摘要：黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種重要的園藝蔬菜作物，具有重要的食用和經(jīng)濟(jì)價值，然而病毒病嚴(yán)重影響我國黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，我國科研人員對不同地區(qū)黃瓜病毒病的流行情況開展了廣泛深入的研究，本文梳理整合了前人的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在全國范圍內(nèi)采集的黃瓜樣品中檢出的病毒達(dá)到20種之多，涉及10個科、11個屬，其中以馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒數(shù)量最多，達(dá)到了7種，并且除TYLCV為DNA病毒以外，其余均為RNA病毒，說明RNA病毒導(dǎo)致的黃瓜病毒病在我國占據(jù)絕對主導(dǎo)地位，其中又以Potyvirus病毒對我國黃瓜的侵染最為廣泛，是威脅黃瓜生產(chǎn)的最大病毒種群。進(jìn)一步，通過分析病毒種類的地理分布，說明在全國范圍內(nèi)須加強(qiáng)對CMV、CCYV、CGMMV以及Potyvirus中PRSV和WMV的防治工作和抗病育種研究；其中，黃淮海流域和長江流域應(yīng)重點(diǎn)針對CMV以及Potyvirus中的WMV和ZYMV；此外，江蘇、甘肅、重慶、海南的黃瓜病毒病較為嚴(yán)重，各地區(qū)應(yīng)予以重視。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新興的小RNA深度測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病毒的鑒定當(dāng)中，打破了傳統(tǒng)方法只能檢測已知病毒的局限性，未來將會成為一種常規(guī)高效的病毒檢測手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：黃瓜；病毒；分布；檢測

中圖分類號：S436.421.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0020-07

收稿日期：2023-09-20

基金項目：北京市教育委員會科技計劃（編號：KM202212448003、KM202312448004）；北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院院級項目（編號：XY-YF-22-02、XY-KJ-22-07）；國家自然科學(xué)基金（編號：32001571）。

作者簡介：高 樂（1987—），男，河北石家莊人，博士，副教授，從事植物抗病毒基因工程研究。E-mail：gaole@bvca.edu.cn。

通信作者：鄭志勇，碩士，教授，主要從事園藝植物栽培研究，E-mail：zhengzhiyong@bvca.edu.cn；任俊達(dá)，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)研究，E-mail：renjd@bua.edu.cn。

黃瓜（Cucumis sativus）別稱胡瓜、青瓜，為葫蘆科（Cucurbitaceae）一年生蔓生或攀緣草本植物，是一種重要的園藝蔬菜作物［1］。黃瓜是我國主要的保護(hù)地栽培和大面積栽培的蔬菜種類，在各地區(qū)蔬菜供baa2462cf96d0e395f0c1757f63df1b8應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，具有重要的食用和經(jīng)濟(jì)價值［2］。近年來，由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的變化和耕作模式的改變，黃瓜病毒病呈現(xiàn)出多發(fā)的態(tài)勢，對黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，威脅著我國黃瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。黃瓜感染病毒以后，初期心葉出現(xiàn)明脈現(xiàn)象，之后逐漸產(chǎn)生花葉、重花葉、皺縮、卷曲等癥狀，最終導(dǎo)致果實(shí)凹凸不平、螺旋狀扭曲、果肉僵硬、苦澀等［3］。近年來，我國科研人員對不同地區(qū)黃瓜病毒病的流行情況開展了廣泛深入的研究，取得了大量的進(jìn)展。本文梳理整合了前人的研究結(jié)果，綜合概述了侵染我國黃瓜的病毒種類、地理分布、優(yōu)勢毒源及其檢測方法，以期為我國黃瓜病毒病的防治工作和抗病育種研究提供參考。

1 侵染病毒的種類

近年來的研究表明，在全國范圍內(nèi)采集的黃瓜樣品中檢出的病毒達(dá)到20種之多（表1）［4］，包括馬鈴薯X病毒（PVX）、黃瓜花葉病毒（CMV）、甜瓜黃斑病毒（MYSV）、番茄斑萎病毒（TSWV）、瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、蠶豆萎蔫病毒2號（BBWV2）、葫蘆內(nèi)源RNA病毒（LsEV）、番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、南瓜蚜傳黃化病毒（CABYV）、甜瓜蚜傳黃化病毒（MABYV）、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）、花生條紋病毒（PStV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、蕪菁花葉病毒（TuMV）、西瓜花葉病毒（WMV）、西葫蘆虎紋花葉病毒（ZTMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、煙草花葉病毒（TMV）。

