摘要：為探究地下害蟲咬食影響煙草黑脛病的發(fā)病機(jī)制，選擇機(jī)械損傷為陽性對(duì)照，研究無損傷（CK）、機(jī)械損傷（T1）和害蟲咬食（T2）對(duì)煙草不同部位酶活性和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的影響，從根損傷影響根系分泌物的代謝組學(xué)和疫霉菌的化感作用角度來解析蟲害加重病害發(fā)生的作用機(jī)制。結(jié)果表明：（1）與CK相比，T1組地上部和地下部的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，T2組地上部酶活性提高，而地下部SOD活性顯著下降；（2）T1、T2組誘導(dǎo)煙草地下部次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)生顯著變化，降低有機(jī)酸、可溶性糖含量，提高丙二醛、多酚含量；（3）代謝組學(xué)分析共發(fā)現(xiàn)293種差異代謝物，T1、T2與CK組比較后差異代謝物總數(shù)、上調(diào)數(shù)和下調(diào)數(shù)排序?yàn)門2（271、235、36）>T1（30、24、6）。（4）T2組根系分泌物濃度為50、150 μg/mL對(duì)疫霉菌趨化移動(dòng)指數(shù)（CMI）的影響呈顯著正趨化作用，且各處理對(duì)煙草疫霉菌游動(dòng)孢子萌發(fā)率的相對(duì)促進(jìn)率分別為8.13%、44.13%、45.20%。綜上所述，蟲害可通過影響煙草防御性酶活性、改變次級(jí)代謝產(chǎn)物含量、誘導(dǎo)根系分泌物對(duì)疫霉的化感作用等方式加重病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞：黑脛病；小地老虎；根系分泌物；化感作用

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）17-0108-07

收稿日期：2023-10-23

基金項(xiàng)目：廣西中煙有限公司橫向科技項(xiàng)目（編號(hào)：2023370200240167）。

作者簡(jiǎn)介：李 振（1999—），男，山東濟(jì)南人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：lzz15953171758@163.com。

通信作者：時(shí) 軍，碩士，高級(jí)政工師，主要從事煙葉生產(chǎn)方面的研究。E-mail：619045869@qq.com。

蟲害與病害的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)［1-2］。煙草生長(zhǎng)過程中，害蟲的咬食是導(dǎo)致煙草病害發(fā)生的主要原因之一。盡管煙草會(huì)通過改變某些途徑來抵御這些損害帶來的負(fù)面影響，但害蟲咬食導(dǎo)致細(xì)胞壁受損，內(nèi)容物外流，增大了病原菌侵染的機(jī)會(huì)。同時(shí)，內(nèi)容物的外流還為病原菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖［3-5］。此外，植物會(huì)誘導(dǎo)化感物質(zhì)來直接抵御或增強(qiáng)病原菌的侵染，已知的一些氣味物質(zhì)如β-丁烷、1-辛醇等，可以激活植物本身的免疫反應(yīng)，有助于植物抵御病原菌的入侵［6-7］。相反，煙草根系分泌物中對(duì)土傳類病原菌具有正趨化作用的肉桂酸、苯甲酸等有機(jī)酸類自毒物質(zhì)，使植物根系活性降低、養(yǎng)分吸收減少，增加了植物受病原菌侵染的易感性［5，8］。

蟲害加重病害發(fā)生不是單一因素決定，而是涉及多種因素的復(fù)雜過程［9-11］。目前關(guān)于蟲害加重?zé)煵莞o病害發(fā)生的研究仍局限于傷口損傷產(chǎn)生的影響上，本研究為了進(jìn)一步探討蟲害對(duì)煙草根莖病害加重的相關(guān)機(jī)制，以地下害蟲小地老虎咬食后的煙草根系分泌物作為研究對(duì)象，解析煙草-地下害蟲-病原菌三者生物相互作用關(guān)系，對(duì)病蟲害的防治具有理論指導(dǎo)意義。

