摘要：為研究綿羊肺源大腸桿菌cyaA基因的分子特征、抗原性及其遺傳進(jìn)化關(guān)系，采用PCR技術(shù)對綿羊肺源大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆并測序，應(yīng)用定量PCR檢測cyaA基因在不同培養(yǎng)階段的mRNA表達(dá)量，利用在線軟件對其進(jìn)行編碼蛋白分子特征、抗原性及其遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，cyaA基因全長2 547 bp，編碼848個(gè)氨基酸；cyaA基因在細(xì)菌對數(shù)期的mRNA表達(dá)量最高，其次是穩(wěn)定期及遲緩期，在衰亡期的mRNA表達(dá)量最低；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，分子式為C4 389H6 759N1 193O1 273S30，理論分子質(zhì)量為97.57 ku，理論等電點(diǎn)為5.82，為酸性親水性蛋白，穩(wěn)定性較低；二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-折疊所占比例分別為42.81%、39.03%、14.27%和3.89%。AC蛋白無信號(hào)肽與跨膜區(qū)，保守結(jié)構(gòu)域位于1～848位氨基酸，屬于腺苷酸環(huán)化酶超家族，具有14個(gè)開放閱讀框，存在81個(gè)磷酸化位點(diǎn)。AC蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢表位共16個(gè)，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區(qū)段；遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 XJ10菌株AC蛋白與志賀氏菌AC蛋白相似性最高。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究大腸桿菌AC蛋白的功能及其作為大腸桿菌疫苗候選抗原奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綿羊肺源大腸桿菌；cyaA基因；分子特征；抗原性；遺傳進(jìn)化

中圖分類號(hào)：S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）17-0058-07

收稿日期：2023-07-19

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：2021AB012、2019AB029）。

作者簡介：操義恒（1997—），男，湖北孝感人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治研究。E-mail：1050830806@qq.com。

通信作者：周 霞，博士，教授，主要從事人畜共患病致病機(jī)制與防控研究，E-mail：32123004@qq.com；黃 新，碩士，研究員，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治研究，E-mail：419824643@qq.com。

大腸桿菌（Escherichia coli，簡稱E.coli）是人獸共患條件致病的重要病原，也是適應(yīng)能力和致病能力最強(qiáng)的細(xì)菌之一，在臨床中可導(dǎo)致多種宿主發(fā)生疾病，包括牛羊肺炎、禽類氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、新生兒腦膜炎、菌血癥、敗血癥等疾?。?-4］。研究顯示，其攜帶脂多糖、毒素、黏附因子、外膜蛋白、毒力島等多種毒力因子，這些毒力因子幫助菌株定殖和入侵宿主組織細(xì)胞，更甚者對其造成損傷，此外一些毒力因子還能使菌株逃避宿主細(xì)胞吞噬作用，刺激宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［5-7］。cyaA基因是許多細(xì)菌與毒力大小密切相關(guān)的重要基因之一，其編碼的腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）在大腸桿菌關(guān)于調(diào)節(jié)毒力方面具有重要作用。AC主要作用機(jī)制是催化腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）形成環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate，cAMP），cAMP與受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）結(jié)合，形成CRP-cAMP復(fù)合體，可以調(diào)控大腸桿菌多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄［8-11］。柴迎錦通過構(gòu)建大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因缺失株，發(fā)現(xiàn)缺失株對昆明鼠的半數(shù)致死量顯著降低，黏附侵襲小鼠肺泡上皮細(xì)胞（TC-1細(xì)胞）的數(shù)量也顯著減少［12］。劉莎莎等研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌的cyaA基因缺失后菌株毒力顯著下降，黏附侵襲宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）的菌量也顯著減少［13］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)敲除cyaA基因的鼠傷寒沙門菌仍具有較好的免疫原性［14-15］。但是在大腸桿菌中cyaA基因編碼的AC蛋白的分子特征以及抗原性還不清楚。因此，本研究對綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因進(jìn)行克隆、通過軟件分析編碼蛋白分子特征和理化性質(zhì)、蛋白抗原表位和系統(tǒng)進(jìn)化，以期為進(jìn)一步探討大腸桿菌AC蛋白的功能及其作為大腸桿菌疫苗候選抗原奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

本研究于2022年12月在新疆農(nóng)墾科學(xué)院的畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)使用的大腸桿菌XJ10菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室的郭強(qiáng)強(qiáng)于2016年由呼吸衰竭死亡的綿羊肺臟中分離。DNA提取試劑盒、DL 4500 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；TRIzol試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×PCR Mix、qPCR試劑盒、pMD19-T載體，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)并根據(jù)GenBank中的大腸桿菌K-12 substr. MG1655的cyaA基因（登錄號(hào)：947755）序列為模板，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物［12］。引物信息見表1。