上述20種病毒歸屬為10個科、11個屬（表2和圖1）：包括甲型線形病毒科（Alphaflexiviridae）馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）的PVX［5］；雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的CMV［6］；布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的MYSV［7］和TSWV［8］；長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）的CCYV［9］；豇豆花葉病毒科（Comoviridae）豇豆花葉病毒屬（Comovirus）的SqMV［10］和蠶豆病毒屬（Fabavirus）的BBWV2［11］；內(nèi)源RNA病毒科（Endornaviridae）內(nèi)源RNA病毒屬（Endornavirus）的LsEV［12］；雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的TYLCV［13］；黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus）的CABYV［14］和MABYV［15］；馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的PRSV、PStV、PVY、TuMV、WMV、ZTMV、ZYMV［16-22］；帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的CGMMV［23］和TMV［24］。由此可見，在檢出的20種病毒當(dāng)中，幾乎所有的科屬僅包含其中的1～2種，而Potyvirus病毒數(shù)量明顯高于其他科屬，達(dá)到了7種（表2和圖1）。此外，檢出的病毒幾乎均為RNA病毒，僅TYLCV為DNA病毒（表2）。

2 侵染病毒的地理分布

2.1 松遼流域

松遼流域地跨黑龍江、吉林、遼寧3省的全部，以及內(nèi)蒙古和河北省的一部分，該流域的遼寧省在黃瓜上檢出病毒1種［25］，為CMV（表3、圖2至圖4）。

2.2 黃淮海流域

黃淮海流域地跨北京、天津、山東3?。ㄊ校┑娜?，河北和河南2省的大部分，以及江蘇和安徽2省的淮北地區(qū)，是我國重要的蔬菜生產(chǎn)基地。該流域在黃瓜上共檢出病毒8種，包括CABYV、CCYV、CGMMV、CMV、PRSV、TMV、WMV、ZYMV［26-33］（表3和圖2至圖4），其中北京市檢出病毒3種，分別為CMV、WMV、ZYMV；天津市檢出病毒3種，分別為CMV、TMV、WMV；山東省檢出病毒4種，分別為CMV、PRSV、WMV、ZYMV；江蘇省北部地區(qū)檢出病毒8種，分別為CABYV、CCYV、CGMMV、CMV、PRSV、TMV、WMV、ZYMV。進(jìn)一步可以看出，在北京、山東、江蘇北部均檢出了CMV、WMV、ZYMV（表3和圖4），由此可見，在黃淮海流域侵染黃瓜的優(yōu)勢毒源為CMV、WMV、ZYMV。

2.3 長江流域

長江流域地跨川、甘、鄂、青、藏、滇、渝、湘、贛、皖、蘇、滬等地，同時涵蓋部分云貴高原，包括渝東西、渝東北、鄂西、湘西、云南、貴州等地區(qū)，是我國重要的蔬菜種植區(qū)［29］。該流域在黃瓜上共檢出病毒9種，包括CABYV、CCYV、CGMMV、CMV、PRSV、SqMV、TuMV、WMV、ZYMV（表3和圖2至圖4），其中甘肅省檢出病毒5種［30］，分別為CMV、PRSV、SqMV、WMV、ZYMV；重慶市檢出病毒5種［31］，分別為CMV、SqMV、TuMV、WMV、ZYMV； 湖北省檢出病毒1種［32］，為CMV；江蘇省南部地區(qū)檢出病毒7種［28］，分別為CABYV、CCYV、CGMMV、CMV、PRSV、WMV、ZYMV。進(jìn)一步可以看出，在甘肅、重慶、江蘇南部均檢出了CMV、WMV、ZYMV（表3和圖4），由此可見，在長江流域侵染黃瓜的優(yōu)勢毒源同黃淮海流域一致，為CMV、WMV、ZYMV。