本研究通過將機(jī)械損傷作為害蟲咬食的傷口對(duì)照，通過試驗(yàn)驗(yàn)證以下假設(shè)：相較于機(jī)械損傷，地下害蟲的咬食會(huì)對(duì)煙草的酶活性產(chǎn)生改變；同時(shí)，它也會(huì)誘導(dǎo)根系分泌物的改變，形成適宜疫霉菌生長(zhǎng)繁殖的微環(huán)境，從而大大增加疫霉菌侵染煙草的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌菌株為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）JM01，供試?yán)ハx為小地老虎，供試煙草品種為煙草黑脛病易感品種小黃金1025，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。燕麥培養(yǎng)基（OA）用于煙草疫霉培養(yǎng)。小地老虎飼料的制作與存儲(chǔ)：用玉米麩、大豆粉、酵母粉、瓊脂及復(fù)合維生素微波加熱后冷卻凝固4 ℃保存。

1.2 煙草樣品處理及根系分泌物收集

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院煙草研究所開展的盆栽試驗(yàn)中，參照煙草水培法育苗［12-13］。試驗(yàn)在3月份開始育苗，經(jīng)過7 d后進(jìn)行假植，15 d后將煙苗移栽至水培裝置中進(jìn)一步培養(yǎng)，15 d左右進(jìn)行后續(xù)處理。試驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組（CK）、機(jī)械損傷處理組（T1，根部損傷一半）以及小地老虎咬食處理組（T2，持續(xù)咬食48 h），并在處理前用滅菌水清洗根部。處理期間使用滅菌水代替霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，并每天補(bǔ)充至50 mL。在機(jī)械損傷后48 h取樣，將小地老虎提前饑餓處理12 h后放入煙草裸露的根部旁，待 48 h 后取樣。根系分泌物的收集參照張成省的方法［14］略作修改，待煙草處理結(jié)束后收集液體，將收集到的浸提液過0.22 μm微孔濾膜，-80 ℃冷凍再抽真空。

1.3 酶活性及代謝物測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定，以 25 ℃ 時(shí)抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)消耗酶量定義為1個(gè)酶活性單位；采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性，以1 min D240 nm值減少0.01為1個(gè)酶活性單位［U/（g·min）］；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性，以1 min D470 nm的變化值表示酶活性大?。踀/（g·min）］；苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定參照植物L(fēng)-苯丙氨酸解氨酶（PAL）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書［15-19］。蛋白質(zhì)、多糖等代謝物含量的測(cè)定參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［20］。

1.4 根系分泌物代謝組學(xué)

將收集到的不同處理下的根系分泌物進(jìn)行冷凍干燥后，基于液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)［21-22］進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，試驗(yàn)流程主要包括：樣本的代謝物提取、LC-MS檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析等。由北京諾禾致源科技股份有限公司采用LC-MS技術(shù)，完成非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析。

1.5 化感作用

參照徐周洋的化學(xué)趨向性響應(yīng)方法［23］，通過使用0.2%二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解冷凍干燥后的根系分泌液，制備了50、100、500 μg/mL的分泌液濃度梯度。在燕麥培養(yǎng)基上等距離打孔（直徑為5 mm），按照添加物依次為對(duì)照品A（30 μL 2% DMSO）、疫霉菌B、趨化液C（溶于2% DMSO的根系分泌物30 μL）。每2孔之間用無菌濾紙條（長(zhǎng)25 mm、寬2.5 mm）連接。在黑暗條件下，保持在28 ℃下培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。菌絲邊緣從B處移動(dòng)到A的距離記作a，將菌絲邊緣從B處移動(dòng)到C孔的距離記作b。利用趨化性指數(shù)（CMI）=b/a來衡量化學(xué)趨向性，當(dāng)CMI-1>0時(shí)，表示測(cè)得的趨化液對(duì)疫霉菌具有正的化學(xué)趨向性。

1.6 孢子萌發(fā)試驗(yàn)

參照張成省的孢子萌發(fā)試驗(yàn)方法［14］，取 0.5 mL 濃度分別為5、50、150 μg/mL的根系分泌物溶液與等體積疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液（106 CFU/mL）。充分混勻后，用移液槍滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，28 ℃保濕培養(yǎng)10 h。用超景深顯微鏡觀察載玻片下孢子的萌發(fā)情況，并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將質(zhì)譜檢測(cè)得到的根系分泌物通過Compound Discoverer 3.1，得到代謝物的定性定量結(jié)果。對(duì)代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和代謝富集通路。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan’s新復(fù)極差法，α=0.05），并采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根損傷對(duì)煙草不同部位防御性酶活性的影響