1.3 綿羊肺源大腸桿菌cyaA基因的克隆測序

純化單菌落在BHI營養(yǎng)肉湯中經(jīng)37 ℃恒溫箱搖床振蕩培養(yǎng)12 h，收集菌液離心后用沉淀提取細(xì)菌DNA。以提取的DNA為模板，利用cyaA引物通過PCR擴(kuò)增cyaA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠驗(yàn)證為陽性條帶后，通過試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過菌液PCR進(jìn)一步篩選，將陽性菌株送至通用生物（安徽）股份有限公司測序，測序結(jié)果輸入GenBank中進(jìn)行比對。

1.4 綿羊肺源大腸桿菌在不同生長時(shí)間cyaA基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測

吸取200 μL “1.3”節(jié)中過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入20 mL BHI液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于2 h（遲緩期）、5 h（對數(shù)期）、10 h（穩(wěn)定期）、24 h（衰亡期）吸取2 mL菌液，經(jīng)TRIzol法提取大腸桿菌XJ10 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用cyaA-in引物通過熒光定量PCR檢測菌株cyaA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。使用16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用相對比較ΔCT（Qr=2-ΔΔCT）法計(jì)算cyaA基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 腺苷酸環(huán)化酶分子特征及理化性質(zhì)分析

使用表2中的相關(guān)網(wǎng)頁對大腸桿菌AC蛋白的分子特征和理化性質(zhì)、親疏水性、二三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域和開放閱讀框的位置、磷酸化位點(diǎn)、抗原性進(jìn)行分析。

1.6 AC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

將大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因推導(dǎo)的AC氨基酸序列與GenBank中已知的10多株不同細(xì)菌的AC氨基酸序列進(jìn)行比對。利用Mega 7.0軟件根據(jù)NJ（neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap 值為1 000）。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyaA基因的擴(kuò)增、克隆及測序結(jié)果

由圖1可知，綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約2 547 bp，與預(yù)期片段大小相符，測序結(jié)果和大腸桿菌K-12 substr. MG1655菌株的cyaA基因相似性為100%。

2.2 綿羊肺源大腸桿菌在不同生長時(shí)期cyaA基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

由圖2可知，綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因的轉(zhuǎn)錄水平在對數(shù)期的表達(dá)量最高，其與遲緩期、衰亡期的表達(dá)量差異在0.001水平上顯著，與穩(wěn)定期的表達(dá)量差異顯著（P<0.05）；其次是穩(wěn)定期，其與衰亡期的差異極顯著（P<0.01），再其次是遲緩期，在衰亡期的表達(dá)量最低。

2.3 腺苷酸環(huán)化酶理化性質(zhì)分析

綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因全長 2 547 bp，編碼848個(gè)氨基酸，利用ProtParam分析大腸桿菌AC蛋白，結(jié)果顯示，大腸桿菌XJ10 的AC蛋白分子式為C4 389H6 759N1 193O1 273S30，總原子數(shù)為13 644，理論分子質(zhì)量為97.57 ku，理論等電點(diǎn)5.82，為酸性蛋白，不穩(wěn)定性指數(shù)為45.12，屬于不穩(wěn)定蛋白。由表3可知，該蛋白由20種氨基酸組成，出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基有Leu（12.4%）、Ser（7.4%）、Glu（7.1%）、Val（6.7%）和Arg（6.6%），出現(xiàn)頻率較低的氨基酸殘基有Trp（1.9%）、Met（1.8%）和Cys（1.8%），不含Pyl和Sec?？偸杷云骄担℅RAVY）是-0.290，屬于親水性蛋白，通過ProtScale在線工具進(jìn)一步預(yù)測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌XJ10的AC蛋白親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，為親水性蛋白，與其預(yù)測結(jié)果一致（圖3）。

2.4 腺苷酸環(huán)化酶蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA預(yù)測大腸桿菌XJ10 AC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）表明，大腸桿菌XJ10的AC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（42.81%）、β-折疊（3.89%）、延伸鏈（14.27%）和無規(guī)則卷曲（39.03%）組成。通過SWISS-MODEL預(yù)測大腸桿菌XJ10 AC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖5）表明，該蛋白序列與PDB數(shù)據(jù)庫中多功能毒力效應(yīng)蛋白相似性最高為11.32%，該蛋白主要由α-螺旋所形成的三維立體結(jié)構(gòu)組成。

2.5 腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)肽、跨膜區(qū)及保守結(jié)構(gòu)域分析

TMHMM預(yù)測大腸桿菌XJ10 AC蛋白跨膜區(qū)，由圖6-A可知，大腸桿菌XJ10 AC蛋白的序列無跨膜區(qū)域。通過SignaIP軟件分析大腸桿菌XJ10 AC蛋白信號(hào)肽，由圖6-B可知，大腸桿菌XJ10 AC蛋白無信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。NCBI分析大腸桿菌XJ10 AC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和開放閱讀框的位置，由圖6-C、圖6-D可知，其保守結(jié)構(gòu)域位于1～848位氨基酸，屬于腺苷酸環(huán)化酶超家族，具有14個(gè)開放閱讀框。