2.4 珠江流域

珠江流域地跨滇、黔、桂、粵、湘、贛等地區(qū)，該流域的廣東省在黃瓜上檢出病毒3種［26］，分別為CMV、PRSV、WMV（表3和圖2至圖4）。

2.5 其他

黃瓜是海南省冬季種植的重要蔬菜作物，主要生產(chǎn)區(qū)域包括三亞、澄邁、萬寧等市（縣），共檢出病毒5種［33］，分別為CCYV、CGMMV、CMV、MYSV、TMV（表3和圖2至圖4）。

3 侵染病毒的檢測方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附分析

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）又稱為免疫學(xué)測定或血清學(xué)測定，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測當(dāng)中［34］。該項技術(shù)的原理是借助化學(xué)方法使酶與抗體結(jié)合形成酶標(biāo)抗體，進(jìn)而與相應(yīng)的抗原底物特異性結(jié)合發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在酶的催化作用下顯色，生成的有色化合物的量與病原物的含量成正比，反應(yīng)液在 405 nm 波長下有吸收峰值（D405 nm），可通過酶標(biāo)儀測定D405 nm，從而對病毒進(jìn)行定性和定量分析［35］。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，ELISA也在不斷地向更快捷、更方便、更高效的方向優(yōu)化，但仍存在一些局限性［36］：（1）ELISA主要利用病毒外殼蛋白的抗原性來進(jìn)行檢測分析，因此無法檢測缺乏外殼蛋白的病毒；（2）陽性與陰性樣品的區(qū)分受到季節(jié)性不確定問題的影響；（3）檢測周期受到病毒在植株體內(nèi)分布不均勻以及病毒分離物多樣性的限制；（4）病毒的檢出率受到病毒間血清學(xué)關(guān)系遠(yuǎn)近的影響。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是通過檢測病毒的特異性核苷酸序列來確定病毒的種類，由于該項技術(shù)是在DNA/RNA水平上對病毒進(jìn)行鑒定，因此靈敏度極高，病毒滴度可以低至pg級甚至fg級，也是純化病毒基因片段的必備手段［36］。該項技術(shù)的原理是根據(jù)病毒的核苷酸序列信息設(shè)計特異性引物，提取病毒基因組之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳對目標(biāo)基因條帶進(jìn)行純化回收，將純化的基因片段連接至克隆載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，最后通過測序及序列比對分析鑒定病毒的種類。對于DNA病毒而言，可以直接通過PCR技術(shù)進(jìn)行快速體外擴(kuò)增；對于RNA病毒而言，可以通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的方法進(jìn)行病毒檢測，即先將病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)［36］。PCR技術(shù)兼具成本低廉、重復(fù)性好、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，但試驗結(jié)果容易被近緣病毒干擾。

3.3 小RNA深度測序

小RNA深度測序61aafa59f47244a23c665e500232e979（SRDS）是一種新興的病毒檢測技術(shù)，可以不依賴于病毒的核苷酸序列信息，具有靈敏度高、效率高、數(shù)據(jù)處理簡便、能夠探索未知病毒等優(yōu)點(diǎn)［37-39］。該項技術(shù)基于寄主對病毒的RNA干擾原理，即病毒在植物體內(nèi)復(fù)制的過程中，會產(chǎn)生小的雙鏈RNA（dsRNA），寄主通過Dicer-like酶識別dsRNA并加工生成許多小的干擾RNA（siRNA），siRNA能夠識別、結(jié)合與其序列互補(bǔ)的病毒并對其進(jìn)行切割，從而導(dǎo)致病毒的降解［38］。因此，提取發(fā)病植株樣本的總RNA并構(gòu)建RNA文庫，利用SRDS技術(shù)進(jìn)行測序，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，能夠檢出與侵染病毒序列高度一致的小RNA片段，并完成病毒RNA序列的組裝、比對、分析等，從而最終確定侵染的病毒種類［37-38］。