由圖1可知，T1和T2處理組中煙草不同部位酶活性響應(yīng)不同，與對(duì)照相比，T1組地上部和地下部中與防御相關(guān)的酶活性均顯著升高，T2組地上部CAT、POD活性顯著升高，SOD活性無顯著變化，而地下部中SOD活性顯著降低，害蟲咬食降低了煙草地下部防御性酶活性，而誘導(dǎo)了地上部酶活性。

2.2 不同根損傷對(duì)煙草不同部位PAL酶活性及代謝產(chǎn)物的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物苯丙烷次生代謝中重要的限速酶類，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝物合成等方面具有重大作用［24］。由圖2可知，T1和T2組都誘導(dǎo)了煙草中PAL活性的增加，且T2組酶活性增加程度高于T1。

圖3為根損傷對(duì)煙草次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，其中地上部有機(jī)酸、可溶性糖、多酚含量在T1、T2和CK組之間均沒有顯著差異，而丙二醛含量在T2組中顯著增加。T1、T2組地下部有機(jī)酸、可溶性糖含量顯著低于CK組，T1組下降幅度更大（圖3-a、圖 3-b）；T2組地下部多酚含量顯著高于CK和T1組（圖3-d）；T1、T2組地下部丙二醛酚含量顯著高于CK組，T2組含量上升幅度更大（圖3-c）。

2.3 不同根損傷下煙草根系分泌物的代謝組學(xué)分析

2.3.1 PCA與OPLS-DA

通過PCA分析不同處理方式下的代謝物樣品發(fā)現(xiàn)，PC1和PC2對(duì)方差的貢獻(xiàn)分別為36.94%和16.97%（圖4）。具體來說，PC1（36.94%）可以有效區(qū)分T2樣品與其他處理方式的差異，而CK和T1之間的差異并不顯著。此外，質(zhì)控樣品（QC）呈現(xiàn)出緊密聚集的趨勢(shì)，這表明數(shù)據(jù)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

另外，通過OPLS-DA分析結(jié)果，將組間差異最大化反映在PC1上可以直接區(qū)分各處理之間的差異。如圖5所示，在T1、T2和CK之間分別進(jìn)行OPLS-DA分析時(shí)，CK與T1比較中，可以看到它們沿著第1主成分進(jìn)行分離，解釋了總變異的24.25%、21.53%；CK與T2比較中，也沿著第1主成分進(jìn)行分離，解釋了總變異的46.19%、17.56%；T1與T2比較中，它們沿著第1主成分進(jìn)行分離，解釋了總變異dT+QBCe79nXYhiBWu35QMg==的41.52%、16.45%；綜上可知，T1、T2和CK之間的代謝物組分存在差異，T2與對(duì)照（CK）之間組分差異顯著。

2.3.2 差異代謝物分析

使用HMDB、Lipidmaps（v2.3）、METLIN數(shù)據(jù)庫等匹配已獲取的代謝物名稱，比較不同處理對(duì)煙草根系分泌物組分的影響，對(duì)T1、T2組中差異代謝物總數(shù)、上調(diào)數(shù)和下調(diào)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖6結(jié)果顯示，T1、T2組與對(duì)照組比較差異代謝物的總數(shù)、上調(diào)和下調(diào)數(shù)排序?yàn)門2（271、235、36）>T1（30、24、6）。