2.6 腺苷酸環(huán)化酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化是常見的翻譯后修飾，可以很好地調(diào)控蛋白質(zhì)的活性，在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。由圖7可知，NetPhos預(yù)測大腸桿菌XJ10 AC蛋白存在81個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，分別為55個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，20個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

2.7 腺苷酸環(huán)化酶抗原性預(yù)測分析

利用ABCpred和IEDB對大腸桿菌XJ10 AC蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，得到B細(xì)胞表位序列，取其共有多肽序列，最終預(yù)測大腸桿菌XJ10 AC蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢表位16個(gè)，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區(qū)段（表4）。

2.8 腺苷酸環(huán)化酶遺傳進(jìn)化分析

將大腸桿菌XJ10 cyaA基因序列推導(dǎo)的AC蛋白氨基酸序列與GenBank中已知的19多株不同種屬的腺苷酸環(huán)化酶序列進(jìn)行比對分析，由圖8可知，大腸桿菌XJ10株的腺苷酸環(huán)化酶與志賀氏菌腺苷酸環(huán)化酶相似性最高，其次與鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌等相似性較高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處在一個(gè)分支。

3 討論與結(jié)論

AC最早是在大腸桿菌代謝相關(guān)的阻遏過程中發(fā)現(xiàn)，屬于膜整合蛋白，主要分布在細(xì)胞的各類膜上，包括細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。AC的氨基和羧基端朝向細(xì)胞質(zhì)，膜胞質(zhì)面有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和2個(gè)膜整合區(qū)，是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白［12，16］。細(xì)菌中的cAMP結(jié)合CRP后，CRP中的C螺旋和鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而激活CRP家族的轉(zhuǎn)錄因子，cAMP-CRP復(fù)合體結(jié)合靶啟動(dòng)子上的特異序列，使DNA結(jié)構(gòu)變化彎曲，促使RNA聚合酶激活轉(zhuǎn)錄。此外，CRP作為一種全局調(diào)節(jié)因子，與cAMP結(jié)合活化后，可將某些質(zhì)粒和毒力島整合到現(xiàn)有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，調(diào)控細(xì)菌相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)菌的致病力。有研究發(fā)現(xiàn)，在鼠疫耶爾森氏菌中，CRP直接激活纖溶酶原激活劑的表達(dá)，促進(jìn)跳蚤叮咬后的鼠疫傳播，cAMP-CRP還能調(diào)節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)分泌，幫助細(xì)菌更易進(jìn)入宿主細(xì)胞，造成宿主感染［17-18］。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)與相關(guān)在線軟件的應(yīng)用與發(fā)展，使本研究可更加直觀和全面地分析蛋白結(jié)構(gòu)及其特征，簡單快捷地對各類蛋白進(jìn)行鑒定，從而快速地表達(dá)純化蛋白，為研制開放新疫苗奠定基礎(chǔ)。本研究利用生物信息學(xué)在線軟件對大腸桿AC蛋白的分子特征和理化性質(zhì)、親疏水性、二三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域和開放閱讀框的位置、磷酸化位點(diǎn)、抗原性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大腸桿菌XJ10的AC是不穩(wěn)定的親水性蛋白，不易與水分子形成氫鍵；二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲的含量占比39.03%，利于嵌合抗體，具有很好的抗原潛力；無信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)域表明AC蛋白可高效表達(dá)；蛋白保守結(jié)構(gòu)域位于1～848位氨基酸，并且在不同種屬細(xì)菌內(nèi)相對保守；存在81個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，可能參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及相關(guān)蛋白定位。

有研究發(fā)現(xiàn)，在我國4家百日咳疫苗生產(chǎn)廠中，有2個(gè)廠家產(chǎn)品含有較高含量的AC，并且AC更多地存在于菌體內(nèi)而不是可溶性表達(dá)于培養(yǎng)液上清中［19］。百日咳桿菌的AC保護(hù)性免疫原性依賴于CyaC對983位賴氨酸的修飾，通過修飾影響蛋白分子構(gòu)象，從而暴露出免疫優(yōu)勢表位［20］。通過在AC的N-末端插入二肽，獲得無或低AC活性的AC，當(dāng)修飾后的AC與無細(xì)胞百日咳疫苗共同免疫小鼠時(shí)，可提高無細(xì)胞百日咳疫苗的免疫原性，影響輔助性T淋巴細(xì)胞的分化，協(xié)助宿主清除肺部定殖的百日咳桿菌［21］。本研究利用生物信息學(xué)在線軟件ABCpred和IEDB對大腸桿菌XJ10 AC抗原表位進(jìn)行預(yù)測，對兩者預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析，共得到16個(gè)具有優(yōu)勢的抗原表位區(qū)域，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區(qū)段。以上結(jié)果可為大腸桿菌亞單位疫苗的研制提供參考依據(jù)。

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