4 展望

黃瓜是我國廣泛栽培種植的重要園藝蔬菜作物，病毒病給黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來嚴(yán)重危害，明確黃瓜病毒病的流行情況，鑒定侵染的病毒種類、地理分布以及優(yōu)勢毒源，對我國黃瓜病毒病的防治工作和抗病育種研究具有重要意義。前人的研究表明，在全國范圍內(nèi)采集的黃瓜樣品中檢出的病毒達(dá)到20種之多（表1），涉及10個科、11個屬（表2和圖1），包括Begomovirus（TYLCV）、Comovirus（SqMV）、Crinivirus（CCYV）、Cucumovirus（CMV）、Endornavirus（LsEV）、Fabavirus（BBWV2）、Polerovirus（CABYV和MABYV）、Potexvirus（PVX）、Potyvirus（PRSV、PStV、PVY、TuMV、WMV、ZTMV、ZYMV）、Tobamovirus（CGMMV和TMV）、Tospovirus（MYSV和TSWV）。進(jìn)一步可以看出，在檢出的所有病毒當(dāng)中，除TYLCV為DNA病毒以外，其余均為RNA病毒，并且以Potyvirus病毒數(shù)量最多，達(dá)到了7種，明顯高于其他科屬（表2和圖1），說明RNA病毒引致的黃瓜病毒病在我國占據(jù)絕對主導(dǎo)地位，其中又以Potyvirus病毒對我國黃瓜的侵染最為廣泛，是威脅黃瓜生產(chǎn)的最大病毒種群。因此，我國黃瓜病毒病的防治工作和抗病育種研究應(yīng)重點(diǎn)面向RNA病毒類型，尤其要針對其中的Potyvirus病毒。

就病毒分布而言，CMV分布最為廣泛，存在于所有5個流域，其次為CCYV、CGMMV、PRSV、WMV，均分布于3個流域（表3和圖3），可見危害我國黃瓜生產(chǎn)的優(yōu)勢毒源為CMV、CCYV、CGMMV、PRSV、WMV；就流域而言，黃淮海流域和長江流域檢出的病毒種類最多、多樣性最高，分別達(dá)到了8種和9種（表3和圖2），并且在這2個流域中的絕大部分地區(qū)均檢出了CMV、WMV、ZYMV（表3和圖4），說明該2個流域的優(yōu)勢毒源均為CMV、WMV、ZYMV；就具體地區(qū)而言，江蘇檢出的病毒種類最多，達(dá)到了8種，其次為甘肅、重慶、海南，均為5種（表3和圖4）。綜上所述，通過分析侵染我國黃瓜病毒種類的地理分布可知，在我國范圍內(nèi)須加強(qiáng)對CMV、CCYV、CGMMV以及Potyvirus中PRSV和WMV的防治工作和抗病育種研究；其中，黃淮海流域和長江流域應(yīng)重點(diǎn)針對CMV以及Potyvirus中的WMV和ZYMV加強(qiáng)病毒病的防控；此外，我國江蘇、甘肅、重慶、海南的黃瓜病毒病較為嚴(yán)重，各地區(qū)應(yīng)予以重視。需要注意的是，我國大部分地區(qū)的黃瓜都存在2種或2種以上病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，甚至存在7種病毒同時侵染的現(xiàn)象［40］。病毒復(fù)合侵染不僅能加重對寄主的危害，還可能發(fā)生病毒重組導(dǎo)致新病毒株系的出現(xiàn)，從而給黃瓜生產(chǎn)帶來更大的威脅［41］。此外，種植區(qū)域內(nèi)的雜草也可能成為病毒的中間寄主，促進(jìn)病毒的擴(kuò)散傳播［31］。因此，在黃瓜病毒病的防治工作和抗病育種研究中，要兼顧多種重要的病毒種類，并且及時清理潛在的中間寄主。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，病毒的檢測方法日益豐富，包括ELISA、PCR、SRDS等，其中新興的SRDS技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病毒的鑒定當(dāng)中［42］。相較于ELISA和PCR等傳統(tǒng)的病毒檢測手段，SRDS不需要富集病毒，不依賴于已知病毒的基因組序列信息，具有更高的靈敏度，數(shù)據(jù)處理更加便捷，能夠在發(fā)病植株的混合樣品中對已知和未知病毒的RNA序列進(jìn)行全面掃描，尤其是適合于發(fā)現(xiàn)新病毒，打破了傳統(tǒng)方法只能檢測已知病毒的局限性。然而，該項技術(shù)在一定程度上會受到病毒含量以及小RNA長度的影響，從而導(dǎo)致誤判，因此運(yùn)用ELISA和PCR進(jìn)行相互驗證，將此3種檢測技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，可以彌補(bǔ)各自的不足，從而最大限度地保證試驗的準(zhǔn)確性和全面性。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展、成本不斷降低，SRDS將會成為一種常規(guī)高效的病毒檢測手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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