將T1、T2與對(duì)照比較后，對(duì)VIP>1的代謝物進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，共發(fā)現(xiàn)293種差異代謝物。如圖7所示，主要包括生物堿和其衍生物（2.66%）、苯丙環(huán)化物（5.32%）、木質(zhì)素、新木質(zhì)素及相關(guān)化合物（1.66%）、脂類和類脂類分子（21.26%）、有機(jī)酸和其衍生物（6.64%）、有機(jī)氧化合物（4.32%）、有機(jī)雜環(huán)化合物（12.29%）、苯丙素和多酮類化合物（13.62%）、有機(jī)氮化合物（1.00%）、核苷、核苷酸和類似物（2.33%）及未分類的物質(zhì)（28.90%）。其中有機(jī)氮化合物和核苷酸類化合物在T1組中未檢測(cè)到與該分類相關(guān)的代謝物，這些結(jié)果表明，T2組誘導(dǎo)產(chǎn)生的差異代謝物遠(yuǎn)高于T1組，該影響主要集中在脂類分子，其次是有機(jī)酸、多酚類以及有機(jī)雜環(huán)化合物。

將VIP值排前28名的具體差異代謝物進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。由表1可知，在與對(duì)照組相比后得到的不同處理組差異代謝物中，T1上調(diào)松柏苷、馬鞭草苷、5′-磷酸吡哆醛一水合物、N1-［3，5-二（三氟甲基）苯基］-2-環(huán)戊基-2-苯乙酰胺等10種物質(zhì)，下調(diào)尼古丁、紫丁香苷、原百部堿等5種物質(zhì)。與此類似，T2也展現(xiàn)出了更多不同的差異代謝物。T2上調(diào)了α-萘醌、穿心蓮內(nèi)酯等11種物質(zhì)，下調(diào)了丙酰肉堿、芽子堿甲酯。

2.3.3 KEGG通路富集

根據(jù)KEGG通路富集分析（圖8），結(jié)果顯示T1、T2、CK組間比較，圖8共注釋到P<0.05的誘導(dǎo)煙草根系分泌物變化的代謝途徑。與CK相比，T1共注釋到3條代謝途徑，分別為花生四烯酸代謝、生物堿合成、苯丙素類生物合成途徑（圖8-a）；與CK相比，T2注釋到的代謝通路共20條，涵蓋吲哚生物堿合成、色氨酸代謝、生物堿合成、苯丙酮類合成、類黃酮類合成等相關(guān)的代謝通路（圖8-b）；與T1相比，T2注釋到的代謝通路最多，共22條，其中有20條代謝通路呈顯著富集，包括花生四烯酸代謝、色氨酸代謝、生物堿合成、酪氨酸代謝等相關(guān)的代謝通路（圖8-c）。

2.4 不同根損傷后的根系分泌物對(duì)疫霉菌趨化性的影響

趨化試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，低、中和高濃度下CK和T1組無顯著差異，未表現(xiàn)出正趨化性，而T2組中、高濃度下的趨化指數(shù)均顯著高于CK、T1，表現(xiàn)出正趨化性，并且對(duì)疫霉菌的正趨化作用隨濃度升高而增大。

2.5 不同根損傷后的根系分泌物對(duì)孢子萌發(fā)影響

如圖9所示，試驗(yàn)設(shè)CK、T1和T2各3個(gè)濃度（5、50、150 μg/mL），結(jié)果表明T2處理組在5、50、150 μg/mL 促進(jìn)孢子萌發(fā)率顯著增加。以相應(yīng)濃度CK組的孢子萌發(fā)率作為基線值，比較不同處理組的孢子萌發(fā)率與基線值的差異，發(fā)現(xiàn)T1組隨著濃度的升高孢子萌發(fā)率分別提高了3.30%、5.37%、14.17%；T2組隨著濃度的升高孢子萌發(fā)率分別上升了8.13%、44.13%、45.20%。與CK相比，T2組表現(xiàn)出了顯著的促進(jìn)萌發(fā)作用。

3 討論

自然界中，植物、害蟲和病原菌之間構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)［25］。害蟲和病原菌會(huì)對(duì)煙草的生長(zhǎng)和發(fā)育造成危害，害蟲咬食煙草組織，并從中吸取營(yíng)養(yǎng)或分泌毒素，導(dǎo)致煙草受到更嚴(yán)重的損傷。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，害蟲活動(dòng)會(huì)促使植物產(chǎn)生一些次生代謝物質(zhì)，而這些物質(zhì)對(duì)微生物具有一定的化感作用，可進(jìn)一步影響土壤微生物群落行為［26］。

