0.51 mg/kg，活性鐵含量差異不明顯；與嫁接正常枝條的鴨梨苗葉片相比，嫁接黃化枝條的鴨梨苗葉片全鐵含量明顯下降，下降幅度為40.87%。

2.2.3 葉綠素含量 如圖5所示，在第0至第5周，嫁接正常枝條和黃化枝條鴨梨苗葉片葉綠素含量分別相差0.21、0.12、0.04、0.29、0.36、0.50 mg/dm2，差值較小，葉綠素含量無(wú)明顯差異。

2.2.4 Fe3+還原酶活性和檸檬酸含量 嫁接正常枝條和黃化枝條的鴨梨葉片F(xiàn)e3+還原酶活性分別為0.36和0.32 mol/g/h，兩處理間差值較小，無(wú)明顯差異；檸檬酸含量分別為609.10和651.00 g/g€稦W，與嫁接正常枝條的鴨梨苗葉片相比，嫁接黃化枝條的鴨梨苗葉片檸檬酸含量上升，上升幅度幅度較小，約為6.87%。

2.2.5 營(yíng)養(yǎng)元素含量 如表6所示，與嫁接正常枝條鴨梨苗葉片相比，在微量元素方面，嫁接黃化枝條鴨梨苗葉片的Mn、Cu元素含量明顯上升，上升幅度分別為21.73%和29.74%，B、Zn元素含量上升，上升幅度分別為4.50%和8.26%，上升幅度較??；中量元素方面，兩處理Ca、Mg元素含量之間的差值分別為0.33、0.07 g/kg，差異較小；在大量元素方面，K、N元素含量下降，下降幅度分別為7.16%、12.73%，P元素含量上升，上升幅度為17.24%。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)鴨梨正常葉片和黃化葉片對(duì)比分析和嫁接反應(yīng)試驗(yàn)的研究，結(jié)果表明：1）鴨梨黃化葉片中活性鐵含量明顯低于正常葉片，說明葉片活性鐵含量可能是影響葉片黃化的一個(gè)重要因素；2）陳棟等研究表明，礦質(zhì)元素能影響植物對(duì)鐵的吸收，但各元素的作用不同[10]。本試驗(yàn)中，在整個(gè)生長(zhǎng)期，正常葉片的Mn、Ca、K元素含量都高于黃化葉片，B、P元素含量低于黃化葉片，說明鴨梨缺鐵黃化可能與Mn、Ca、K元素含量過低和B、P元素含量過高有關(guān)系；3）黃化葉片的Fe3+還原酶活性明顯高于正常葉片，且FRO2基因相對(duì)表達(dá)量高于正常葉片，黃化葉片檸檬酸含量明顯高于正常葉片，且CS2的基因表達(dá)量高于正常葉片，說明葉片黃化程度增加，F(xiàn)RO2基因表達(dá)量增加引起Fe3+還原酶活性的增加，CS2基因表達(dá)量的增加引起檸檬酸含量的增加，葉片吸收鐵和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力增強(qiáng)；4）采取將鴨梨黃化枝條嫁接到杜梨砧木上的手段能使鴨梨黃化枝條復(fù)綠。

綜上所述，鴨梨黃化葉片和正常葉片內(nèi)的活性鐵及其它營(yíng)養(yǎng)元素含量、Fe3+還原酶活性、檸檬酸含量以及鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量有明顯的差異，這些生理生化指標(biāo)的變化可以為制訂缺鐵黃葉病有效防治措施提供一定的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐鈺清，田路明，曹玉芬，等．7個(gè)梨品種不同熟期果肉質(zhì)地評(píng)價(jià)分析[J]．果樹學(xué)報(bào)，2023，40（10）：2 112-2 123．

[2] 賈 兵，郭國(guó)凌，，王友煜，等．‘黃金梨’缺鐵黃化葉片受GA3誘導(dǎo)復(fù)綠的機(jī)理研究[J]．園藝學(xué)報(bào)，2021，48（2）：254-264．

[3] 王金珠，王子?xùn)|，劉建龍，等．不同生態(tài)型杜梨對(duì)缺鐵脅迫的生理響應(yīng)及耐缺鐵性評(píng)價(jià)[J]．果樹學(xué)報(bào)，2023，40（2）：262-273．

[4] 郭獻(xiàn)平，郭 鵬，王東升，等．Fe-EDDHA矯治梨缺鐵黃化病應(yīng)用效果研究[J]．中國(guó)果樹，2022（10）：7-12+18.

[5] 徐連生，王 磊，王 然，等．小金海棠實(shí)生后代耐缺鐵性狀分離分析[J]．果樹學(xué)報(bào)，2012，29（5）：770-775，961.

[6] 蘇 律，宋俊霞，胡同樂，等．鐵肥不同施用方式對(duì)蘋果缺鐵黃化病的矯正效果[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）： 188-189．

[7] 葉凌霄． 植物缺鐵誘導(dǎo)乙烯合成機(jī)理及水稻鐵還原酶OsFRO1功能研究[D]．杭州：浙江大學(xué)，2016．

[8] Takkar P N，Kaur N P．HCL method for Fe-estimation to resolve iron chlorosis in plants[J]．Journal of Plant Nutrition，1984，7（1）： 81-90．

[9] 杜玉霞，李 晶，寸待澤，等．低鎂脅迫對(duì)不同檸檬品種植株礦質(zhì)養(yǎng)分含量以及果實(shí)產(chǎn)量、品質(zhì)的影響[J]．果樹學(xué)報(bào)，2021，38（8）：1 330-1 339．

[10] 陳 棟，涂美艷，李 靖，等．不同黃化程度桃葉片生理指標(biāo)及礦質(zhì)養(yǎng)分含量差異研究[J]．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（4）：1 522-1 526．