本研究中，筆者所在課題組觀察到長(zhǎng)期小地老虎取食會(huì)改變煙草根部的防御酶活性，誘導(dǎo)煙草代謝物含量變化，為疫霉菌侵害的發(fā)生創(chuàng)造更有利的環(huán)境。與高佳敏等研究結(jié)果［27］相似，發(fā)現(xiàn)取食處理對(duì)誘導(dǎo)植物生理代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化效果更加顯著。本研究發(fā)現(xiàn)小地老虎的取食會(huì)誘導(dǎo)煙草根部苯丙氨酸解氨酶的高表達(dá)，并調(diào)節(jié)煙草根部的次生代謝產(chǎn)物水平。重要的是，與機(jī)械損傷的影響相比，害蟲取食造成的影響要嚴(yán)重得多。然而苯丙氨酸途徑在產(chǎn)生各種中間產(chǎn)物方面起著重要作用，如反式肉桂酸、香豆酸、麥角酸和芥子酸［28］。這些酸可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸和輔酶A酯，最終導(dǎo)致木質(zhì)素和其他植物生理代謝產(chǎn)物的合成，而這與構(gòu)建病害發(fā)生的適宜環(huán)境密切相關(guān)。

根系分泌物在病原菌的生長(zhǎng)和侵害中起著至關(guān)重要的作用［29-30］。通過代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷對(duì)煙草根系分泌物的影響較小，而昆蟲取食明顯改變了煙草根系分泌物，誘導(dǎo)了271種差異代謝產(chǎn)物，包括235種上調(diào)和36種下調(diào)的化合物。此外，還鑒定出了22個(gè)誘導(dǎo)途徑，包括氨基酸、生物堿、脂質(zhì)、生物素、單萜、酚酸和黃酮類物質(zhì)的生物合成途徑。蛋白質(zhì)、可溶性糖等物質(zhì)含量的測(cè)定證實(shí)了昆蟲取食直接導(dǎo)致煙草根系分泌物的變化，這會(huì)影響植物滲透壓、根際土壤微環(huán)境，改變植物抗逆能力，同時(shí)根系分泌物作為微生物的營(yíng)養(yǎng)源之一，也會(huì)促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和移動(dòng)［31］。黃玉茜等的研究表明，花生根系分泌物濃度通過影響土壤中的碳源，達(dá)到重塑土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的作用［32］。化感試驗(yàn)表明，根系分泌物對(duì)疫霉菌具有正趨化效應(yīng)，通過吸引疫霉菌生長(zhǎng)的趨向性，增大疫霉菌接觸并侵染煙草的機(jī)會(huì)，從而提高煙草黑脛病發(fā)生的可能性。Li等研究發(fā)現(xiàn)，煙草根系分泌物中的化感自毒物質(zhì)肉桂酸、肉豆蔻酸等加快了煙草枯萎病的致病能力［29］。

綜上所述，地下害蟲咬食煙草的根莖部會(huì)通過調(diào)節(jié)煙草的防御性酶活性，誘導(dǎo)或改變煙草根系的分泌物質(zhì)，影響對(duì)疫霉菌的化感作用，導(dǎo)致黑脛病發(fā)生加重。本試驗(yàn)僅初步探究了不同處理下根系分泌物的組件差異，關(guān)于具有化感作用的化合物分析及其對(duì)土壤微生物群落的影響還需要深入探討。

4 結(jié)論

害蟲咬食區(qū)別于單一的機(jī)械損傷，它誘導(dǎo)了地下部苯丙氨酸解氨酶的高表達(dá)，調(diào)節(jié)了煙草根部的CAT、POD、SOD活性和可溶性糖、有機(jī)酸次生代謝產(chǎn)物含量。害蟲咬食的根系分泌物對(duì)疫霉菌具有正趨化作用，這也會(huì)進(jìn)一步影響病害的發(fā)生。本研究為蟲害加重病害發(fā)生途徑提供了新思路，為進(jìn)一步指導(dǎo)如何通過調(diào)控根系分泌物的改變來更好地防治煙草土傳病蟲害的發(fā)生提供了理論指導(dǎo)。

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